自由に昆虫を歩くの脳における細胞外ワイヤーテトロード録音

要約

我々は以前、私たちはつながれたゴキブリの個々のユニットでの活動を監視することを可能にするゴキブリの脳の中心複合体に四極電線を移植するための技術を開発しました。ここでは、私たちが自由に虫を移動させる際に、脳の活動を記録することを可能にする技術の修正版を提示します。

要約

昆虫モータ制御における脳活動の役割の関心の高まりは、我々は昆虫が自然な行動を実行しながら、神経活動をモニターすることができることが必要です。我々は以前つながゴキブリは歩行速度を回したか、変更されている間、私たちは、同時に複数のニューロンからの活動を記録するために許可されたゴキブリの脳の中心複合体に四極電線を移植するための技術を開発しました。大きな進歩が、テザリングの製剤は、限定された行動へのアクセスを提供し、多くの場合、自由に動物を移動させる際に発生するフィードバック·プロセスを欠いている。我々は今、彼らは競技場の中を歩くと、登山やトンネリングを回しての障壁に対処するように、私たちは自由に動くゴキブリの中心複合体から録音することができ、その技術の修正版を提示します。高速ビデオおよびクラスタ切断と相まって、我々は今、自由に行動する昆虫の動きの様々なパラメータに脳の活動を関連付けることができます。

概要

この記事では、昆虫は、それが好転する可能性のオブジェクトとアリーナとお得な情報を歩くの下 ​​にトンネルや障害物を乗り越えるようにゴキブリの中心複合体（CC）、Blaberusのdiscoidalis、内のニューロンから記録するための正常なシステムが記載されている。ワイヤはまた、その結果としての行動変化と周囲の神経網の活動を呼び起こすための刺激装置に接続することができます。

過去10年間にわたり、かなりの注意が昆虫の行動を制御する際に、様々な脳領域が果たす役割に向けられてきた。この焦点の多くは、集合的に、中央複合体（CC）と呼ばれる正中脳neuropils向けられてきた。進展が行動に、CCの役割について疑問をターゲットに技術の広い品種の結果としてなされたものである。これらの技術は、behaviと相まって、主にショウジョウバエの神経遺伝的操作、、の範囲にCCと行動の関連パラメータに、そのアクティビティを関連付けるための試みの中に神経活動をモニターする電気生理学的手法に経口分析^1-3。

電気生理学的手法は、多くの場合、マルチチャネル·プローブ^10,11と、個々の識別されたニューロン^4-9と細胞外記録からの細胞内記録が含まれています。これら2つの技術が無料でご利用いただけます。鋭い電極またはホールセルパッチを有する細胞内記録は、識別されたニューロンに非常に詳細なデータを提供するが、一度に1つまたは2つの細胞に限定され、制限された又は全く動きを必要とし、比較的短時間にわたって維持することができる。細胞外記録は簡単に拘束を必要としない、設定することができ、かつ時間維持することができます。マルチチャンネルtetrodesおよびクラスタ切断して、神経細胞のかなり大きな集団が同時に^9,12分析することができます。しばらく全細胞PATCHが正常につながれた昆虫¹³で使用されてきた、我々は、彼らが前進への障壁に対処するように、私たちは自由に昆虫を振る舞うにおける長時間の脳内の神経活動を記録することができるように技術の必要もあると感じています。

昆虫が移動し、最大バウンス上下として記録する必要は、細胞外記録方法に向かって私たちを押した。我々は商業的に入手可能な16チャンネルのシリコンプローブ¹¹で拘束の準備で良いの成功記録を持っていた、しかし、大きくてもゴキブリの小さいサイズは、プローブは、本体の電源を搭載しなければならないことを意味します。つまり、プローブ歯の繊細さと相まって、無料のウォーキングの準備のためにそれらが不適切た。 2以前のプロジェクトでは、我々は同じような記録特性を達成するために四極を形成する細線の束を使用しますが、より堅牢な配置で。これら四極管の束は、私たちはつながゴキブリから録音することができスピード^14を歩いて、ロッド¹⁰との触角の接触から生じる行動を回すの変化に、CCユニットの活動を関連付けるdは。

これらの繋留の準備がされているとあり続けるだろうとして有用であると、彼らはいくつかの制限を提示しております。まず、虫が実行できる行動は一つの平面に制限されています。それは我々が容易に歩行速度や回転の変化を呼び起こす可能性があるが、登山やトンネルのアクションは、少なくとも一般的なテザーの配置と、不可能であった。第二に、私たちの繋留の製剤は、「オープンループ」である。つまり、彼らはシステムに通常の移動に関連するフィードバックを許可していない、です。ゴキブリは私たちのテザーにオンしたがって、その視覚世界は、それに応じて変化しなかった。なお、この種のフィードバックを導入するために、閉ループテザーシステムを構築することができる。しかしながら、それらは、シミュレートされた視聴環境のプログラミングやハードウェアの複雑さによって制限される。 NeverthelesS、我々はそれが競技場トラック内を自由に歩いて、それは、その自然環境の中で同じようにオブジェクトを検出しましたように我々は動物から記録することにより、当社の既存つなが記録方式を改良できると感じました。

脳活動^を記録するための¹⁵の無線システムが理想的であろうが、現在のシステムは、記録チャネルの数、データ収集、バッテリ寿命および重量の時間的制限がある。我々は、それゆえ、自由準備を移動させる際に使用するために私達のつなが記録システムを適応させることを試みることにしました。良好な無線システムが利用可能になるように、この技術は、容易にこのような装置に適合させることができる。この資料に記載されているシステムは、軽量で非常にうまく機能し、ゴキブリの行動にほとんど悪影響を有すると思われる。安価な高速度カメラおよびクラスタ切断ソフトウェアでは、個々の脳のニューロンにおける活動は運動に関連させることができる。ここでは、た準備を説明四極ワイヤーや昆虫の脳内に注入だけでなく、電気的活動や運動のための記録技術のATIONとどのようにそれらのデータは、その後の分析のために一緒にすることができます。

プロトコル

1。四極ワイヤーの作製

1. 約1.1メートルの長さの非常に薄いニクロム線（12μmの直径、PACコーティング）を引き出します。両端にテープタグを添付してください。両端はベンチトップの近くに同じ高さになるように横ネジ棒の上にワイヤーを掛ける。
2. 4、合計2以上の端部を作り、第2のワイヤのためのステップ1.1を繰り返し、次の第一ワイヤ（間に約1cm）に配置します。
3. テープタグと一緒に4端を固執し、電動回転巻取装置にタグを添付してください。この装置は、安価なDCモータから作製することができる。
4. 2分（60回転）のために一方向に四極を風や30秒間逆方向におくつろぎください。
5. 一緒にワイヤーを融合さヒートガンを使用してください。銃で電線に触れないでください。各パスには約10秒を取って、上下に渡し、交互方向からの3を使用してください。
6. トップと傷線の下部をカットします。 4本のワイヤがねじれているdは一端で互いに融合し、他で区切る。
7. 支持管を追加します。ポリエチレン管（：0.28ミリメートル、外で0.61ミリメートル、内径）の30cmの長さに切る。それがよじれないように、支持管に非常にゆっくりと慎重に四極管を通します。
8. 融合された端部が他方の側を表示されたら、ガイドチューブの両端のワイヤの等しい長さがあるように、それを介して引っ張る。
9. ピンセットで各ワイヤの別々の終わりをつかむ。ガスバーナーの炎のベースを使用して、慎重に各ワイヤの最後の2または3ミリメートルの外断熱材を燃やす。それが点灯するまで、ワイヤを加熱するのが、カールしていません。
10. 録音デバイスに合った男女ICソケットアダプタで四極管を接続します。ピンセットで、アダプタの異なるソケットに各ワイヤのdeinsulated終止符を打つ。小さな真鍮のピンとソケットに電線を安定させる。細かい点はんだごてを使用し、溶融した半田でソケットを埋める。接触しないように注意してくださいはんだごてで壊れやすい線。
11. 各ワイヤのインピーダンスと配線の各ペアの間のインピーダンスを確認してください。
    1. 生理食塩水の容器の中に融合させ、ねじれた端を置き、抵抗計に生理食塩水から銅線導体を接続してください。
    2. ワイヤの入ったソケットピンにメーターのもう一方の端を接続します。各ワイヤのインピーダンスを3MΩ未満である必要があります。
    3. 上記の値が達成されていない場合は、はんだ接続を再試行。
    4. 、生理食塩水から電線を取り除くには、水でのヒントをすすぎ、それぞれのペアリングのためのインターワイヤーインピーダンスをテスト（N = 6）。相互インピーダンスは5MΩ以上である必要があります。
    5. 上記の値が達成されていない場合は、融合された最後にチップオフの少量をスライスして再テストします。
    6. 線のすべてのためのインピーダンスの両方の要件を満たしていない任意のワイヤ·セットを廃棄します。
12. 四極管を固定します。
    1. 小さな長方形の紙箱sligを折るソケットアダプタよりhtly大きい。
    2. 下部のオス側をボックスにアダプタを移す。アダプターの残りの部分はボックス内にある間にオス側のすべてのピンがボックスの外側になるようにボックスを貫通している。
    3. 外側の箱の角をテープで固定します。ワイヤーの任意の個々の鎖を安定化するために箱の内側に両面粘着テープの小片を使用してください。それは箱を出るとき、ワイヤが溶融しなければならない。
    4. 高速のセット2液型エポキシを混合し、アダプターとすべてのワイヤを固定するために箱に注ぐ。
    5. 歯科用ワックスとのエリアのサイドにガイドチューブの近端を取り付けますが、チューブが四極管の両端で自由に通って引っ張ることができるようにオープンにしてください。
13. 四極管を研ぐ。
    1. 各実験の前に、鋭いメスの刃ではなく、ハサミで四極管の先端をカットします。これは、次の工程のためにクリーンなフラットエッジを提供しながら粉砕し、ワイヤ端部の先細防止する。
       1. 小さな回転工具は、四極管を磨くといくつかの先端の絶縁を削除する（これらは1プラットフォーム上で組み合わせることができます）培地と細かいグリットサンディングディスクで垂直に取り付け使用してください。鉗子との終わり近くにバンドルを保持する。サンディングディスクに対して45°の角度にワイヤーセットの端を傾け、静かに培地上にそれぞれ約1〜2秒程度の速度で回転するディスクに触れてから、罰金グリッツ。軸方向にバンドル90°毎回回転、この3回繰り返します。そうでなければ、ワイヤの分離が発生する可能性があり、サンディングディスクのスピンの向きが離れてワイヤ端の浅い角度からのものであることが重要です。
       2. 望ましい結果は、各ワイヤの末端から除去絶縁少量の尖った先端にストレートエッジからバンドル端を変換します。四極管をメッキする前に、解剖顕微鏡を使用してポイントを確認してください。任意のほつれが先端で発生した場合は、再切断およびrepolish。
       3. もしsubsequ時のインピーダンス·テスト耳鼻咽喉科めっき工程が極めて低いインターワイヤー値（MΩ4未満）を示し、研磨工程中に除去すぎる材料を示す。四極を再編集し、repolish。
    2. 四極管プレート。飽和硫酸銅溶液（85 mlの水、5ミリリットルの硫酸、50グラムの硫酸銅）に四極管の先端を置く。プレート刺激アイソレータで2.5μAの電流で各ワイヤ。 、1秒間電流を注入1秒間休止し、このプロセス4Xを繰り返します。
    3. 各ワイヤとワイヤの各ペアのinterimpedanceのインピーダンスを確認してください。各ワイヤのインピーダンスは0.5〜1MΩ間インピーダンスは4MΩを超えるべきであるべきである。
    4. マルチチャンネル記録方式のヘッドステージ上にマウントアダプター。
    5. マイクロマニピュレータに曲がった虫ピンを取り付けます。歯科用ワックスと虫ピンに四極の先端を取り付け

2。動物の準備

1. 麻酔をかける氷とゴキブリ。
2. ゴキブリは移動を停止した後に、昆虫にまたがる大規模なサドルピンと平らなコルク表面に対して垂直にゴキブリを抑えるが、その身体の一部に浸透しない。
3. プラスチック容器に移す準備をし、血流や体の動きを最小限に抑えるために、動物の周囲に氷を置く。
4. 頭をサポートし、それを安定させるために頭の周りに歯科用ワックスを配置するために、首のプラスチックカラーを配置します。
5. かみそりの刃で単眼の間に小さなウィンドウをカットし、頭部からキューティクルを削除します。
6. 脳が露出するようにピンセットで結合組織や脂肪を取り除きます。
7. 脳組織をカバーするために頭部カプセルにいくつかのゴキブリ生理食塩水を入れます。
8. 脳をdesheathするには、静かに脳の上にシースをつかむと、電線に移植領域に離れてシースを引き裂くために、別の細かい鉗子を使用するように細かい鉗子を使用しています。
9. 脳のウィットに頭部カプセル前方に小さな穴を開けH虫ピン。参照/接地電極として機能するように穴に銅線を絶縁し3より大きい直径（56ミクロン）の三つ編みを挿入します。
10. マイクロマニピュレータに脳表面に四極管の先端を下げて、関心のある脳領域の近くに配置します。
11. 慎重に四極管に薄いアセテートシートの2つの小片頭部カプセルの穴よりもわずかに大きい（2ミリメートル×1 mm）で、前部と後部に配置します。
12. 記録システムの電源をオンにします。
13. ゆっくり記録品質に応じて、脳の表面の下に四極管150〜250程度を下げる。
14. 記録システムの電源をオフにします。
15. （ 図1A）、それに触れることなく、可能な四極に近いアセテートのシートの2枚を移動します。
16. 小さなへらを加熱したり、皮下注射針を平らにし、ヘラの先端の液体ワックスが存在するように歯科用ワックスに入れて。丁寧にからアセテートのシートの各部分の遠端に触れる液体ワックスは、各片に流入し、ヘッドキューティクルの間の隙間をシールすることができるように、へらで四極。
17. ステップ2.16を繰り返します。アセテートシート上に毎回液体ワックスを少量をドロップします。遠く四極管から処理を開始し、それに向かって徐々に移動します。最終的には四極管は、歯科用ワックスによって固定されます。空洞内に、脳にホットワックスが出るのを避けるため。
18. ワックスで参照/接地電極を固定する2.16と2.17の工程と同じ方法を使用します。
19. そこから四極管を解放するためにマイクロマニピュレーターに四極を添付し、ワックスを加熱する。
20. ループストレインリリーフ（ 図1B）を提供するために、頭の上に歯科用ワックスに四極。
21. 歯科用ワックス（ 図1C）とストレインリリーフループをカバーしています。
22. 慎重に制約を削除し、ペトリ皿に準備を転送します。大型サドルピンと準備背側を拘束する。
23. 添付するグルーガンを使って前胸背板に棒。これは腹部の上前胸背板から延びている木の棒である。
24. 歯科用ワックスとロッドの後端に四極管の先端に取り付けます。
25. 歯科用ワックスとロッドの前端に四極と参照/接地電極を固定。
26. できるだけ多くのチューブのソケット端から四極管を引くが、動物が、チューブ（ 図1D）の外に四極の一部が破損する恐れがあり可能性を排除するために、それを引っ張るません。
27. すべての制約を削除します。歯科用ワックスとの四極管類を参照/接地電極を取り付けます。
28. 任意の実験の前に氷の麻酔から回復するための動物のために、少なくとも60分待ってください。

3。実験手順

1. 記録システムおよびシリアルポートケーブルにUSBを使用して、LEDライトの両方を搭載したPCを接続します。
2. 神経の録音を開始します。
3. 高速度カメラを用いた実験を登るためのハチクイモドキ画像取得パッケージ¹⁶または120 FPSを用いた実験を歩くために、毎秒20フレームでビデオ録画を開始します。
4. 実験を登るための高アリーナ、長い実験または58センチ歩いて40センチ×40センチメートルのプレキシガラスの分野にゴキブリを置いて幅5cm、5センチメートル。ウォーキングアリーナはヘッドステージが配置されている上にアリーナの中央、右壁の中央から伸びる透明バリアを持っています。バリアは、カメラビューがヘッドステージによってブロックされた領域の中を歩いてから動物を防止するために使用される。クライミングアリーナは、アクリル系ブロック（1.2センチメートルまたは1.8センチの高さ、および幅5cmのいずれか）またはセンターに匹敵高さに位置し、棚を持っています。
5. カスタマイズされたMATLABコマンドを使用してPCからTTLパルスを生成します。 （S =シリアル（ 'COM4'）;のfopen（S）; s.RequestToSend =「オフ」/ s.RequestToSend = / 'に'; fcloseを（S）、削除（S）;)。 TTLパルスは、時間が生成されます記録方式に固めるとオンまたはLEDライトをオフのどちらか。
6. それは歩くの実験のために30秒以上移動を停止するまで、ゴキブリがアリーナを探索することができます。ゴキブリ実験を登るための棚を通じてブロック/シェルフまたはトンネル経由で登ることのどちらかを許可します。
7. ビデオ録画を停止します。
8. 神経の録音を停止します。
9. TTLパルスによって生成されたタイムスタンプを記録します。
10. アリーナからゴキブリを取り出して、約3分待ちます。
11. 繰り返します、次の裁判のため3.2から3.10を繰り返します。
12. 一度すべての録音が完了している、ワイヤ先端（アノード）と、ワイヤ先端に脳内に銅を堆積するための基準電極（陰極）のいずれかを使用して5μADC電流の5秒を渡す。

4。オフライン分析

1. LED光が切り替わるフレームの記録方式により記録されたタイムスタンプを連結することにより、映像および神経データを同期させるその瞬間。
2. マークワイヤ先端の位置。 12μmの連続切片¹⁷で銅を沈殿させ、観察するティムズの強化手順を使用してください。著名な堆積物は3-8隣接するセクション（区域の背腹面の長さの約18から48までパーセントは、我々から録音）（ 図2）に表示する必要がある。
3. 単一ニューロンの活動に具体的な電気的刺激を関連付ける。他で詳細^10,14,18にレイアウトされた手順をソートスパイクに従ってください。初期、自動化されたクラスタリングを生成するプログラムKlustaKwik（バージョン1.5、著者K.ハリス、ラトガース大学）を使用します。プログラムMClust（バージョン3.5、著者のAD赤みがかっら 、ミネソタ大学）さらなる改良および分析のため（ 図3）にインポートします。
4. ゴキブリの動きを追跡。歩行実験のために、各フレームのVIDの質量のゴキブリの（可視）の中心位置と、その本体の向きを抽出するとMATLAB ¹⁹のための関連FixErrorsツールボックス、カリフォルニア工科大学の複数のフライトラッカー（http://ctrax.sourceforge.net/バージョン0.1.5.6）を使用して、EOの録音。実験を登るために、運動分析ソフトウェアパッケージを使用して、ビデオの各フレーム内のブロックと、ゴキブリの頭と前胸背板の位置を抽出する。

結果

我々は、歩行実験のための27の製剤中のCCから50単位の神経活動を記録した。それらの製剤（23単位）の15、クライミング実験も実施した。個々のユニット（ 例えばユニット1-2の準備1、ユニット2を示す）の準備とユニット番号に従って名前が付けられています。

1登山裁判の映像のスナップショットを図4に示す。ビデオ全体は、補足?...

ディスカッション

昆虫の脳のCCまたは他の地域での以前の電気生理学的研究は行動の中央制御への洞察を提供してくれているが、それらのほとんどが抑制調剤^9,11またはつながれたもの^10,14のどちらかで行った。その結果、動物の感覚的な体験や生理状態は、自然の中でのものとは大きく異なる可能性があります。さらに、動物が実行できる行動のタスクは、そのような状況の下で一つの平面に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis