Extracelular alambre Tetrodo grabación en el cerebro de Libremente caminar Insectos

Resumen

Anteriormente desarrolló una técnica para la implantación de cables tetrodo en el complejo central de los cerebros de las cucarachas que nos permite monitorear la actividad en unidades individuales de cucarachas atados. A continuación les presentamos una versión modificada de esa técnica que nos permite también registrar la actividad cerebral en el movimiento libre de insectos.

Resumen

El creciente interés en el papel de la actividad cerebral en el control motor de insectos requiere que seamos capaces de controlar la actividad neuronal mientras que los insectos realizan comportamiento natural. Anteriormente desarrolló una técnica para la implantación de cables tetrodo en el complejo central de los cerebros de las cucarachas que nos permitió registrar la actividad de múltiples neuronas simultáneamente mientras una cucaracha tethered resultó alterada o la velocidad al caminar. Mientras que un gran avance, los preparativos atados proporcionan acceso a los comportamientos limitados ya menudo carecen de procesos de retroalimentación que se producen en animales libres de movimiento. Ahora presentamos una versión modificada de la técnica que nos permite grabar desde el complejo central de moverse libremente cucarachas, ya que caminar en una arena y hacer frente a los obstáculos girando, subiendo o túneles. Junto con el vídeo de alta velocidad y el corte de clúster, ahora podemos relacionar la actividad cerebral a diversos parámetros del movimiento de los insectos comportarse libremente.

Introducción

En este artículo se describe un sistema exitoso para la grabación de las neuronas en el complejo central (CC) de la cucaracha, discoidalis Blaberus, como el insecto camina en una arena y se ocupa de los objetos que hacen que la vuelta, túnel bajo, o pasar por encima de obstáculos. Los cables también pueden ser conectados a un estimulador para evocar la actividad en el neuropilo circundante con los consiguientes cambios de comportamiento.

Durante la última década una considerable atención se ha dirigido a las funciones que desempeñan las diversas regiones del cerebro en el control del comportamiento de los insectos. Gran parte de esta atención se ha dirigido hacia los neuropils cerebrales de la línea media que se conocen colectivamente como el complejo central (CC). El progreso ha sido hecha como resultado de la amplia variedad de técnicas dirigidas a preguntas sobre el papel de la CC en el comportamiento. Esas técnicas van desde la manipulación neurogenéticos, principalmente en Drosophila, junto con behavianálisis oral de ^1-3, a las técnicas electrofisiológicas que supervisan la actividad de los nervios dentro de la CC y el intento de relacionar esta actividad con los parámetros de comportamiento pertinentes.

Técnicas electrofisiológicas incluyen registro intracelular de las neuronas individuales identificadas ^4-9 y registro extracelular, a menudo con sondas multicanal ^10,11. Estas dos técnicas son complementarias. Registro intracelular con electrodos afilados o parche de células enteras ofrece datos muy detallados sobre las neuronas identificadas, pero se limita a una o dos celdas a la vez, requiere un movimiento limitado o no, y puede mantenerse durante períodos de tiempo relativamente cortos. Registros extracelulares se pueden configurar fácilmente, no requieren moderación, y se puede mantener durante horas. Con tetrodos multicanal y de corte clúster, bastante grandes poblaciones de neuronas se pueden analizar simultáneamente ^9,12. Mientras patc células enterash ha sido utilizado con éxito en los insectos cautivos ^13, nos parece que también hay una necesidad de técnicas que nos permiten grabar la actividad neuronal en el cerebro durante largos períodos de tiempo en comportarse libremente insectos ya que frente a las barreras al movimiento de avance.

La necesidad de registrar como los movimientos de insectos y sube y baja nos empujó hacia métodos de grabación extracelular. Hemos tenido buena grabación éxito en preparaciones y fijados con los disponibles comercialmente sondas de 16 canales de silicio ^11, sin embargo, el pequeño tamaño de incluso cucarachas grandes significa que las sondas tienen que ser montado fuera del cuerpo. Eso, junto con la delicadeza de las puntas de la sonda, los hacía inapropiados para una preparación gratuita a pie. En dos proyectos anteriores, se utilizaron fardos de alambres finos que forman un tetrodo de lograr propiedades de grabación similares pero en un acuerdo más sólido. Estos paquetes tetrodo nos permitieron grabar desde cucarachas atados unad relacionar la actividad de la unidad de CC a los cambios en la velocidad al caminar ¹⁴ y girando el comportamiento resultante del contacto antenal con una varilla de ^10.

Tan útil como estos preparados cautivos han sido y seguirán siendo, lo hacen presentar algunas limitaciones. En primer lugar, los comportamientos que el insecto puede realizar se limitan a un plano. Es decir, podríamos evocar fácilmente los cambios en la velocidad al caminar o de inflexión, pero las acciones de escalada y túneles no fuera posible, al menos con la disposición típica correa. En segundo lugar, los preparativos están atados "lazo abierto". Es decir, que no permiten la normal de movimiento relacionados con retroalimentación al sistema. Por lo tanto, como la cucaracha encendido nuestra correa de sujeción, su mundo visual no se alteró en consecuencia. Es posible construir sistemas de sujeción de lazo cerrado para introducir este tipo de comentarios. Sin embargo, están limitados por la complejidad de la programación y el hardware del entorno visual simulado. Nevertheless, sentimos que podíamos mejorar nuestros métodos de grabación atados existentes mediante el registro del animal, ya que caminaba libremente en un escenario o pista y objetos encontrados como lo haría en su entorno natural.

Aunque los sistemas inalámbricos para el registro de la actividad cerebral ¹⁵ sería ideal, los sistemas actuales tienen limitaciones en el número de canales de grabación, el tiempo de adquisición de datos, la vida de la batería y el peso. Nosotros, por lo tanto, optamos por tratar de adaptar nuestro sistema de registro tethered para su uso en el movimiento libremente preparativos. Como mejores sistemas inalámbricos estén disponibles, esta técnica se puede adaptar fácilmente a tales dispositivos. El sistema que se describe en este artículo es de peso ligero, funciona muy bien y parece tener poco efecto perjudicial sobre el comportamiento de la cucaracha. Con una cámara de alta velocidad de bajo costo y software de corte de clúster, la actividad en las neuronas individuales del cerebro puede estar relacionado con el movimiento. Aquí se describe la prepación de los cables tetrodo y su implantación en el cerebro del insecto, así como las técnicas de grabación de la actividad eléctrica y el movimiento y cómo esos datos pueden ser reunidos para su posterior análisis.

Protocolo

1. Preparación de Cables tetrodo

1. Saque un alambre de nicrom muy delgada (12 m de diámetro, revestimiento PAC) de alrededor de 1,1 m de longitud. Adjunte una etiqueta de cinta a cada extremo. Colgar el alambre sobre una varilla roscada horizontal de tal manera que los dos extremos están a la misma altura, cerca de la mesa de trabajo.
2. Repita el paso 1.1 para un segundo cable, haciendo dos extremos más para un total de 4, y colocarlo al lado del primer alambre (aproximadamente 1 cm entre ellas).
3. Pegue las cuatro extremos junto con una etiqueta de cinta y adjuntar la etiqueta a un dispositivo de enrollamiento rotativo motorizado. Este dispositivo se puede hacer de un motor de corriente continua de bajo costo.
4. Enrollar el tetrodo en una dirección durante 2 min (60 rpm) y descansar en la dirección opuesta para 30 seg.
5. Utilice una pistola de calor para fundir los cables juntos. No toque los cables con el arma. Utilice tres arriba y abajo pasa de sentido alterno, con cada pasada de tomar alrededor de 10 segundos.
6. Cortar la parte superior y la parte inferior de los cables de la herida. Los cuatro cables están trenzados unad fusionado en un extremo, pero separar en el otro.
7. Añadir al tubo de soporte. Cortar una longitud de 30 cm de tubo de polietileno (diámetro: 0,28 mm en el interior, fuera de 0,61 mm). Pase el tetrodo muy lentamente y con cuidado en el tubo de soporte de forma que no se doble.
8. Una vez que el extremo fusionado aparece por el otro lado, tire de ella a través de modo que haya una longitud igual de alambre en ambos extremos del tubo de guía.
9. Tome el extremo separado de cada cable con una pinza. Utilizando la base de la llama de un quemador de gas, quemar cuidadosamente el aislamiento de de los últimos 2 o 3 mm de cada cable. Calentar el alambre hasta que se ilumina, pero no se enrosca.
10. Conecte el tetrodo con un adaptador de enchufe IC hombre-mujer que se adapta a su dispositivo de grabación. Ponga el extremo deinsulated de cada cable en una toma de corriente diferente de adaptador con un fórceps. Estabilizar el cable en el zócalo con un pequeño alfiler de bronce. Utilice un soldador de punta fina y llenar el zócalo con la soldadura fundida. Tenga cuidado de no ponerse en contacto conel hilo frágil con el soldador.
11. Compruebe la impedancia de cada cable y la impedancia de entre cada par de cables.
    1. Coloque el fusionado, extremo trenzado en un recipiente de solución salina y conectar un conductor de alambre de cobre de la solución salina a la metro ohmios.
    2. Conectar el otro extremo de la metros a la clavija de caja que contiene el cable. La impedancia de cada hilo debe ser inferior a 3 MΩ.
    3. Si no se alcanzan los valores anteriores, volver a intentar las conexiones de soldadura.
    4. Retire los cables de la solución salina, enjuague la punta con agua, y poner a prueba la impedancia entre hilos para cada pareja (n = 6). La impedancia entre debería estar por encima de 5 MΩ.
    5. Si no se alcanzan los valores anteriores, cortar una pequeña cantidad de la punta fuera al final condensado y vuelva a probar.
    6. Deseche todo el conjunto de cables que no cumpla con los dos requisitos de impedancia de todos los cables.
12. Asegure el tetrodo.
    1. Doble una pequeña caja de papel rectangular slightly más grande que el adaptador de enchufe.
    2. Transferir el adaptador en la caja con el lado masculino en el fondo. Penetrar en la caja de tal manera que todos los pines de la parte masculina están fuera de la caja, mientras que el resto del adaptador es dentro del área.
    3. Pegue las esquinas de la caja en la parte exterior. Use pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara en la parte interior de la caja para estabilizar las hebras individuales de alambre. El cable debe estar fusionado a medida que sale de la caja.
    4. Mezclar fraguado rápido 2 part epoxy y se vierte en la caja para asegurar el adaptador y todos los cables.
    5. Una el extremo cercano del tubo de guía a un lado de la caja con cera dental, pero dejar el tubo de abrir de manera que el tetrodo se puede extraer a través libremente en ambos extremos.
13. Afilar la tetrodo.
    1. Antes de cada experimento, corte la punta del tetrodo con una hoja de bisturí, no tijeras. Esto evita que la trituración y ensanchamiento de los extremos del cable mientras que proporciona un borde plano limpio para el siguiente paso.
       1. Utilice una pequeña herramienta rotativa montada verticalmente con discos de lijado de grano medio y fino (estos se pueden combinar en una sola plataforma) para pulir el tetrodo y eliminar algunas de aislamiento extremo. Sostenga el paquete cerca de su extremo con una pinza. Incline el extremo fijado a un alambre de 45 º de ángulo con respecto al disco de lijado y suavemente tocar el disco giratorio velocidad moderada durante 1 o 2 segundos cada uno en el medio y luego las finas arenas. Repita esto tres veces más, axialmente girar el haz de 90 ° cada vez. Es crítico que la dirección de giro de los discos de lijado es de distancia desde el ángulo poco profundo de los extremos de los cables, de lo contrario se puede producir la separación de los alambres.
       2. El resultado deseado se transforma el extremo paquete desde un borde recto a un extremo en punta con pequeñas cantidades de aislamiento retirados desde el extremo de cada cable. Verifique el punto usando un microscopio de disección de las placas, el tetrodo. Si nota algún rasguño se produce en la punta, volver a cortar y repulir.
       3. Si las pruebas de impedancia durante el subsequpaso de chapado ENT muestra los valores de alambre inter extremadamente bajos (menos de 4 MΩ), que indica demasiado material eliminado durante la etapa de pulido. Volver a cortar y repulir el tetrodo.
    2. Placa del tetrodo. Ponga la punta de la tetrodo en una solución saturada de sulfato de cobre (85 ml de agua, 5 ml de ácido sulfúrico, 50 g de sulfato de cobre). Placa de cada alambre con una corriente de 2,5 μA con un aislador de estímulo. Se inyecta la corriente durante 1 segundo, hacer una pausa durante 1 segundo y repetir este proceso 4x.
    3. Compruebe la impedancia de cada cable y la interimpedance de cada par de cables. La impedancia de cada cable debe estar entre 0,5 a 1 MΩ y el inter impedancia deben estar por encima de 4 MΩ.
    4. Monte el adaptador en el headstage de un sistema de grabación de múltiples canales.
    5. Coloque un alfiler de insectos doblada a un micromanipulador. Coloque la punta del tetrodo a la clavija de insectos con cera dental

2. Preparación de los animales

1. Se anestesia lacucaracha con hielo.
2. Después de la cucaracha deja de moverse, frenar la cucaracha en posición vertical en una superficie plana de corcho con alfileres de la silla de montar grandes que se sitúan en el insecto, pero no penetran en cualquier parte de su cuerpo.
3. Transferir la preparación en un recipiente de plástico y colocar hielo alrededor del animal para minimizar el flujo de la sangre y los movimientos del cuerpo.
4. Coloque un aro de plástico en el cuello para apoyar la cabeza y colocar la cera dental alrededor de la cabeza para estabilizarlo.
5. Cortar una pequeña ventana entre los ocelos con una hoja de afeitar y eliminar la cutícula de la cabeza.
6. Quite los tejidos conectivos y la grasa con un fórceps para exponer el cerebro.
7. Coloque un poco de solución salina cucaracha en la cápsula de la cabeza para cubrir el tejido cerebral.
8. Para desheath el cerebro, utilizar una pinza fina para agarrar suavemente la vaina en la parte superior del cerebro y utilizar otros pinzas finas para rasgar la funda de separación, en la zona implantada alambre.
9. Abra un pequeño agujero en la cápsula de la cabeza por delante del ingenio cerebralh un pin de insectos. Inserte una trenza de tres diámetros más grandes (56 mM) con aislamiento de cables de cobre en el orificio para servir como un electrodo de referencia / suelo.
10. Bajar la punta de la tetrodo a la superficie del cerebro con el micromanipulador y colocarla cerca de la región del cerebro de interés.
11. Colocar con cuidado dos pequeños trozos de hoja delgada de etilo (2 mm x 1 mm), ligeramente más grande que el agujero en la cápsula de la cabeza, anterior y posterior a la tetrodo.
12. Encienda el sistema de grabación.
13. Lentamente baje la tetrodo 150-250 micras por debajo de la superficie del cerebro en función de la calidad de grabación.
14. Apague el sistema de grabación.
15. Mueva las dos piezas de lámina de acetato tan cerca del tetrodo posible sin tocarlo (Figura 1A).
16. Caliente una pequeña espátula o una aguja hipodérmica aplanada y ponerlo en cera dental de manera que hay cera líquida en la punta de la espátula. Tocar con cuidado el extremo de cada pedazo de lámina de acetato de latetrodo con la espátula de modo que la cera líquida puede fluir en cada pieza y sellar la brecha entre ella y la cutícula cabeza.
17. Repita paso de 2.16. Caída de una pequeña cantidad de cera líquida sobre la hoja de etilo cada vez. Inicie el proceso de lejos del tetrodo y avanzar gradualmente hacia ella. Finalmente, el tetrodo se anclará por la cera dental. Evite que la cera caliente en la cavidad y en el cerebro.
18. Utilice el mismo método que en los pasos 2,16 y 2,17 para anclar el electrodo de referencia / suelo con cera.
19. Calentar la cera que une el tetrodo a la micromanipulador para liberar el tetrodo de ella.
20. Pase el tetrodo en la cera dental en la cabeza para proporcionar un alivio de tensión (fig. 1B).
21. Cubra el bucle de anclaje con cera dental (Figura 1C).
22. Retire con cuidado las limitaciones y transferir la preparación en una placa de Petri. Restringir el lado dorsal preparación con grandes pins sillín.
23. Adjuntaruna varilla al pronoto con una pistola de pegamento. Este es un palo de madera que se extiende desde el pronoto sobre el abdomen.
24. Coloque la punta de la tubería de tetrodo para el extremo posterior de la varilla con cera dental.
25. Ancla el tetrodo y el electrodo de referencia / suelo para el extremo anterior de la varilla con cera dental.
26. Tire del tetrodo desde el extremo del zócalo de la tubería tanto como sea posible, pero no tirar de ella, con el fin de eliminar la posibilidad de que el animal puede dañar la parte de la tetrodo fuera del tubo (Figura 1D).
27. Eliminar todas las restricciones. Conecte el electrodo de referencia / tierra al tubo tetrodo con cera dental.
28. Espere al menos 60 minutos para que el animal se recupere de la anestesia hielo antes de cualquier experimento.

3. Procedimientos Experimentales

1. Conecte un PC tanto con el sistema de grabación y una luz LED usando un cable USB a puerto serie.
2. Comience grabaciones neuronales.
3. Comience grabaciones de vídeo a 20 fotogramas por segundo para caminar experimentos utilizando el paquete de adquisición de imágenes Motmot ¹⁶ o 120 fps para la escalada experimentos usando una cámara de alta velocidad.
4. Coloque la cucaracha en un 40 cm x 40 cm Plexiglas arena para los experimentos a pie o un 58 cm de largo, 5 cm de ancho y 5 cm de alto de la arena para subir experimentos. La arena caminar tiene una barrera transparente que se extiende desde el centro de la pared de la derecha del centro de la arena, por encima del cual la headstage se encuentra. La barrera se utiliza para evitar que los animales caminar en áreas donde la vista de la cámara se bloquea por el headstage. El rocódromo tiene un bloque acrílico (ya sea de 1,2 cm o 1,8 cm de alto y 5 cm de ancho) o un estante situado a una altura comparable en el centro.
5. Generar un pulso TTL desde el PC utilizando un comando de MATLAB personalizada. (S = serial ('COM4'); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = "on" /; fclose (s), delete (s) ;). El pulso TTL genera vecesapisonar para el sistema de grabación y, o bien se enciende o se apaga la luz LED.
6. Permitir la cucaracha para explorar la arena hasta que deja de moverse durante más de 30 segundos para los experimentos para caminar. Deje que la cucaracha ya sea subir sobre el bloque / plataforma o túnel a través de la plataforma para la escalada experimentos.
7. Deje de grabaciones de vídeo.
8. Detener grabaciones neuronales.
9. Anote la fecha y hora generada por el pulso TTL.
10. Retire la cucaracha de la arena y esperar al menos 3 min.
11. Repita los pasos 03.02 a 03.10 para la próxima prueba.
12. Una vez que todas las grabaciones se han completado, pasar 5 segundos de la corriente 5 μA DC a través de una de las puntas de alambre (ánodo) y el electrodo de referencia (cátodo) para depositar cobre en el cerebro en la punta del alambre.

4. Análisis Desconectado

1. Sincronizar los datos neuronales vídeo y vinculando el marco que se ha cambiado la luz LED y la marca de tiempo registrados por el sistema de grabación enese momento.
2. Ubicaciones punta del alambre Marcar. Utilice los procedimientos de intensificación Timms para precipitar y observar el cobre en 12 m de serie de secciones ^17. Depósitos prominentes deben ser visibles en 3-8 secciones adyacentes (alrededor de 18-48% de la longitud del plano ventral dorsal de la zona que grabar desde) (Figura 2).
3. Correlacionar los impulsos eléctricos específicos a la actividad de las neuronas individuales. Siga pico procedimientos de clasificación establecidos en detalle en otra parte ^10,14,18. Utilice el programa KlustaKwik (versión 1.5, autor K. de Harris, de la Universidad de Rutgers) para generar, la agrupación automatizada inicial. Importarlos en el programa MCLUST (versión 3.5, los autores AD Rojizo et al., Universidad de Minnesota) para su posterior refinamiento y análisis (Figura 3).
4. Seguimiento de los movimientos de la cucaracha. Para los experimentos de caminar, extraer la posición de (visual) Centro de la cucaracha de la masa y la orientación del cuerpo en cada cuadro de la vidgrabaciones eo utilizando el Caltech múltiple Fly Tracker (versión 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) y la caja de herramientas FixErrors asociado para MATLAB ^19. Para escalar experimentos, extraer la posición del bloque y la cabeza y el pronoto de la cucaracha en cada fotograma del vídeo, utilizando el paquete de software de análisis de movimiento.

Resultados

Se registró la actividad neuronal de 50 unidades de la CC en 27 preparativos para experimentos para caminar. Para 15 de esos preparados (23 unidades), también se llevaron a cabo experimentos de escalada. Las unidades individuales se nombran de acuerdo a los números de la preparación y de la unidad (por ejemplo, unidad de 1-2 indica la preparación 1, unidad 2).

Las instantáneas de vídeo de un ensayo de escalada se muestran en la Figura 4. Todo el video está d...

Discusión

Mientras que los estudios electrofisiológicos anteriores sobre la CC o de otras regiones del cerebro del insecto nos han proporcionado conocimientos sobre la central de control de la conducta, la mayoría de ellos fueron realizados en cualquiera de los preparativos restringidos ^9,11 o los atados ^10,14. Como resultado, el de la experiencia sensorial y el estado fisiológico del animal podrían ser muy diferentes de los de un entorno natural. Por otra parte, las tareas de comportamiento que el anima...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis