Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Resumen

Kindlins son fundamentales para la adhesión celular a través de las integrinas, pero los estudios de ellos se han visto obstaculizados por la dificultad para expresarlos de forma recombinante en huéspedes bacterianos. Se describen aquí métodos para su producción eficiente en células de insecto infectadas con baculovirus.

Resumen

Kindlins son coactivadores esenciales, con la talina, de los receptores de integrinas de la superficie celular y también participan en la integrina exterior-en la señalización, y el control de la transcripción de genes en el núcleo de la célula. Los kindlins son ~ 75 kDa proteínas multidominio y se unen a un motivo NPxY y aguas arriba T / S racimo de la cola citoplasmática de la integrina β-subunidad. La isoforma kindlin hematopoyéticamente-importante, kindlin-3, es crítico para la agregación de plaquetas durante la formación de trombos, leucocitos rodando en respuesta a la infección y la inflamación y la formación de osteoclastos de podocitos en la resorción ósea. El papel de kindlin-3 en estos procesos ha dado lugar a extensos estudios celulares y fisiológicos. Sin embargo, hay una necesidad de un método eficiente de la adquisición de cantidades de miligramos de alta calidad de la proteína para estudios posteriores. Hemos desarrollado un protocolo, aquí descrito, para la expresión y purificación eficientes de kindlin-3 murina recombinante por uso de un baculovirus-dsistema de expresión dividido en células Sf9 que producen cantidades suficientes de alta pureza proteína de longitud completa para permitir su caracterización biofísica. El mismo enfoque podría ser tomada en el estudio de las otras isoformas kindlin de mamíferos.

Introducción

Las proteínas de la familia kindlin son un componente crucial de la asamblea de adhesión focal, y por lo tanto esencial para la vida compleja. Kindlins, de los cuales hay 3 isoformas en mamíferos (kindlin-1, kindlin-2, y kindlin-3), se consideran los coactivadores de receptores de integrinas extracelulares junto a talina ^1. La adhesión celular mediada por la integrina se conecta la superficie de la célula a la matriz extracelular (ECM) en eucariotas superiores. Se trata de un proceso crítico y común en una gran cantidad de fenómenos fisiológicos, que incluyen la integridad del tejido, la embriogénesis, el metabolismo óseo, la hemostasia, y la inmunidad. La adhesión celular mediada por la integrina se activa a través de adentro hacia fuera la transducción de señales a través de la unión de Talin y kindlin a las integrinas β subunidad colas citoplasmáticas (CTS) en sus motivos NPxY conservadas. La importancia biomédica de proteínas kindlin se extiende sin embargo tan lejos como el núcleo, donde kindlin-2 se ha demostrado en varios informes recientes de participar en la transcripciónAl controlar ^2,3.

Kindlins son proteínas multidominio de aproximadamente 75 kDa, contrastados por la posesión de un FERM bipartito C-terminal (4,1 banda, ezrina, radixina, moesina) de dominio, que está interrumpido por una homología pleckstrin (PH) de dominio en el centro de su subdominio F2 ^4,5. Estudios de los dominios kindlin-2 y kindlin-3 PH mostraron que se une a la segunda mensajeros de lípidos fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato y fosfatidilinositol-(4,5)-bisfosfato ^6-8. Sin embargo, los estudios de la kindlin dominio PH-1 muestran que se une a PtdIns (3,4,5) P ₃ con una afinidad mucho más baja, lo que se explica en kindlin-1 por un puente de sal-isoforma específica la prevención de los lípidos de la unión ^9. Además, hay un bucle de ~ 100 aminoácidos insertado en el dominio F1 de los kindlins que se prevé que sea desplegado pero se une a la fosfatidilserina en la hoja interna de la membrana plasmática ^10,11. La FERM kindlindominio se considera homóloga a la de dominio FERM talina, aunque el dominio FERM talina no posee un dominio de homología pleckstrin. Ambos kindlins y Talin interactúan con motivos NPXY en la integrina β-colas a través de la región F3 de su dominio FERM, pero kindlin une a la membrana motivo distal, mientras que la talina se dirige a la membrana proximal uno ^12-16. Kindlins y Talin tanto, además poseen un dominio F0 N-terminal con un pliegue tipo ubiquitina que no se encuentra en otras proteínas FERM ^11,17. Estudios sobre el dominio F0 de kindlin-2 han demostrado que se une de forma independiente a fosfatidilinositol-(4,5)-bisfosfato membranas enriquecidas ^17.

Los kindlins exhiben patrones de expresión tejido-específica paralogue y funciones fisiológicas no redundantes. Kindlin-1 se expresa principalmente en la epidermis, pero también, en menor medida los de colon, el estómago y los riñones; kindlin-2 se expresa de forma ubicua, pero se concentra en estriado y lisomuscular y es la única kindlin expresado en el desarrollo embrionario ^4, y se expresa kindlin-3 en los tejidos hematopoyéticos con la mayor concentración de kindlin-3 encontrado en megacariocitos ^18. Sin embargo, estudios más recientes han sugerido que la proteína funcional se expresa en los tejidos endoteliales, así ^19.

Kindlin-3 es de interés médico agudo debido a su importante papel fisiológico en la sangre. Es fundamental para la agregación plaquetaria y la difusión durante la formación del trombo ^20, leucocitos de rodadura en respuesta a la infección y la inflamación y la formación de los podocitos ^21,22 osteoclastos en la resorción ósea ^23. Además, el agotamiento de kindlin-3 en los seres humanos conduce a la deficiencia de adhesión leucocitaria de tipo III - una enfermedad caracterizada por trastornos de la coagulación que amenazan la vida y las infecciones bacterianas recurrentes ^20,24,25. Estudios de knock-out kindlin-3 en ratones revelaron la función crucial de la proteína enadhesión celular KIND3 ^{-. / -} ratones muestran fenotipos distintos, como sangrado grave debido a las integrinas inactivas plaquetas, osteopetrosis severa, y la adhesión de leucocitos deteriorada ^20,22, asemejándose síntomas en los seres humanos que carecen de kindlin-3.

De alta resolución de datos estructurales sobre los kindlins, hasta la fecha, se ha restringido a los subdominios individuales, tales como la homología pleckstrin (PH) de dominio de kindlin-1 ⁹ y kindlin-2 ^26,27 y el dominio de kindlin F0-1 ¹¹ y kindlin -2 ^17. La mayoría de los subdominios de cada polipéptido kindlin sin embargo se han resistido a la clonación y análisis estructural (Yates y Gilbert, observaciones no publicadas), y los estudios de las proteínas de larga duración han sido obstaculizados por la dificultad de expresar y purificar cantidades suficientes utilizando E. coli (observaciones no publicadas y Harburger et al. ^14). Existe un considerable interés médico en kindlin-3 y su funciones, junto a los otros dos miembros de la familia, y recientemente hemos generado cantidades de miligramos de la misma mediante la expresión recombinante en células de Spodoptera frugiperda impulsados ​​por la infección de baculovirus ^12. Por lo tanto, aquí se describen los métodos para la producción de cantidades de miligramos de ratón recombinante kindlin-3 en cultivo celular de insecto, adecuados para amplios estudios estructurales y análisis bioquímico.

En este protocolo se hace uso de un bácmido nocaut ingeniería (BAC10 _{KO: 1629)} que es, por sí sola, no puede producir viriones viables ^28. El ADN viral se lo tanto rescatado por recombinación con un vector de transferencia que, en este caso también incluye el gen kindlin-3 (FERMT3) y los resultados en el gen FERMT3 reemplazando el virus gen muy tarde, que está altamente expresado pero redundante, lo que resulta en un recombinante virus que expresa ratón kindlin-3 como parte del ciclo de vida del virus ^28. Identificamos estamétodo para la producción de kindlin-3 después de los intentos para expresar y purificar en otros huéspedes de expresión demostraron prohibitivamente difícil (observaciones no publicadas), sino también debido a la versatilidad de la suite vector de pOPIN, que se utilizó para la clonación y que podemos desplegado en muchas expresión alberga ^29.

Protocolo

Este protocolo asume que el ratón kindlin-3 gen (FERMT3) ha sido clonado con éxito en un vector de aguas abajo del promotor p10 muy tarde y que el vector posee secuencias flanqueantes de baculovirus para permitir la recombinación con el bácmido BAC10 _{KO: 1629} desarrollado por IM Jones y colegas ^28. Para este protocolo, el gen kindlin-3 fue clonado en pOPINE ²⁹ y los cebadores y estrategia de clonación utilizados se puede encontrar descrito en otra parte ^12. El plásmido está diseñado de modo que el gen FERMT3 (kindlin-3) está bajo el control del promotor de baculovirus p10 y el vector contiene 5 'UTR/ORF603 y ORF 1629 y codifica una C-terminal _6-Su etiqueta para la purificación de aguas abajo ^29.

1. Insectos cultivo celular y Mantenimiento

1. Antes de la amplificación de baculovirus recombinante, las células de Spodoptera frugiperda adaptado a cultivo en suspensión (células Sf9) debenser cultivado y mantenido. Las células de insecto siempre deben manipularse utilizando técnicas asépticas en un cultivo de tejidos campana de humos dedicado.
2. Los cultivos en suspensión de células de insecto se incuban en Sf-900 II (SFM) medio líquido libre de suero suplementado con penicilina 100 mg / ml y 100 g / ml de estreptomicina en matraces a 27 ° C con agitación a 100 rpm.
3. Mantener el rango de densidad de cultivo de células de insecto entre 1 × 10 ⁶ - 1 x 10 ⁷ células / ml por dividir y diluir el cultivo celular con frescos Sf-900 II medios de comunicación.
   Nota: saludable Las células deben vean uniformes en tamaño y deben ser de forma esférica.
4. Contar las células en un volumen de muestra usando un hemocitómetro y microscopía de luz para calcular la densidad de células de cultivo.

2. Generación de baculovirus recombinante

1. Cultura y mantener las células Sf9 en suspensión usando Sf-900 II medios suplementados con 100 g / ml penicilliN y 100 mg / ml de estreptomicina. Para la generación de baculovirus, células de insectos deben cultivarse a un intervalo de densidad de 5 × 10 ⁵ - 1 x 10 ⁶ células / ml.
2. Semilla de aproximadamente 1 x 10 ⁶ células Sf9 por pocillo de una placa de cultivo estéril de 6 pocillos tejido en 2 ml de Sf-900 II medios suplementados con penicilina 100 mg / ml y 100 mg / ml de estreptomicina. Agregar las células Sf9 a temperatura ambiente en la campana de humos a adherirse a la base de los pocillos de plástico y por lo tanto formar una monocapa.
3. Realizar la generación de baculovirus recombinante mediante cotransfección de ADN bácmido y ADN plásmido en cultivo en monocapa.
   1. Para cada transfección, mezclar 1-2 g de purificado pOPINE-mFERMT3, que posee los elementos ORF1629 de baculovirus, con 0,5 g de purificado BAC10 _{KO: 1629} en 100 l de Sf-900 II SFM sin ​​antibióticos (solución A).
   2. En un tubo separado, diluir 6 l de Cellfectin II Reactivo con 100 l de Sf-900 II SFM sin luchaantibióticos para cada reacción de transfección (Solución B). Una "mezcla maestra" se puede crear aquí, por reducida manejo de líquidos, si se necesitan muchos transfecciones.
   3. Mezclar las dos soluciones (A y B, de aproximadamente 200 l) y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar un complejo de ADN-lípido.
   4. Diluir los lípidos complejos de ADN con 800 l Sf-900 II SFM sin antibióticos. Aspirar cuidadosamente los medios de comunicación en monocapa de células Sf9 y cuidadoso pipeteado la solución A / B y los medios de comunicación en la parte superior de la monocapa Sf9.
   5. Se incuban las células transfectadas en un incubador humidificado a 27 ° CO / N y agregar de nuevo 1 ml de Sf-900 II SFM sin antibióticos a cada cultivo en monocapa al día siguiente. Se incuban las células a 27 º C durante otros 5 días.
4. Se recoge el baculovirus recombinante directamente desde el medio de cultivo (aproximadamente 2 ml en total) y transferir a un tubo de centrífuga limpio (por ejemplo, un tubo Falcon de 15 ml).
   1. Aclarar cualquier debr células Sf9es por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a TA. Transferir el virus, que es en el sobrenadante resultante y se denominó P1, a un tubo limpio y se almacena a 4 ° C en la oscuridad hasta su uso. En esta etapa la monocapa de Sf9 restante se puede utilizar para evaluar la generación de virus recombinante mediante la evaluación de la presencia de kindlin-3 recombinante en las células de insecto.
5. Resuspender la monocapa con 0,5 ml de PBS y se diluye una muestra de 10 l con volúmenes iguales de 2x tampón de carga de SDS-PAGE. Calentar las muestras a> 95 ° C durante al menos 10 min.
   1. Sonicar la muestra durante 1 seg a 10% de la amplitud usando una punta de micro-sonicador si es demasiado viscosa para la carga de gel adecuado.

3. La amplificación del baculovirus recombinante

1. Para la amplificación de virus en suspensión, utilizar una densidad celular de 1,4 x 10 ⁶ células / ml y este debe ocupar 1/20 del volumen total matraz (es decir, 50 ml de cultivo enun matraz de 2 L).
2. Lograr la amplificación del virus recombinante por infección del cultivo celular de insecto con la madre viral P1 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 con la siguiente fórmula;
   
   Nota: la generación de virus de P1 se puede suponer que tienen un título viral esperado de 1 x 10 ⁷ ufp / ml. Sin embargo, un ensayo de placa se puede realizar antes de esta etapa.
3. Incubar la cultura de insecto infectadas con P1 a 27 ° C con agitación a 100 rpm durante 3 días (72 h).
4. Recoger el virus mediante la separación de las células de los medios de comunicación por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a TA. Guarde el sedimento celular resultante en esta etapa para la confirmación de la producción de virus recombinante mediante la evaluación de kindlin-3 expresión de la proteína por SDS-PAGE y Western Blot.
5. La transferencia de los medios de comunicación de virus enriquecido aclarados a un tubo limpio y se almacenan a 4 ° C enla oscuridad hasta su uso. Esta población viral se denota como P2.
   Nota: A título viral de 2 x 10 ⁸ ufp / ml (o una tasa de amplificación de 100 ufp / célula) puede ser anticipado.

4. Expresión de kindlin-3 en Infectados con baculovirus Sf9

1. Crecer un volumen adecuado de cultivos de células Sf9 en suspensión en Sf-900 II SFM suplementado con 100 mg / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, antes de la expresión a gran escala recombinante kindlin-3 para la purificación. Incubar los cultivos en suspensión a 27 ° C con agitación a 100 rpm y con un volumen total de cultivo: relación en volumen de 01:05 matraz.
2. Infect cultivos en suspensión de Sf9 a una densidad de 2 x 10 ⁶ células / ml.
3. Suplemento culturas Sf9 con una concentración final de 1% (v / v) de suero fetal bovino (FBS) seguido con el virus recombinante amplificado (P2-viral de stock) para dar un MOI de 1. Incubar los cultivos infectados a 27 ° C con agitación a 100 rpm.
4. Recombinación Harvestnt kindlin-3-CHIS _6-que expresan las células Sf9 72 horas después de la infección por centrifugación a 1000 xg   y el sedimento celular resultante se almacenó a -20 ° C hasta su uso, o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.

5. La purificación del recombinante kindlin-3

1. De células de insecto infectadas con baculovirus Descongele (Sf9) Bolitas expresan kindlin-3 recombinante en hielo.
2. Resuspender el sedimento celular descongelado con tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, 1% (v / v) de Tween-20), suplementado con EDTA libre de cóctel inhibidor de la proteasa y 1.000-2.000 U de Dnase1.
   Nota: Alternativamente, solución salina tamponada con fosfato modificada (PBS) también se puede utilizar, en donde la concentración de NaCl se ajustó a 500 mM para evitar interacciones no específicas entre proteínas endógenas de células Sf9 y la columna de afinidad de metal inmovilizado utilizado para la purificación aguas abajo (ver más abajo).
3. Lisar las células por incubación de las células resuspendidas con el detergente y el VOrtexing. Someter a ultrasonidos (40% de la amplitud, 10 ciclos de 10 seg de pulso seguido por 10 segundos de enfriamiento) la muestra para su posterior rotura de las células en un baño de hielo o, alternativamente, utilizar un homogeneizador Dounce.
4. Aclarar el lisado por centrifugación a 48.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Cargar el sobrenadante resultante en una columna de HisTrap (volumen de la columna 5 ml), pre-equilibrada con tampón de lisis, a 4 º C a una velocidad de 1 ml / min.
   Nota: Como alternativa, el lisado aclarado se puede incubar con un volumen de lecho 1-5 ml de perlas de sefarosa de níquel pre-equilibrada (por ejemplo, Ni Sepharose 6 Fast Flow) a 4 ° C durante 1-2 horas. Una columna de Ni Sepharose se puede formar después de la etapa de unión mediante el uso de una columna de flujo por gravedad.
5. Lavar la columna con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) para eliminar las proteínas no unidas.
6. Utilice un gradiente lineal de imidazol 10 a 500 mM a una velocidad de 10 mm / ml (o en 10 volúmenes de columna) usando un Äkta FPLC para eluirla kindlin-3-CHIS recombinante límite _6.
7. Fraccionar la elución en 0,5-1 ml de fracciones utilizando el Äkta FPLC, con aquellas fracciones que contienen kindlin-3-CHIS ₆ generalmente que eluye a una concentración de imidazol de 300 mM.
8. Evaluar la composición de proteína del eluyente por SDS-PAGE y para purificaciones por primera vez confirmar por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-His ₆ anticuerpo o anti-ratón kindlin-3 anticuerpo.
9. Reunir las fracciones que contienen kindlin-3 y intercambio de tampón en 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM a través de una serie de diluciones en tampón y concentraciones de la muestra utilizando un concentrador de centrífuga con una proteína de corte 50 kDa de peso molecular (MWCO) a 4 ° C.
   Nota: También puede dializar la solución de proteína usando Slide-A-lyzer Diálisis casete con un MWCO de 30 kDa a 4 º C durante 4 horas a O / N en 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM.
   Nota: para el intercambio de iones (véase más adelante) una menor concentración de NaCl, es decir, 50 mM, puede ser y ha sido utilizada para este paso.
10. Aplicar la solución de proteína un intercambio de tampón en una columna HiTrap heparina HP pre-equilibrada (5 volúmenes de columna ml) usando un Äkta FPLC a una velocidad de 0,5 ml / min.
    Nota: se eluye La kindlin-3 unida usando un gradiente lineal de NaCl (NaCl 0,2 M a 1 M de NaCl) en el mismo tampón, aumentando a una velocidad de 10 mm / ml. Se espera kindlin-3-CHIS6 para eluir a ~ 0,6 M NaCl.
11. Fraccionar la elución en 0,5-1 ml de fracciones y evaluar la composición de proteínas mediante SDS-PAGE y Western Blot, si es apropiado.
    Nota: se puede esperar una pureza de proteína de cerca de 95%, tal como se evaluó por SDS-PAGE.
12. Fracciones que contienen piscina kindlin-3 y concentrar utilizando un concentrador de centrífuga con una proteína de 50 kDa MWCO a un volumen final de 0,5-2 ml.
13. En un paso final, pulir la proteína concentrada intercambio de tampón y la proteína usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC).
    1. Aplicar la proteína purificada en un Doperdex S200 (16/60) o (10/30) pre-equilibrada en 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, DTT 1 mM a una velocidad de 1 ml / min o 0,5 ml / min dependiendo del tamaño de la columna utilizado.
       Nota: cromatografía de exclusión por tamaño también se puede realizar en solución salina tamponada con fosfato (PBS), si es necesario.
    2. Purificar las proteínas de acuerdo con el tamaño mediante la aplicación de tampón en la columna a una velocidad de 1 ml / min o 0,5 ml / min, dependiendo del tamaño de la columna utilizada.
       Nota: La proteína que eluye de la columna es fraccionado y vigila por medio de la absorbancia a 280 nm.
    3. Un único pico de absorbancia se debe esperar de SEC, que se fracciona y se evaluó por SDS-PAGE para determinar la homogeneidad, y es típicamente> 95% de pureza después de este paso.
14. Se concentra la purificado kindlin-3-CHIS ₆ usando un concentrador de centrífuga con una proteína kDa MWCO de 50 a ~ 15 mg / ml, tal como se evaluó espectrofotométricamente usando un coeficiente de extinción calculado (ε) de 109.320 M ^-1 cm ^{-1 <}/ Sup> (suponiendo que todos los residuos de cisteína se reducen).
15. Para el almacenamiento a -20 ° C y almacenamiento a largo plazo a -80 ° C, la proteína alícuota en tubos de PCR y flash congelar las muestras en nitrógeno líquido. Alternativamente, la proteína se puede utilizar directamente para la investigación usando un número de técnicas bioquímicas y biofísicas.

Resultados

La expresión a gran escala de ratón recombinante kindlin-3 utilizando células Sf9 infectadas con baculovirus puede tener menos de dos semanas para lograr cantidades de miligramos, como se ilustra en la Figura 1A esquemática y requiere sólo una pequeña cantidad de ADN plasmídico a partir de un kit QIAprep Miniprep, para ejemplo. La generación de baculovirus recombinante se logra mediante la cotransfección de células Sf9 con el ratón kindlin-3 (FERMT3)-que contiene el plásmido junto con un bácmido linealizado ingeniería (BAC10: KO ₁₆₂₉₎ y la cosecha de los viriones recién formados después de 5-7 días, como se muestra en la figura 1A. Este método de generación de resultados de baculovirus en 100% de los virus recombinantes y esencialmente dispensa la necesidad de ^28,30 purificación en placa. Un representante de la cultura a pequeña escala (2 ml monocapa) generará una solución que contiene el virus recombinante con un título viral esperado de unidades formadoras de 1 x 10 ⁷ de placa (ufp) por ml decultura. Uno puede realizar un ensayo en placa para determinar el título viral real pero esto es tal vez demasiado mucha mano de obra cuando un gran número de construcciones se prueban para estudios estructurales. El éxito de la etapa de generación de virus se puede determinar mediante el uso de un plásmido que contiene eGFP-en paralelo, o, para este kindlin-3 constructo, la monocapa de Sf9 se puede resuspendió en PBS y se evaluó por SDS-PAGE y Western Blot, que típicamente demuestra una banda clara correspondiente a una proteína marcada con His 75 kDa, como se muestra en la Figura 1B. El virus se amplifica posteriormente para generar cantidades suficientes para a gran escala (volúmenes litros) la infección de células de insecto y el aislamiento de proteína recombinante. El segundo paso de virus (P2) se genera mediante la infección de cultivos en suspensión con una MOI estimada de 0,1 (véase el protocolo). Es de vital importancia que la amplificación Sf9 cultivo en suspensión ocupa sólo una vigésima parte del volumen total del matraz. Esta aireación adicional se asegura de que el vir resultantemedios de comunicación nos contienen, cosechados después de 3 días (72 h) después de la infección, va a generar cantidades suficientes de kindlin-3 en la cultura posterior expresión. El stock de virus amplificado (P2) se supone que poseen un título viral esperado de 2 x 10 ⁸ pfu / ml sobre la base de una estimación conservadora de 100 ufp / célula utilizando una densidad celular de 2 x 10 ⁶ células / ml durante la amplificación ^31. Generalmente, para la amplificación de baculovirus óptima y la producción de proteínas, las células Sf9 deben ser de tamaño uniforme y esférica, como se muestra en la Figura 1C. Además, viral amplificación y expresión de la proteína es máxima a 72 horas después de la infección, y ambos se reducen de manera significativa a las 96 horas post-infección.

Una vez que el virus ha sido amplificado y usado para infectar células Sf9 en experimentos a gran escala kindlin-3 recombinante se purificó parcialmente por virtud de su C-terminal _6-Su etiqueta usando cromatografía de afinidad de metal inmovilizado ingenieríaultrarrápida, como se muestra en la Figura 2. Es importante para llevar a cabo la purificación a 4 º C y que los inhibidores de la proteasa suficientes se han añadido para evitar la proteolisis. El kindlin-3 parcialmente purificado se purifica adicionalmente hasta casi homogeneidad mediante cromatografía de intercambio de iones (IEC) usando una columna de heparina, como se muestra en la Figura 3. Se empleó el uso de una columna de heparina en lugar de una columna de intercambio iónico convencional, como se predijo que la gran cantidad de residuos básicos, incluyendo un tramo de poli-lisina en el dominio F1 kindlin-3, sería interactuar fuertemente con los grupos sulfato cargados negativamente de la columna. Esta estrategia es particularmente útil para las proteínas de unión de ARN-ADN-y con parches de unión a ácidos nucleicos básicos, por ejemplo, el terminal de unión de ARN-uridililtransferasa CID1 ^32. Finalmente kindlin-3 pureza es "pulido" por cromatografía de exclusión de tamaño para eliminar los agregados y lograr la homogeneidad, como se muestra enFigura 4. Los buffers especificados en los protocolos son tampones estándar que se utiliza con frecuencia en la purificación de proteínas para el análisis estructural. Generalmente, los tampones a base de fosfato se evitan para la purificación de proteínas para estudios estructurales, especialmente la detección de cristalización debido a la formación de cristales de fosfato en las gotas de cristalización (en particular para los experimentos a 4 ° C). Sin embargo, se realizó un ensayo de desplazamiento térmico basado en Thermofluor para determinar que los tampones se estabilizante para kindlin-3, como se muestra en la Figura 5. Brevemente, una solución de proteína purificada se diluyó en tampones que cubren una gama de concentraciones de pH y cloruro de sodio, por lo tanto, la formación de una pantalla de 2 dimensiones. La fusión de la proteína se mide mediante la observación de la fluorescencia de Sypro tinte de color naranja (sondas moleculares), que se une a los residuos hidrófobos dentro del núcleo de la proteína plegada, sobre el rango de temperatura de 20-95 ° C (293-368 K). La temperatura de punto medio en el que the proteína se despliega (temperatura de transición, _Tm) se calculó utilizando el software Opticon monitor y se describe en otra parte ^33. Se observó kindlin-3 para ser estables a concentraciones de cloruro de sodio de alta (500 mm) en el rango de pH 7,0 a 9,0, con una temperatura de transición consistente _(Tm) de 55 ° C. También se observó que la _Tm de kindlin-3 fue aproximadamente de 55 ° C dentro del intervalo de pH 7,0-7,5 con independencia de la concentración de cloruro de sodio.

Nos encontramos que había proteólisis limitada de kindlin-3 durante la purificación, pero el análisis de SDS-PAGE de proteína altamente concentrado (~ 15 mg / ml), ha demostrado la contaminación limitada con dos polipéptidos adicionales de la misma intensidad. Curiosamente, sin embargo no hay ninguna indicación de especies adicionales por cromatografía de exclusión por tamaño, como se muestra en la Figura 4. Por tanto, se pensó que la proteína se mella por proteasas, pero permanece plegada y hydrodynamically indistinguible de la proteína de longitud completa. Curiosamente, la calpaína es una proteasa que escinde conocido kindlin-3 en Tyrosine373, que está en el bucle β1-β2 de la homología de plecstrina (PH) de dominio ³⁴ y puede explicar nuestras observaciones. Por otra parte, el Western Blot revela que uno de los dobletes de polipéptidos posee un C-terminal de His-tag y el peso molecular aparente del doblete, cuando se suman, es igual a 75 kDa, el mismo peso molecular que la proteína nativa. El rendimiento de kindlin-3 purificada recombinante por litro de células Sf9 (~ 2 g de peso de células) es, en el mejor, 5 mg.

Figura 1. Panorama general de infectados por baculovirus en células de insecto heteróloga expresión de la proteína. (A) Una esquematizada de generatio baculovirusn y la expresión de kindlin-3 en células Sf9. En los esquemas de vectores de ADN, 5'UTR / ORF603 está coloreado en rojo, la ORF1629 es de color verde y, el gen de la proteína de interés (POI) es de color azul. (B) Western blot, utilizando un anticuerpo anti-His _6, de seis (2 ml) monocapa culturas pequeña escala (carriles etiquetados de acuerdo a la cultura) de células Sf9 que producen baculovirus recombinante y kindlin-3 murino recombinante. (C) Imagen de microscopía de luz de células Sf9 sanas cultivadas en suspensión en Sf-900 II SFM suplementado con antibióticos y se transfiere a una placa de cultivo de tejidos bien 35 mm (véase el protocolo). La imagen es la ampliación de 20X.

Figura 2. Representantespurificación ntative de kindlin-3 por cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC). SDS-PAGE de afinidad de níquel purificada recombinante murino kindlin-3 expresada en células Sf9 infectadas con baculovirus (~ 2 g de peso de células). Proteína adsorbida se eluyó usando un gradiente de imidazol (se muestra más arriba el gel). Los carriles están etiquetados de la siguiente manera; MW, marcador de peso molecular; Lys, lisado de células enteras; FT, fluyen a través de (sin consolidar); WI, lave 1; WII, lavar 2. Western blot (abajo) también se realizó utilizando las fracciones de elución para confirmar la presencia de la ingeniería-Su etiqueta de la proteína recombinante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Reprepurificación sentante de kindlin-3 por heparina para cromatografía de afinidad. (A) Perfil de elución observó a 280 nm (azul) que muestra un solo pico simétrico liberadores bajo un gradiente lineal de cloruro sódico (verde), utilizando el rango de concentración de NaCl de 0,05 a 1,0 M. ( B) El análisis de SDS-PAGE de la elución fraccionada que demuestra la presencia de la proteína de 75 kDa, kindlin-3 (K3 marcado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Representante cromatografía de filtración en gel y (A) perfil de elución de filtración en gel concentrado kindlin-3. De kindlin-3 purificada utilizandoun Superdex S200 (16/60) en Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM y DTT 1 mM a 20 ° C. Con base en el volumen de elución, kindlin-3 migra como se esperaba para una proteína de 75 kDa, lo que sugiere que es predominantemente monomérico. (B) SDS-PAGE de alta concentración purificada kindlin-3 recombinante a 14,5 mg / ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensayo de desplazamiento térmico basado en Thermofluor Figura 5. Para el tampón de detección. Kindlin-3 se diluyó en diversos tampones que comprenden una pantalla de dos dimensiones de pH frente a concentración de cloruro de sodio. Temperaturas de transición (temperatura a mediados de los puntos) se observaron mediante fluorescencia de lacolorante hidrófobo unido, Sypro naranja (sondas moleculares) y se calcula utilizando el software Opticon Monitor. (A) Un histograma 3D de las temperaturas de transición se representa junto con (B) el cambio en la temperatura de transición a partir de la media calculado de 50,4 ° C. Para mayor claridad las barras son de color de acuerdo con el rango de temperaturas a las que corresponden. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Sistemas de expresión de baculovirus se están convirtiendo cada vez más popular y una herramienta importante para la producción de cantidades de miligramos de proteína recombinante para la caracterización de proteínas utilizando estudios biofísicos, incluyendo la cristalografía de rayos X. A pesar de ser más exigentes de forma experimental los sistemas de expresión de baculovirus ofrecen varias ventajas con respecto a E. coli uno de los cuales es un entorno casi nativo para las proteínas de origen eucariota, por ejemplo la presencia de chaperones y oportunidad para la modificación post-traduccional apropiadas. En nuestros esfuerzos para expresar kindlin-3, se utilizaron huéspedes de expresión alternativos incluyendo líneas celulares de mamíferos y cepas de expresión bacterianos (observaciones no publicadas). Generalmente, los muchos E. coli cepas ensayadas producen cantidades muy pequeñas de recombinante kindlin-3 (~ 0,5 mg / l de cultivo; observaciones no publicadas). Sin embargo, la expresión de baculovirus impulsada en células de insecto era particularmente eficaz y, en colaboraciónmparison para la expresión transitoria en células de mamífero, más susceptibles a la generación de la gran biomasa requerida para aislar un miligramos de proteínas citoplasmáticas recombinantes (observaciones no publicadas). Especulamos que la presencia chaperonas eucariotas pueden permitir la producción eficiente de kindlin-3.

Los Baculoviridae infectan células de insecto y de expresión de la proteína recombinante del baculovirus utilizado en este trabajo se basa en la Autographa californica virus de la poliedrosis nuclear (AcNPV). En la naturaleza el AcNPV, que infecta la Autographa californica (lopper alfalfa) larvas de insectos, requiere la proteína polihedrina para formar oclusiones por el que los viriones son encapsulados en una matriz proteica cristalina proporcionando así la protección necesaria para su puesta en libertad. En las células cultivadas no se requiere la formación de cuerpos de oclusión para la replicación y es, por tanto, prescindible. En el caso de expresar proteínas extrañas del gen de la proteína de polihedrina puede ser replaced en un AcNPV recombinante con el gen para la proteína de interés. AcNPV puede infectar a otras especies Lepidopteron y para los fines de gusano ejército expresión de la proteína recombinante de Spodoptera frugiperda se usan células de ovario de pupa. En el enfoque descrito aquí, el bácmido de AcNPV (BAC10) está diseñado de modo que un gen viral esencial, ORF1629, se inactiva mediante la inserción de cloranfenicol acetil transferasa que resulta en un bácmido de knock-out (BAC10: KO _1629), de tal manera que es incapaz de formar baculovirions infecciosas ^28. La cotransfección de células Sf9 con BAC10 linealizado: KO ₁₆₂₉ y la transferencia FERMT3-que contienen el vector repara la inactiva ORF1629, a través de transposición, lo que resulta en un genoma viable que también ha incorporado el gen FERMT3 bajo el control del promotor de polihedrina ^28.

Se describe un protocolo de purificación para el aislamiento de ratón recombinante altamente pura kindlin-3 a través de un threenfoque cromatográfico de correo paso. Los métodos utilizados aquí pueden ser fácilmente aplicados a otras proteínas etiquetadas-Su. Empleamos una etapa de intercambio de iones para purificar más kindlin-3, pero creemos que este es un paso pseudo-afinidad además como kindlin-3 posee un gran número de residuos básicos, incluyendo un tramo de poli-lisina dentro de su dominio F1. Además, se considera kindlin-3 para unirse a e interactuar con la cara citoplásmica de la membrana plasmática, donde funciona, y por lo tanto predecir que la agrupación de residuos básicos permitirá que la proteína para contrarrestar la membrana cargada negativamente.

Los tampones se describen en los protocolos de purificación se consideran estándar y se utilizan con frecuencia en la biología estructural. El ensayo thermofluor (Figura 5) demuestra que kindlin-3 es estable en la mayoría de condiciones de tampón de pH por encima de 6,0. Esto fue particularmente útil e importante para informar a nuestros experimentos cuando se estudia kinldin-3: β1Una interacción de cola por RMN, que dado excelentes espectros a pH 6,1 con bajas concentraciones de NaCl ^12.

Antes de cualquier estudio biofísico puede llevarse a cabo, es importante demostrar que la proteína purificada de interés está hecho correctamente plegada y es funcionalmente activo. En una publicación anterior hemos demostrado que la kindlin-3 recombinante expresada y purificada utilizando este método era un monómero y monodispersas en solución, tal como se evaluó por cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz dinámica, ultracentrifugación analítica y pequeño ángulo de dispersión de rayos X, y fue también capaz de unirse y reconocer la NPxY membrana distal y aguas arriba de clúster de serina / treonina de β _1A colas citoplasmáticas ^14, lo que confirma que se comporta como la proteína natural, que está en consonancia con los estudios celulares y fisiológicos previos ^14,20,22. El uso de un ensayo de estabilidad térmica es una forma adicional de sugerir ªe plegamiento apropiado de una proteína de interés, como la proteína plegada incorrectamente resultará en un fondo alto de fluorescencia debido a los residuos hidrófobos expuestos.

La familia de proteínas kindlin ha sido el foco de mucha atención desde que se descubrió su inesperado papel como coactivadores esenciales de las integrinas en vivo. Esto ha dado lugar a un gran esfuerzo para expresarlos de forma recombinante y resolver sus estructuras. Hasta la fecha un éxito limitado se ha informado en la expresión de cantidades de miligramos de proteína recombinante de longitud completa pero tenemos aquí describe el uso de un sistema de baculovirus que permite la expresión a gran escala a niveles en los estudios estructurales se convierten en factible. Mediante la generación de grandes cantidades de kindlin-3 recombinante anticipamos que esto ayudará a otros estudios de esta proteína. El método y purificación de flujo de trabajo de baculovirus impulsada descrito aquí para recombinante murino kindlin-3 también podría ser utilizado para expresar y purificar las otras isoformas kindlin, Que también son difíciles de expresar y también poseen tramos poli-lisina, y puede estar adaptado además para otras proteínas citoplasmáticas, tales como proteínas de unión de ácido nucleico, que no logran expresar en las cepas bacterianas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid	Life Technologies	10902-096	store at 4 °C and warm to RT before use
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	10362-100	Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used
Streptomycin sulphate (solid)	Melford	S0148	Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
Penicillin G, potassium salt (solid)	Melford	P0580	Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate	Greiner Bio-One	657160
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10100-147
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8849	Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	D5025
HisTrap FF (5 ml)	GE Heathcare	17-5286-01	Requires an Äkta FPLC machine
HiTrap Heparin (5 ml)	GE Heathcare	17-0407-01	Requires an Äkta FPLC machine
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)	Millipore	UFC905024	15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator