Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Riepilogo

Kindlins sono fondamentali per l'adesione cellulare tramite integrine ma gli studi di loro sono stati ostacolati dalla difficoltà incontrata ad esprimere loro ricombinante in ospiti batterici. Descriviamo qui metodi per la loro produzione efficiente in cellule di insetto baculovirus-infette.

Abstract

Kindlins coattivatori sono essenziali, con talin, dei recettori di superficie cellulare integrine e anche partecipare integrina outside-in di segnalazione, e il controllo della trascrizione genica nel nucleo della cellula. I kindlins sono ~ 75 kDa proteine ​​multidominio e si legano ad un motivo NPxY e monte T / S grappolo della integrina β-subunità coda citoplasmatica. Il hematopoietically importante isoforma kindlina, kindlina-3, è fondamentale per l'aggregazione piastrinica durante la formazione di trombi, leucociti a rotazione in risposta alle infezioni e l'infiammazione e la formazione di osteoclasti podocita nel riassorbimento osseo. Il ruolo di kindlina-3 in questi processi ha portato in ampi studi cellulari e fisiologici. Tuttavia, vi è la necessità di un metodo efficace di acquisire quantitativi milligrammi di alta qualità della proteina per ulteriori studi. Abbiamo sviluppato un protocollo, qui descritto, per l'espressione efficiente e purificazione di ricombinante kindlina-3 murina mediante uso di un baculovirus-driven sistema di espressione in cellule Sf9 cedendo una quantità sufficiente di elevata purezza proteina intera per consentire la sua caratterizzazione biofisica. Lo stesso approccio potrebbe essere presa nello studio delle altre isoforme kindlina mammiferi.

Introduzione

Le proteine ​​della famiglia kindlina sono una componente fondamentale di montaggio adesione focale, e quindi essenziale per la vita complessa. Kindlins, di cui ci sono tre isoforme di mammiferi (kindlina-1, kindlina-2, e kindlina-3), sono considerati coactivators dei recettori extracellulari integrine accanto Talin ^1. Integrina-mediata adesione cellulare collega la superficie cellulare alla matrice extracellulare (ECM) in eucarioti superiori. Si tratta di un processo critico e comune in una pletora di fenomeni fisiologici, che includono l'integrità dei tessuti, embriogenesi, metabolismo osseo, emostasi, e l'immunità. Integrin mediata adesione cellulare si attiva tramite inside-out trasduzione del segnale tramite il legame di Talin e kindlina le integrine β-subunità code citoplasmatici (TA) presso i loro motivi NPxY conservati. L'importanza biomedica di proteine ​​kindlina estende tuttavia fino al nucleo, dove kindlina-2 è stato dimostrato in diversi rapporti recenti per essere coinvolti nella trascrizioneal controllo ^2,3.

Kindlins sono proteine ​​multidominio di circa 75 kDa, caratterizza per il possesso di un FERM bipartito C-terminale (4.1 band, ezrina, radixina, moesina) del dominio, che viene interrotto da una omologia pleckstrin (PH) dominio al centro del suo sottodominio F2 ^4,5. Gli studi dei domini kindlina-2 e kindlina-3 PH hanno dimostrato che si lega al secondi messaggeri lipidici fosfatidilinositolo-(3,4,5)-trifosfato e fosfatidilinositolo-(4,5)-bisfosfato ^6-8. Tuttavia, studi del dominio kindlina-1 PH mostrano che si lega a PtdIns (3,4,5) P ₃ con un'affinità molto inferiore, che può essere spiegato in kindlina-1 da un ponte salino specifico isoforma impedendo lipidi di legarsi ^9. Inoltre, vi è un loop ~ 100 aminoacidi inserito nel dominio F1 dei kindlins che è previsto per essere spiegato ma si lega alla fosfatidilserina nel foglietto interno della membrana plasmatica ^10,11. Il FERM kindlinadominio è considerata omologa al dominio FERM Talin, sebbene il dominio FERM Talin non possiede un dominio pleckstrin omologia. Entrambi kindlins e talin interagiscono con motivi NPxY sulle integrine β-code attraverso la regione F3 del loro dominio FERM, ma kindlina si lega alla membrana motivo distale, mentre talin rivolge prossimale membrana quella ^12-16. Kindlins e talin sia in aggiunta possiedono un dominio F0 N-terminale con una piega ubiquitina-simile che non si trova in altre proteine ​​FERM ^11,17. Studi sul dominio F0 di kindlina-2 hanno dimostrato che si lega in modo indipendente per fosfatidilinositolo-(4,5)-bisfosfato membrane arricchite ^17.

I kindlins presentano pattern di espressione dei tessuti specifici paralogo-e le funzioni fisiologiche non ridondanti. Kindlina-1 è espresso principalmente nell'epidermide, ma anche in misura minore i colon, stomaco e reni; kindlina-2 è espresso ubiquitariamente ma è concentrata in striato e lisciomuscolare ed è l'unico kindlina espressa nello sviluppo embrionale ⁴ e kindlina-3 è espresso nei tessuti ematopoietici con la più alta concentrazione di kindlina-3 trovati nei megacariociti ^18. Tuttavia, studi più recenti hanno suggerito che la proteina funzionale è espressa in tessuti endoteliali e ^19.

Kindlina-3 è di interesse medico acuta dovuta al suo importante ruolo fisiologico nel sangue. E 'fondamentale per l'aggregazione piastrinica e la diffusione durante la formazione di trombi ^20, leucociti laminazione in risposta alle infezioni e infiammazioni ^21,22 e la formazione di osteoclasti podocita nel riassorbimento osseo ^23. Inoltre, l'esaurimento delle kindlina-3 in esseri umani porta a deficit di adesione leucocitaria di tipo III - una malattia caratterizzata da disturbi emorragici potenzialmente letali e infezioni batteriche ricorrenti ^20,24,25. Kindlina-3 studi knock-out nei topi hanno mostrato la funzione essenziale della proteina inl'adesione cellulare KIND3 ^{-. / -} mice visualizzare fenotipi distinti, come sanguinamento grave a causa di integrine inattivi piastrine, grave osteopetrosi, e alterata adesione dei leucociti ^20,22, simile a sintomi nell'uomo manca kindlina-3.

Dati strutturali ad alta risoluzione sui kindlins, ad oggi, è stato limitato a sottodomini individuali come l'omologia pleckstrin (PH) dominio del kindlina-1 ⁹ e kindlina-2 ^26,27 e il dominio F0 di kindlina-1 ¹¹ e kindlina -2 ^17. La maggior parte dei sottodomini di ogni polipeptide kindlina hanno comunque resistito clonazione e analisi strutturale (Yates e Gilbert, osservazioni non pubblicate), e gli studi delle proteine ​​full-length sono stati ostacolati dalla difficoltà di esprimere e purificante quantità sufficienti con E. coli (osservazioni non pubblicate e Harburger et al. ^14). C'è un notevole interesse medico in kindlina-3 e la sua function, accanto agli altri due membri della famiglia, e di recente abbiamo generato quantità milligrammi di esso mediante espressione ricombinante in cellule di Spodoptera frugiperda guidati da infezione baculovirus ^12. Abbiamo quindi qui descrivere i metodi per la produzione di quantità milligrammo di topo ricombinante kindlina-3 in coltura cellulare di insetto, adatto per lunghi studi strutturali e analisi biochimica.

In questo protocollo ci avvaliamo di un bacmid knockout allestita (BAC10 _{KO: 1629)} cioè, da solo, in grado di produrre virioni vitali ^28. Il DNA virale viene quindi salvato da ricombinazione con un vettore di trasferimento che in questo caso comprende anche la kindlina-3 gene (FERMT3) e risultati nel gene FERMT3 sostituendo il virus molto tardi gene, che è altamente espressa ma ridondante, risultando in un ricombinante virus che esprime topo kindlina-3 come parte del ciclo vitale del virus ^28. Abbiamo identificato questaProcedimento per la produzione di kindlina-3 dopo i tentativi di esprimere e purificare in altri host di espressione dimostrato proibitivo (osservazioni non pubblicate), ma anche grazie alla versatilità della suite vettore Popin, che abbiamo usato per la clonazione e che possono distribuito in molti espressione ospita ^29.

Protocollo

Questo protocollo presuppone che il mouse kindlina-3 gene (FERMT3) è stato clonato con successo in un vettore a valle del promotore molto tardi p10 e che il vettore possiede sequenze fiancheggianti baculovirus consentire ricombinazione con il bacmid BAC10 _{KO: 1629} sviluppato da IM Jones e colleghi ^28. Per questo protocollo, il kindlina-3 gene è stato clonato in pOPINE ²⁹ e gli inneschi e la strategia di clonazione utilizzati possono essere trovate descritto altrove ^12. Il plasmide è stato progettato in modo che il gene FERMT3 (kindlina-3) è sotto il controllo del promotore p10 baculovirali e il vettore contiene 5 'UTR/ORF603 e ORF il 1629 e codifica una C-terminale suo _6-tag per la purificazione a valle ^29.

1. Coltura cellulare insetti e manutenzione

1. Prima di baculovirus ricombinante amplificazione, cellule di Spodoptera frugiperda atto a coltura in sospensione (cellule Sf9) dovrebberoessere coltivate e mantenute. Cellule di insetto devono essere trattati con tecniche asettiche in un tessuto culturale cappa dedicato.
2. Colture in sospensione di cellule di insetto sono incubati in Sf-900 II (SFM) siero mezzo liquido libero supplementato con penicillina 100 pg / ml e 100 pg / ml di streptomicina in beute a 27 ° C con agitazione a 100 rpm.
3. Mantenere la gamma di densità di coltura cellulare di insetto tra 1 x 10 ⁶ - 1 x 10 ⁷ cellule / ml di scissione e diluendo la coltura cellulare con fresche Sf-900 II media.
   Nota: sano celle devono guardare dimensioni uniformi e devono essere di forma sferica.
4. Contare le cellule in un volume di campione con un emocitometro e microscopio ottico per calcolare la densità cellulare cultura.

2. Generazione di ricombinante Baculovirus

1. Cultura e mantenere le cellule Sf9 in sospensione utilizzando Sf-900 II multimediale integrato con 100 pg / ml penicillin e 100 pg / ml streptomicina. Per la generazione baculovirus, cellule di insetto dovrebbero essere coltivati ​​per una gamma di densità di 5 x 10 ⁵ - 1 x 10 ⁶ cellule / ml.
2. Seme di circa 1 x 10 ⁶ cellule Sf9 per pozzetto di un tessuto 6 pozzetti piastra di coltura sterile in 2 ml di Sf-900 II supporto integrato con penicillina 100 pg / ml e 100 pg / ml streptomicina. Lasciare le cellule Sf9 a temperatura ambiente sotto cappa di aderire alla base dei pozzetti di plastica e quindi formare un monostrato.
3. Eseguire ricombinante generazione baculovirus da cotransfecting bacmid DNA e DNA plasmidico sulla cultura monostrato.
   1. Per ogni trasfezione, mescolare 1-2 mg di purificato pOPINE-mFERMT3, che possiede le ORF1629 elementi baculovirus, con 0,5 mg di purificato BAC10 _{KO: 1629} in 100 ml di Sf-900 II SFM senza antibiotici (soluzione A).
   2. In un tubo separato, diluire 6 ml di Cellfectin II reagente con 100 ml di Sf-900 II SFM senza lottaantibiotici per ciascuna reazione trasfezione (Soluzione B). A 'master mix' può essere creato qui, per la manipolazione dei liquidi ridotta, se sono necessarie molte transfezioni.
   3. Mescolare le due soluzioni (A e B, di circa 200 microlitri) e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare un complesso lipide-DNA.
   4. Diluire i complessi lipide-DNA con 800 microlitri Sf-900 II SFM senza antibiotici. Con attenzione aspirare i media monostrato cellulare Sf9 e pipetta con attenzione la soluzione A / B e dei media sulla parte superiore del monostrato Sf9.
   5. Incubare le cellule trasfettate in un incubatore umidificato a 27 ° CO / N e aggiungere altre 1 ml di Sf-900 II SFM senza antibiotici ad ogni coltura monostrato il giorno seguente. Incubare le cellule a 27 ° C per altri 5 giorni.
4. Raccogliere il baculovirus ricombinante direttamente dal terreno di coltura (circa 2 ml in totale) e trasferire in una provetta da centrifuga pulita (ad esempio un tubo Falcon 15 ml).
   1. Chiarire qualsiasi debr cella Sf9è per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il virus, che è nel supernatante risultante e denotato P1, in una provetta pulita e conservare a 4 ° C al buio fino al momento dell'uso. In questa fase il restante monostrato Sf9 può essere utilizzato per valutare generazione virus ricombinante per valutare la presenza di ricombinante kindlina-3 nelle cellule di insetto.
5. Risospendere il monostrato con 0,5 ml di PBS e diluire un campione di 10 ml con volumi uguali di 2x tampone SDS-PAGE carico. Riscaldare i campioni a> 95 ° C per almeno 10 min.
   1. Sonicare il campione per 1 sec al 10% di ampiezza con una punta di micro-sonicator se è troppo viscoso per il corretto caricamento del gel.

3. Amplificazione del ricombinante Baculovirus

1. Per l'amplificazione del virus in sospensione, utilizzare una densità cellulare di 1,4 x 10 ⁶ cellule / ml e questo dovrebbe occupare a 1/20 del volume totale pallone (cioè 50 ml in culturaun pallone da 2 L).
2. Conseguire l'amplificazione del virus ricombinante infettando la coltura cellulare di insetto con lo stock virale P1 ad una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1 utilizzando la seguente formula;
   
   Nota: generazione di virus P1 può presumere di avere un titolo virale previsto di 1 x 10 ⁷ pfu / ml. Tuttavia, un saggio di placca può essere eseguito prima di questa fase.
3. Incubare la cultura P1 insetto infettate a 27 ° C con agitazione a 100 rpm per 3 giorni (72 ore).
4. Raccogliere il virus separando le cellule dal supporto mediante centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Salvare il pellet cellulare risultante in questa fase per la conferma della produzione di virus ricombinante valutando kindlina-3 espressione proteica mediante SDS-PAGE e western blotting.
5. Trasferire i mezzi di virus arricchita chiarito in una provetta pulita e conservare a 4 ° C inbuio fino al momento dell'uso. Questo stock virale è indicata come P2.
   Nota: Un titolo virale di 2 x 10 ⁸ pfu / ml (o un tasso di amplificazione di 100 pfu / cell) può essere previsto.

4. Espressione di kindlina-3 in Baculovirus-Infected Sf9

1. Crescere un volume adeguato di cellule Sf9 colture in sospensione in Sf-900 II SFM supplementato con 100 pg / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina, prima larga scala ricombinante kindlina-3 espressione per la purificazione. Incubare le colture in sospensione a 27 ° C con agitazione a 100 rpm e con un volume totale cultura: pallone rapporto in volume di 1:5.
2. Infect colture in sospensione di Sf9 ad una densità di 2 x 10 ⁶ cellule / ml.
3. Supplemento culture Sf9 con una concentrazione finale di 1% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) seguita da virus ricombinante amplificato (P2-virale magazzino) invia un MOI di 1. Incubare le colture infettate a 27 ° C con agitazione a 100 rpm.
4. Harvest ricombinazionent _{kindlina-3-6-CHIS} cellule esprimenti Sf9 72 ore dopo l'infezione mediante centrifugazione a 1000 xg   e il pellet cellulare risultante conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso, o -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

5. Purificazione di ricombinante kindlina-3

1. Scongelare congelati cellule di insetto baculovirus infettate (Sf9) Pellets esprimono ricombinante kindlina-3 sul ghiaccio.
2. Risospendere il pellet cellulare scongelato con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, 1% (v / v) Tween-20), supplementato con libero-EDTA cocktail inibitore di proteasi e 1.000-2.000 U di DNase1.
   Nota: In alternativa, tampone fosfato modificato (PBS) può anche essere utilizzato, dove la concentrazione di NaCl viene regolata a 500 mM per evitare interazioni aspecifiche tra endogeni proteine ​​cellulari Sf9 e la colonna di affinità metallo immobilizzato utilizzato per la purificazione a valle (vedi sotto).
3. Lisare le cellule incubando le cellule risospese con il detersivo e vortexing. Sonicare (40% di ampiezza, 10 cicli di 10 sec impulsi seguita da raffreddamento 10 sec) il campione per ulteriore distruzione cellulare in un bagno di ghiaccio o in alternativa utilizzare un omogeneizzatore Dounce.
4. Chiarire il lisato tramite centrifugazione a 48,000 xg per 1 ora a 4 ° C. Caricare il supernatante risultante su una colonna HisTrap (5 ml volume della colonna), pre-equilibrata con tampone di lisi, a 4 ° C ad una velocità di 1 ml / min.
   Nota: In alternativa, il lisato chiarificato può essere incubato con un 1-5 ml volume del letto di pre-equilibrata sefarosio perline di nichel (Ni es Sepharose 6 Fast Flow) a 4 ° C per 1-2 ore. Una colonna di Ni sefarosio può essere formato dopo la fase di legame utilizzando una colonna a gravità.
5. Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazolo 10 mM) per rimuovere il materiale non legato.
6. Utilizzare un gradiente di imidazolo lineare 10-500 mm ad una velocità di 10 mm / ml (o in 10 volumi di colonna) utilizzando un ÄKTA FPLC eluirela kindlina-3-CHIS ricombinante legato _6.
7. Frazionare l'eluizione in 0,5-1 ml frazioni utilizzando la ÄKTA FPLC, con le frazioni contenenti _kindlina-3-6 CHIS solito eluizione ad una concentrazione di 300 mM imidazolo.
8. Valutare la composizione proteica dell'eluente mediante SDS-PAGE e purificazioni per la prima volta confermare mediante Western blotting utilizzando un anti-His ₆ o anticorpo anti-topo kindlina 3-anticorpo.
9. Si riuniscono le frazioni contenenti kindlina-3 e buffer di scambio in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM tramite una serie di diluizioni in tampone e concentrazioni del campione utilizzando una proteina concentratore centrifugo con un peso molecolare di 50 kDa cut-off (MWCO) a 4 ° C.
   Nota: In alternativa, Dializzare soluzione proteica utilizzando Slide-A-lizzatore dialisi cassette con un MWCO di 30 kDa a 4 ° C per 4 ore a O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM.
   Nota: per scambio ionico (vedi sotto) una minore concentrazione di NaCl, ie 50 mM, può essere ed è stato utilizzato per questo passo.
10. Applicare la soluzione tampone proteina a scambio su una colonna HiTrap eparina HP pre-equilibrata (5 volumi colonna ml) usando un ÄKTA FPLC ad una velocità di 0,5 ml / min.
    Nota: Il kindlina-3 legato viene eluito con un gradiente lineare di NaCl (0,2 M NaCl 1 M NaCl) nello stesso tampone, aumentando a una velocità di 10 mm / ml. Kindlina-3-CHIS6 dovrebbe eluire a ~ 0,6 M NaCl.
11. Frazionare l'eluizione in 0,5-1 ml frazioni e valutare la composizione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE e western blotting, se del caso.
    Nota: ci si può aspettare una purezza della proteina di quasi il 95%, come valutato mediante SDS-PAGE.
12. Frazioni piscina contenente kindlina-3 e concentrare utilizzando un concentratore proteina centrifuga con una kDa MWCO 50 ad un volume finale di 0,5-2 ml.
13. Nella fase finale, lucidare il proteica concentrata e buffer scambiare la proteina mediante cromatografia di esclusione dimensionale (SEC).
    1. Applicare la proteina purificata su un Superdex S200 (16/60) o (10/30) pre-equilibrata in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, DTT 1 mM ad una velocità di 1 ml / min o 0,5 ml / min a seconda delle dimensioni della colonna utilizzato.
       Nota: cromatografia di esclusione dimensionale può essere eseguita anche in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), se necessario.
    2. Purificare le proteine ​​secondo la dimensione del buffer applicando sulla colonna ad una velocità di 1 ml / min o 0,5 ml / min, a seconda delle dimensioni della colonna utilizzata.
       Nota: La proteina eluizione dalla colonna è frazionato e monitorata usando l'assorbanza a 280 nm.
    3. Un singolo picco di assorbanza deve essere previsto dal SEC, che è frazionato e valutata mediante SDS-PAGE per determinare omogeneità, ed è tipicamente> 95% puro dopo questo passaggio.
14. Concentrare il purificato kindlina-3-CHIS ₆ usando un concentratore proteina centrifuga con una kDa MWCO 50 a ~ 15 mg / ml, valutata spettrofotometricamente utilizzando un coefficiente di estinzione calcolato (ε) di 109.320 M ^-1 cm ^{-1 <}/ Sup> (supponendo che tutti i residui di cisteina sono ridotti).
15. Per la conservazione a -20 ° C e conservare a lungo a -80 ° C, la proteina aliquota in provette per PCR e flash congelare i campioni in azoto liquido. In alternativa, la proteina può essere utilizzato direttamente per indagini utilizzando un numero di tecniche biochimiche e biofisiche.

Risultati

L'espressione larga scala di topo ricombinante kindlina-3 utilizzando cellule Sf9 baculovirus-infette può richiedere meno di due settimane per ottenere quantità milligrammo, come illustrato nello schema Figura 1A e richiede soltanto una piccola quantità di DNA plasmidico da un kit QIAprep Miniprep, per esempio. La generazione di baculovirus ricombinante si ottiene cotransfecting cellule Sf9 con il mouse kindlina-3 (FERMT3) contenenti plasmide con un bacmid linearizzato ingegnerizzato (BAC10: KO ₁₆₂₉₎ e raccogliendo i virioni neoformati dopo 5-7 giorni, come mostrato nella Figura 1A. Questo metodo di generazione baculovirus risultati in 100% virus ricombinanti e sostanzialmente eroga la necessità di purificazione di placca ^28,30. Una cultura rappresentante piccola scala (2 ml monostrato) genererà una soluzione contenente il virus ricombinante con un titolo virale previsto di unità formanti 1 x 10 ⁷ placca (pfu) per ml dicultura. Si può eseguire un saggio di placca per determinare il titolo virale reale, ma questo è forse troppo alta intensità di manodopera, quando un elevato numero di costrutti sono testati per studi strutturali. Il successo della fase di generazione di virus può essere valutato utilizzando un plasmide contenente eGFP in parallelo, o, per questo kindlina-3 costrutto, il monostrato Sf9 può essere risospeso in PBS e valutata mediante SDS-PAGE e western blotting, che dimostra tipicamente una netta banda corrispondente ad un 75 kDa proteina His-tag, come mostrato nella Figura 1B. Il virus viene successivamente amplificato per generare quantità sufficienti per larga scala (volumi litri) infezione di cellule di insetto e l'isolamento della proteina ricombinante. Il secondo virus passaggio (P2) è generato da infettare colture in sospensione con un MOI approssimativo di 0,1 (vedi protocollo). E 'fondamentale che l'amplificazione Sf9 coltura in sospensione occupa solo un ventesimo del volume totale pallone. Questo aerazione supplementare assicura che il vir risultanteci contenenti supporti, raccolto dopo 3 giorni (72 ore) post-infezione, genererà una quantità sufficiente di kindlina-3 nella cultura espressione successiva. Lo stock del virus amplificato (P2) si presume di possedere un titolo virale previsto di 2 x 10 ⁸ pfu / ml in base a una stima prudente di 100 pfu / cella utilizzando una densità cellulare di 2 x 10 ⁶ cellule / ml durante l'amplificazione ^31. Generalmente, per l'amplificazione ottimale baculovirus e la produzione di proteine, le cellule Sf9 devono essere uniformi per dimensioni e sferica, come mostrato nella Figura 1C. Inoltre, l'amplificazione e la proteina espressione virale è massima in 72 ore post infezione, ed entrambi sono significativamente ridotti in 96 ore post infezione.

Una volta che il virus è stato amplificato e utilizzato per infettare cellule Sf9 in esperimenti su larga scala ricombinante kindlina-3 è parzialmente purificato in virtù della sua ingegnerizzato C-terminale suo _6-tag mediante cromatografia di affinità metallo immobilizzatofase gassosa, come mostrato nella Figura 2. È importante effettuare la purificazione a 4 ° C e sono stati aggiunti che gli inibitori della proteasi sufficienti per impedire proteolisi. Il kindlina-3 parzialmente purificato viene ulteriormente purificato per quasi omogeneità mediante scambio cromatografia ionica (IEC) usando una colonna di eparina, come mostrato nella Figura 3. Abbiamo impiegato l'uso di una colonna di eparina invece di una colonna di scambio ionico convenzionale, come abbiamo previsto che il gran numero di residui basici, compreso un tratto di poli-lisina all'interno del dominio kindlina-3 F1, sarebbe interagire fortemente con i gruppi solfato carica negativa della colonna. Questa strategia è particolarmente utile per RNA-binding proteins-DNA e con le zone di base di acido nucleico vincolante, ad esempio il terminale-RNA vincolante uridylyltransferase Cid1 ^32. Infine kindlina-3 purezza è "lucido" di dimensioni cromatografia ad esclusione per rimuovere aggregati e omogeneizzazione, come mostrato nellaFigura 4. I buffer specificati nei protocolli sono tamponi standard frequentemente utilizzati nella purificazione della proteina per l'analisi strutturale. Generalmente, tamponi a base di fosfati sono evitati per la purificazione di proteine ​​per studi strutturali, soprattutto cristallizzazione di screening a causa della formazione di cristalli di fosfato nelle gocce di cristallizzazione (in particolare per esperimenti a 4 ° C). Tuttavia, abbiamo eseguito un saggio di spostamento termico basato Thermofluor per determinare quali tamponi sono stati stabilizzati per kindlina-3, come illustrato nella Figura 5. In breve, una soluzione di proteina purificata è diluita nel buffer che coprono un range di pH e sodio cloruri, quindi formando uno schermo da 2-dimensionale. La fusione della proteina viene misurata osservando la fluorescenza da Sypro colorante arancio (sonde molecolari), che si lega ai residui idrofobici all'interno del nucleo proteina ripiegata, per il range di temperatura 20-95 ° C (293-368 K). La temperatura media punto in cui the la proteina svolge (temperatura di transizione, T _m) è stato calcolato utilizzando il software Opticon Monitor ed è descritto altrove ^33. Kindlina-3 è stata osservata per essere stabile a concentrazioni di cloruro di sodio alta (500 mm) entro l'intervallo di pH 7,0-9,0, con una temperatura di transizione coerente (T _m) di 55 ° C. Inoltre è stato osservato che la T _m di kindlina-3 era di circa 55 ° C nell'intervallo di pH 7.0-7.5 indipendentemente dalla concentrazione di cloruro di sodio.

Abbiamo scoperto che c'era proteolisi limitata di kindlina-3 durante la purificazione ma l'analisi SDS-PAGE delle proteine ​​altamente concentrata (~ 15 mg / ml) ha dimostrato contaminazione limitata con due polipeptidi addizionali di uguale intensità. Stranamente, tuttavia non vi è alcuna indicazione di altre specie mediante cromatografia ad esclusione dimensionale, come mostrato in Figura 4. Si è quindi pensato che la proteina viene scalfito da proteasi ma rimane piegato e hydrodynamically indistinguibile dalla proteina full-length. È interessante notare, Calpain è una proteasi noto che scinde kindlina-3 a Tyrosine373, che è nel loop β1-β2 dell'omologia pleckstrin (PH) dominio ³⁴ e possono spiegare le nostre osservazioni. Inoltre, western blotting rivela che uno dei doppietti polipeptidiche possiede un C-terminale His-tag e il peso molecolare apparente del doppietto, quando sommati, uguale a 75 kDa, lo stesso peso molecolare della proteina nativa. La resa di purificato kindlina-3 ricombinante per litro di cellule Sf9 (~ 2 g di peso cellulare) è, nella migliore delle ipotesi, 5 mg.

Figura 1. Panoramica Panoramica delle cellule di insetto espressione della proteina eterologa baculovirus-infettati. (A) Un schematizzata di generatio baculovirusn ed espressione di kindlina-3 in cellule Sf9. Negli schemi vettore DNA, 5'UTR / ORF603 è colorato in rosso, il ORF1629 è colorata in verde e, il gene della proteina di interesse (POI) è di colore blu. (B) Western Blot, utilizzando un anti-His anticorpo _6, di sei piccoli (2 ml monostrato) culture (corsie etichettati secondo la cultura) di cellule che producono Sf9 baculovirus ricombinante e ricombinante kindlina-3 murino. (C) Immagine luce microscopia di cellule Sf9 sane coltivate in sospensione in Sf-900 II SFM integrato con antibiotici e trasferito in un piatto di coltura di tessuti e 35 mm (vedi protocollo). L'immagine è 20X di ingrandimento.

Figura 2. RAPPRESEpurificazione ntative di kindlina-3 da immobilizzato cromatografia di affinità metallo (IMAC). SDS-PAGE di nichel purificato per affinità ricombinante murino kindlina-3 espressa in baculovirus infettate cellule Sf9 (~ 2 g di peso cella). Proteina adsorbita è stata eluita con un gradiente di imidazolo (mostrato sopra il gel). Lanes sono etichettati come segue: MW, marcatore di peso molecolare; Lys, tutta lisato cellulare, FT, il flusso attraverso (non legato), WI, lavare 1; WII, lavare 2. Analisi Western blot (sotto) è stato effettuato anche utilizzando le frazioni di eluizione per confermare la presenza di ingegneria His-tag sulla proteina ricombinante. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Rappresentantidepurazione rappresentativo del kindlina-3 da eparina affinità e cromatografia. (A) profilo di eluizione osservata a 280 nm (blu) la visualizzazione di un singolo picco simmetrico eluizione sotto un gradiente di cloruro di sodio lineare (verde) utilizzando l'intervallo di concentrazione di NaCl di 0,05-1,0 M. ( B) analisi SDS-PAGE della eluizione frazionata dimostrare la presenza della proteina 75 kDa, kindlina-3 (K3 etichetta). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Rappresentativa cromatografia di gel filtrazione e concentrato kindlina-3. (A) gel filtrazione profilo di eluizione purificato kindlina-3 usandoun Superdex S200 (16/60) in Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM e 1 mM DTT a 20 ° C. Sulla base del volume di eluizione, kindlina-3 migra come previsto per una proteina di 75 kDa, suggerendo che è prevalentemente monomerico. (B) SDS-PAGE altamente concentrato ricombinante purificata kindlina-3 a 14,5 mg / ml. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Basato Thermofluor Figura 5. Saggio di spostamento termico per Buffer Screening. Kindlina-3 è stato diluito in vari buffer comprendenti uno schermo bidimensionale del pH rispetto alla concentrazione di cloruro di sodio. Temperature di transizione (temperatura punti medi) sono stati osservati per fluorescenza dellacolorante idrofobicamente legato, Sypro arancione (sonde molecolari) e calcolati utilizzando il software Opticon Monitor. (A) Un istogramma 3D delle temperature di transizione è tracciata con (B) il cambiamento della temperatura di transizione dalla media calcolata di 50,4 ° C. Per chiarezza, le barre sono colorate secondo la gamma di temperature a cui corrispondono. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Sistemi di espressione baculovirus stanno diventando sempre più popolare e uno strumento importante per la produzione di quantità milligrammo di proteina ricombinante per la caratterizzazione di proteine ​​mediante studi biofisici, tra cui cristallografia a raggi X. Pur essendo più esigenti sperimentalmente i sistemi di espressione baculovirus offrono diversi vantaggi rispetto E. coli uno dei quali è un ambiente quasi nativa per le proteine ​​di origine eucariotica esempio la presenza di accompagnatori e opportunità per modificazione post-traduzionale appropriate. Nei nostri sforzi per esprimere kindlina-3, padroni di espressione alternativi sono stati usati tra cui linee cellulari di mammifero e ceppi batterici di espressione (osservazioni non pubblicate). Generalmente, il numero E. coli ceppi testati prodotte piccole quantità di ricombinante kindlina-3 (~ 0,5 mg / L di cultura, osservazioni non pubblicate). Tuttavia, l'espressione baculovirus-driven in cellule di insetto è stato particolarmente efficace e, in comparison di espressione transiente in cellule di mammifero, più suscettibili di generare la grande biomassa necessaria per isolare una milligrammi di proteine ​​ricombinanti citoplasmatici (osservazioni non pubblicate). Noi ipotizziamo che la presenza accompagnatori eucariotiche possono consentire la produzione efficiente di kindlina-3.

Le Baculoviridae infettare cellule di insetto e per l'espressione della proteina ricombinante baculovirus utilizzato in questo lavoro è basata sul Autographa californica virus della poliedrosi nucleare (AcNPV). In natura il AcNPV, che infetta il Autographa californica (erba medica lopper) larve di insetti, richiede la proteina poliedrina per formare occlusioni cui i virons sono incapsulati in una matrice proteica cristallina fornendo così la protezione necessaria per il loro rilascio. In cellule in coltura non è necessaria la formazione di organi di occlusione per la replica ed è quindi superfluo. Nel caso di esprimere proteine ​​estranee gene della proteina poliedrina può essere replaced in un AcNPV ricombinante con il gene per la proteina di interesse. AcNPV può infettare altre specie di lepidottero e ai fini della proteina ricombinante espressione esercito verme Spodoptera frugiperda vengono utilizzati cellule ovariche di pupa. Nell'approccio qui delineato, il bacmid AcNPV (BAC10) è progettato in modo che un gene virale essenziale, ORF1629, è inattivata mediante l'inserimento di cloramfenicolo acetil transferasi conseguente bacmid knock-out (BAC10: KO _1629), tale che sia incapace di formare baculovirions infettive ^28. Cotrasfezione di cellule Sf9 con BAC10 linearizzato: KO _{il 1629} e il FERMT3 contenenti trasferimento vettoriali ripara il ORF1629 inattive, attraverso il recepimento, risultando in un genoma vitale che ha anche incorporato il gene FERMT3 sotto il controllo del promotore poliedrina ^28.

Descriviamo un protocollo di purificazione per l'isolamento di elevata purezza topo ricombinante kindlina-3 tramite un three passo approccio cromatografico. I metodi utilizzati qui possono essere facilmente applicati ad altre proteine ​​His-tagged. Abbiamo impiegato un passo scambio ionico per purificare ulteriormente kindlina-3 ma riteniamo che questo è un ulteriore passo pseudo-affinità come kindlina-3 presenta un gran numero di residui basici, compreso un tratto di poli-lisina nel suo dominio F1. Inoltre, è considerato kindlina-3 di legarsi e interagire con la faccia citoplasmatica della membrana plasmatica, dove funziona, e quindi si prevede che il raggruppamento di residui di base consentirà la proteina per contrastare la membrana carica negativa.

I buffer descritti nei protocolli di purificazione sono considerati standard e sono spesso utilizzati in biologia strutturale. Il saggio thermofluor (Figura 5) dimostra che kindlina-3 è stabile in condizioni di eccessiva suddetto tampone pH 6.0. Questo è stato particolarmente utile e importante per informare i nostri esperimenti nello studio kinldin-3: β1Una interazione coda mediante NMR, che ha dato ottimi spettri a pH 6.1 con basse concentrazioni di NaCl ^12.

Prima di ogni studio biofisico può essere intrapreso, è importante dimostrare che la proteina purificata di interesse è infatti piegata correttamente ed è funzionalmente attiva. In una precedente pubblicazione abbiamo dimostrato che la kindlina-3 ricombinante espressa e purificata con questo metodo è stato un monomero e monodisperso in soluzione, come valutato mediante cromatografia dimensione esclusione, dispersione della luce dinamica, ultracentrifugazione analitica e piccolo X-ray scattering angolo, ed era anche in grado di legare e riconoscere il NPxY membrana-distale e monte serina / treonina grappolo di β _1A code citoplasmatiche ^14, confermando così che si comporta come proteina nativa, che è in linea con precedenti studi cellulari e fisiologici ^14,20,22. L'uso di un saggio di stabilità termica è un ulteriore modo di suggerire the corretto ripiegamento di una proteina di interesse, come proteina correttamente ripiegata si tradurrà in un fondo elevato fluorescenza a causa di residui idrofobici esposti.

La famiglia kindlina delle proteine ​​è stato al centro di molta attenzione in quanto il loro ruolo inatteso come coactivators essenziali di integrine in vivo è stato scoperto. Questo ha innescato molto sforzo per esprimere loro ricombinante e risolvere le loro strutture. Fino ad oggi un successo limitato è stata riportata ad esprimere quantità milligrammi di piena lunghezza proteina ricombinante ma abbiamo qui descritto l'uso di un sistema di baculovirus che permette l'espressione larga scala a livelli dove studi strutturali diventano fattibili. Generando grandi quantità di ricombinante kindlina-3 possiamo anticipare che questo sarà di aiuto ulteriori studi su questa proteina. Il metodo e la purificazione workflow baculovirus-driven qui descritta per ricombinante murino kindlina-3 potrebbe anche essere usato per esprimere e purificare le altre isoforme kindlina, Che sono anche difficili da esprimere e anche possedere tratti poli-lisina, e può essere ulteriormente adattato per altre proteine ​​citoplasmatiche, quali le proteine ​​di legame di acido nucleico, che non riescono ad esprimere in ceppi batterici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid	Life Technologies	10902-096	store at 4 °C and warm to RT before use
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	10362-100	Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used
Streptomycin sulphate (solid)	Melford	S0148	Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
Penicillin G, potassium salt (solid)	Melford	P0580	Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate	Greiner Bio-One	657160
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10100-147
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8849	Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	D5025
HisTrap FF (5 ml)	GE Heathcare	17-5286-01	Requires an Äkta FPLC machine
HiTrap Heparin (5 ml)	GE Heathcare	17-0407-01	Requires an Äkta FPLC machine
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)	Millipore	UFC905024	15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator