Внеклеточная провода Тетрод Запись в Мозга Свободно Прогулки Насекомые

Резюме

Мы ранее разработали методику имплантации Тетрод провода в центральной комплекса мозга таракана, что позволяет нам контролировать деятельность в отдельных единиц привязных тараканов. Здесь мы представляем модифицированную версию этой техникой, что позволяет нам также записывать активность мозга в свободно движущихся насекомых.

Аннотация

Растущий интерес к роли мозговой активности в борьбе с насекомыми двигателя требует, чтобы мы в состоянии контролировать нервную деятельность в то время как насекомые выполняют естественное поведение. Мы ранее разработали методику имплантации Тетрод провода в центральной комплекса мозга таракана, которые позволили нам записать деятельность из нескольких нейронов одновременно в то время как на привязи таракан оказалось или измененное скорости передвижения. В то время как крупный шаг вперед, привязанные препараты обеспечивают доступ к ограниченным поведения и часто не имеют процессы обратной связи, которые происходят в свободно движущихся животных. Приведем теперь модифицированную версию этой техникой, что позволяет нам производить запись с центрального комплекса свободно перемещаться тараканов, как они ходят на арене и иметь дело с барьерами, поворачивая, альпинизм или туннелирования. В сочетании с высокой скоростью видео и кластера резки, мы можем теперь относятся мозговую деятельность различных параметров движения свободно ведут себя насекомых.

Введение

В этой статье описывается успешной системы для записи из нейронов в пределах центрального комплекса (ГК) таракана, Blaberus discoidalis, как насекомое прогулки в манеже и сделок с объектами, которые вызывают это развернуться, туннель под землей, или перелезть через препятствия. Провода могут быть также подключен к стимулятора, чтобы вызвать активность в окружающей нейропиля с последующими поведенческих изменений.

За последнее десятилетие значительное внимание было направлено на роли, которую играют различные регионы мозга в управлении поведением насекомых. Большая часть этого фокуса была направлена ​​в сторону срединной линии neuropils мозга, которые совместно именуемые центрального комплекса (ГК). Прогресс был достигнут в результате широкого многообразия методов, ориентированных на вопросы о роли ЦК в поведении. Эти методы варьируются от нейрогенного манипуляций, в первую очередь у дрозофилы, в сочетании с поведениюоральный анализ ^1-3, чтобы электрофизиологических методов, которые контролируют нервную деятельность в ЦК и попытке связать эту деятельность, чтобы поведенчески соответствующих параметров.

Электрофизиологические методы включают внутриклеточный запись из отдельных выявленных нейронов ^4-9 и внеклеточной записи, часто с несколькими зондами ^10,11 канала. Эти две технологии дополняют друг друга. Внутриклеточного записи с острыми электродов или целых клеток патч обеспечивает очень подробные данные о выявленных нейронов, но ограничивается одной или двух клеток сразу, требуется ограниченное или не движение, а может поддерживаться в течение относительно короткого периода времени. Внеклеточные записи можно легко настроить, не требуют сдержанности, и может поддерживаться в течение нескольких часов. С несколькими тетродов канала и кластера резки, довольно большие популяции нейронов могут быть проанализированы одновременно ^9,12. В то время как целая клетка PATCч успешно используется в привязных насекомых ^13, мы чувствуем, что есть также потребность в способах, которые позволяют нам записать нейронную активность мозга в течение длительных периодов времени в свободно себя насекомых, как они имеют дело с барьеров для движения вперед.

Необходимость записывать как насекомых ходов и подпрыгивает вверх и вниз подтолкнул нас к внеклеточных методов записи. У нас было хорошее качество записи успеха в сдержанных препаратов с коммерчески доступных 16 каналов кремниевых зондов ^11, однако небольшой размер даже больших тараканов означает, что зонды должны быть установлены от тела. Это, в сочетании с деликатностью зонда пальцев, делает их непригодными для свободного подготовки минутах. В двух предыдущих проектов, мы использовали пучки тонких проволок, образующих тетрод для выполнения аналогичные свойства записи, но в более надежные договоренности. Эти тетродов пучки позволили нам запись с привязных таракановг относятся блок деятельность CC изменений в скорость ходьбы ¹⁴ и поворачивая поведение в результате усиков контакте с жезлом ^10.

Как полезно, поскольку эти привязные препараты были и по-прежнему будет, они действительно представляют некоторые ограничения. Во-первых, поведение, что насекомое может выполнять ограничены в одной плоскости. То есть, мы легко могли бы вызвать изменения в скорости ходьбы или поворота, но восхождение и туннельные действия не были возможны, по крайней мере, с типичным расположением троса. Во-вторых, наши привязные препараты "без обратной связи". То есть, они не позволяют для нормального движения, связанные с обратной связью к системе. Таким образом, как таракан включена нашей троса, его визуальный мир не изменяется соответствующим образом. Можно построить замкнутые системы петля троса ввести этот вид обратной связи. Тем не менее, они ограничены сложности программирования и аппаратного обеспечения моделируемого визуальной среды. Neverthelesс, мы чувствовали, что мы могли бы улучшить наши существующие привязных методов записи, записывая от животного, как это шли свободно на арене или дорожки и встречающихся объектов как это было бы в своей естественной среде.

Хотя беспроводные системы для регистрации активности головного мозга ¹⁵ было бы идеально, современные системы имеют ограничения в количестве каналов записи, время сбора данных, жизни и массы батареи. Мы, таким образом, решили попробовать адаптировать наше привязной системы записи для использования в свободно перемещаться препараты. Как лучше беспроводные системы становятся доступными, эта методика может быть легко адаптированы к таким устройствам. Система, описанная в этой статье, легкий вес, работает очень хорошо и, похоже, мало вредное воздействие на поведение таракана. С недорогой высокоскоростной камерой и резки программного обеспечения кластера, активность в отдельных нейронов головного мозга может быть связано с движением. Здесь мы опишем подгоной работы Тетрод проводов и их имплантации в мозг насекомого, а также методы записи для электрической активности и движения, и как эти данные могут быть объединены для последующего анализа.

протокол

1. Подготовка Тетрод Провода

1. Вытяните очень тонкий нихромовой проволоки (диаметром 12 мкм, PAC покрытия) около 1,1 м длины. Прикрепите ленты тег в каждом конце. Повесьте провод на горизонтальной шпильке такой, что два конца находятся на той же высоте около лабораторного стола.
2. Повторите шаг 1,1 для второго провода, делая еще два концы в общей сложности 4, и поместить его рядом с первой проволоки (около 1 см между ними).
3. Придерживайтесь четыре концы вместе с магнитофоном тега и закрепить бирку к моторизованных вращающихся обмоток устройства. Это устройство может быть сделан из недорогого двигателя постоянного тока.
4. Ветер тетрод в одном направлении в течение 2 мин (60 оборотов в минуту) и размотать его в противоположном направлении в течение 30 секунд.
5. Используйте тепловой пушки сплавить провода вместе. Не прикасайтесь провода с пистолетом. Используйте три вверх и вниз переходит из переменных направлений, с каждым проходом занимает около 10 сек.
6. Обрежьте верхнюю и дна раны проводов. Четыре жилы скрученыд слиты вместе на одном конце, но отдельно на другом.
7. Добавить опорную трубку. Отрежьте 30 см длиной с полиэтиленовой трубы (диаметр внутри 0,28 мм, снаружи 0,61 мм). Автор тетрод очень медленно и осторожно в несущую трубу так, чтобы она не перегибать.
8. После того, как расплавленный конец появляется на другую сторону, вытащить его через так что есть равное длина провода на обоих концах направляющей трубки.
9. Захватите отдельный конец каждого провода с пинцетом. Используя базу пламени газовой горелки, тщательно сжечь изоляцию с последнего 2 или 3 мм каждого провода. Нагреть провод, пока он не горит, но не скручиваться.
10. Подключите тетрод с мужчиной и женщиной IC Socket адаптер, который соответствует вашим записывающее устройство. Поставьте deinsulated конец каждого провода в другой разъем адаптера с пинцетом. Стабилизировать провод в розетку с небольшим латуни штифта. Используйте тонкий момент паяльник и заполнить гнездо с расплавленным припоем. Будьте осторожны, чтобы не связыватьсяхрупкая провод с паяльником.
11. Проверьте сопротивление каждого провода и среди импеданс каждой пары проводов.
    1. Поместите слитый, витая конец в емкость с раствором соли и соединить медной проволоки проводника из физиологического раствора к счетчику Ом.
    2. Подключите другой конец метра к вставным болтом, содержащей провод. Сопротивление каждого провода должна быть не ниже 3 МОм.
    3. Если вышеуказанные значения не достигаются, повторить попытку паяных соединений.
    4. Снимите провода от физиологического раствора, промыть кончики с водой, и протестировать среди проволоки сопротивление для каждой пары (п = 6). Среди сопротивление должно быть выше 5 МОм.
    5. Если вышеуказанные значения не достигаются, нарезать небольшое количество кончике выключения на плавленого конце и перепроверять.
    6. Отменить любые провода набор, который не соответствует обоим требованиям импеданса для всех проводах.
12. Закрепите тетрод.
    1. Сложите небольшое прямоугольное Слиг бумажная коробкаhtly больше, чем гнездо адаптера.
    2. Передача адаптер в коробке с мужской стороны в нижней части. Проникают в окно так, что все штырьки мужской стороны находятся за пределами рамки в то время как остальная часть адаптера внутри коробки.
    3. Лента углы коробки на внешней стороне. Использование небольшие кусочки двухсторонней клейкой ленты на внутренней стороне коробки, чтобы стабилизировать ее отдельные нити проволоки. Провод должен быть слит когда он выходит из коробки.
    4. Смешайте быстро установить 2 эпоксидная и залить в коробку, чтобы закрепить адаптер и все провода.
    5. Прикрепите около конец направляющего трубки с одной стороны коробки с зубной воск, но оставить трубка открыть таким образом, что тетрод можно вытянуть через посредство свободно на обоих концах.
13. Резкость тетрод.
    1. Перед каждым экспериментом, разрезать кончик тетрода с резким лезвие скальпеля, а не ножницами. Это предотвращает дробление и распорных проволоки заканчивается, обеспечивая при этом чистую ровную кромку на следующей стадии.
    2. Используйте небольшой вращательный инструмент установлен вертикально с средней и мелкой наждачной шлифовальных дисков (они могут быть объединены на одной платформе), чтобы полировать тетрод и удалить некоторые чаевые изоляцию. Держите пачку около его конца щипцами. Наклон провод набор конец 45 ° углом по отношению к шлифовальной диска и осторожно прикоснуться к ней с умеренной скоростью вращающемся диске в течение примерно 1 или 2 сек каждый на носителе, а затем мелкие крупы. Повторите это еще три раза, по оси вращающегося пучка 90 ° каждый раз. Очень важно, что направление спина шлифовальных дисков вдали от небольшим углом из концов провода, в противном случае может произойти разделение проводов.
    3. Желаемый результат преобразует конец расслоение с прямым краем к заостренным концом с небольшими количествами изоляции удаленных от конца каждого провода. Проверьте точку использованием рассекает микроскопом до посева тетрод. Если изнашивание происходит на кончике, перекроить и repolish.
    4. Если тестирование сопротивление во время subsequЛОР покрытие шаг показывает крайне низкие взаимосвязанных значений провода (менее 4 МОм), это указывает на слишком много материала удаляются во время стадии полировки. Новый Монтаж и repolish тетрод.
14. Plate тетрод. Поместите кончик тетрода в насыщенный раствор сульфата меди (85 мл воды, 5 мл серной кислоты, 50 г сульфата меди). Тарелка каждый провод с током 2,5 мкА с стимула изолятор. Введите ток в течение 1 с, пауза в течение 1 секунды и повторить этот процесс 4x.
15. Проверьте сопротивление каждого провода и interimpedance каждой пары проводов. Сопротивление каждого провода должно быть между 0,5-1 МОм и среди сопротивление должно быть выше 4 МОм.
16. Установите переходник на headstage системы записи многоканального.
17. Прикрепите изогнутую насекомых булавку, чтобы микроманипулятора. Прикрепите наконечник тетрода к насекомым штифта с зубных слепков

2. Подготовка животных

1. Обезболитьтаракана льдом.
2. После того, как таракан перестает двигаться, сдерживать таракана вертикально на ровной поверхности пробки с большими булавками седловых, расположенных вдоль насекомое, но не проникают любую часть своего тела.
3. Передача подготовку в пластиковый контейнер и поместить лед вокруг животного, чтобы минимизировать кровотока и движения тела.
4. Расположите пластиковый воротник на шее, чтобы поддерживать голову и поместите зубную воск вокруг головы, чтобы стабилизировать его.
5. Вырезать небольшое окно между глазков с лезвием бритвы и удаления кутикулы от головы.
6. Удалить соединительные ткани и жир с пинцетом, чтобы выставить на мозг.
7. Место некоторые таракана физиологический раствор в головной капсулы для покрытия ткани мозга.
8. Для desheath мозг, использовать тонкий пинцет, чтобы аккуратно захватить оболочку поверх головного мозга и использовать еще тонкий пинцет рвать оболочку друг от друга в проводной имплантированного области.
9. Откройте небольшое отверстие в головной капсулы кпереди от остроумия мозгач насекомое контактный. Вставьте косу из трех больших диаметров (56 мкм) с изоляцией медные провода в отверстие, чтобы служить в качестве справочного / заземляющего электрода.
10. Опустите кончик тетрода на поверхность мозга с микроманипулятора и расположить его вблизи области мозга интересов.
11. Аккуратно положите две небольшие кусочки тонкой ацетата листа (2 мм х 1 мм), немного больше, чем отверстие в головной капсулы, передний и задний в тетрода.
12. Включите систему записи.
13. Медленно опустите тетрод 150-250 мкм ниже поверхности мозга в зависимости от качества записи.
14. Выключите систему записи.
15. Перемещение две части ацетата листа как можно ближе к тетрода как можно, не касаясь его (рис. 1А).
16. Нагрейте небольшую шпателя или сплюснутый иглу и положить его в зубных слепков, такие, что есть жидкий воск на кончике шпателя. Аккуратно дотроньтесь дальний конец каждой части ацетата листа отТетрод с помощью шпателя так, чтобы жидкий воск может течь на каждой части и герметизации зазора между ним и головной кутикулы.
17. Повторите шаг 2,16. Оставьте небольшое количество жидкого воска на ацетатной пластине каждый раз. Начать процесс далеко от тетрода и двигаться постепенно к нему. В конце концов тетрод будет якорь зубных слепков. Избегайте попадания горячего воска в полость и на мозг.
18. Используйте тот же метод, что и этапы 2,16 и 2,17 для закрепления задания / боковой электрод с воском.
19. Нагрейте воск, который придает тетрод к микроманипулятора выпустить тетрод от него.
20. Петля тетрод в зубных слепков по голове, чтобы обеспечить разгрузку от натяжения (рис. 1В).
21. Накройте цикл снятия напряжения с зубных слепков (рис. 1в).
22. Осторожно снимите ограничения и передать подготовку на чашке Петри. Задержите подготовка спинной стороной вверх с большими булавками седловых.
23. Присоединятьтяга на переднеспинки помощью клеевого пистолета. Это деревянная палочка, которая проходит от переднеспинки над живота.
24. Прикрепите наконечник трубки тетрода к заднему концу стержня с зубных слепков.
25. Якорь тетрод и задания / боковой электрод к переднему концу стержня с зубных слепков.
26. Извлеките тетрод с конца разъем трубки, насколько это возможно, но не тащить на нем, чтобы устранить вероятность того, что животное может повредить часть тетрода снаружи трубки (рис. 1D).
27. Удалить все ограничения. Прикрепите задания / боковой электрод с трубкой тетрода с зубных слепков.
28. Подождите не менее 60 минут, чтобы животное могло оправиться от льда анестезии перед любого эксперимента.

3. Экспериментальные методики

1. Соедините ПК как с системой записи и светодиодной света с помощью USB к кабель последовательного порта.
2. Начните нервные записи.
3. Начните записи видео на 20 кадров в секунду для прогулок эксперименты с использованием приобретения пакета Motmot изображения ¹⁶ или 120 кадров в секунду для восхождения эксперименты с использованием высокоскоростного камеру.
4. Поместите таракана в 40 см х 40 см Оргстекло ареной для идущих экспериментов или 58 см в длину, шириной 5 см, и 5 см в высоту арена для восхождения эксперименты. Ходьба арена имеет прозрачный барьер, проходящий от центра правой стенки к центру арены, выше которой headstage находится. Барьер используется для предотвращения животных от ходьбы в районах, где вид камеры заблокированных headstage. Арена скалолазание имеет акриловый блок (либо 1,2 см или высокую 1,8 см, и шириной 5 см) или на полке находится на сопоставимом высоты в центре.
5. Создайте TTL импульс от ПК с помощью настраиваемого команду MATLAB. (Ы = последовательный ('COM4'); Еореп (ы); s.RequestToSend = 'от' / s.RequestToSend = 'на' /; FClose (ы); удалить (ы) ;). Импульс TTL генерирует разнабейте для системы записи и либо включается или выключается свет СИД.
6. Разрешить таракан исследовать арену, пока он не перестает двигаться в течение более 30 секунд для пешеходных экспериментов. Разрешить таракан либо перелезть через блок / полку или туннель через полки для восхождения эксперименты.
7. Остановить видеозаписи.
8. Остановить нервные записи.
9. Запишите метку, порожденную TTL импульса.
10. Снимите таракана с арены и подождите не менее 3 мин.
11. Повторите шаги 3.2-3.10 для следующего испытания.
12. После того, как все записи были завершены, проходить 5 сек из 5 мкА постоянного тока через один из проволоки советы (анод) и электродом (катод) для осаждения меди в головном мозге на кончике проволоки.

4. Офлайн анализ

1. Синхронизация видео и нервные данные, связывая кадр, где светодиод переключается и метку времени, записанного в системе записи наэтот момент.
2. Все места наконечник провода. Используйте процедуры интенсификации Timms для осаждения и наблюдать меди в 12 мкм серийных срезов ^17. Видные депозиты должны быть видны в 3-8 соседних секций (около 18-48% от длины спинного вентральной плоскости области, мы запись с) (рис. 2).
3. Корреляция конкретных электрические импульсы к деятельности отдельных нейронов. Следуйте шип сортировки процедур, изложенных в подробно в другом месте ^10,14,18. Используйте программу KlustaKwik (версия 1.5, автор К. Харрис, Rutgers University), чтобы создать первоначальный, автоматизированное кластеризации. Импортировать их в программу MClust (версии 3.5, авторы AD Redish соавт., Университет Миннесоты) для дальнейшей доработки и анализа (рис. 3).
4. Трек движения таракан в. Для прогулки эксперименты, извлечь позицию (визуальной) центра таракана массы и ее ориентации тела в каждом кадре VIDео записи с помощью Caltech Несколько Fly Tracker (версия 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) и связанный с ним FixErrors инструментарий для MATLAB ^19. Для восхождения эксперименты, извлечь позицию блока и головки и переднеспинки таракан в каждом кадре видео с помощью программного обеспечения анализа движения пакета.

Результаты

Мы записали нервную деятельность 50 единиц из ЦК в 27 препаратов для пешеходных экспериментов. Для 15 из этих препаратов (23 единиц), также проводились альпинистские эксперименты. Отдельные блоки названы в соответствии с подготовки и номерами устройств (например, блок 1-2 указывает под?...

Обсуждение

В то время как предыдущие электрофизиологические исследования на ЦК или других регионах насекомых мозга предоставили нам идеи в центральную регуляции поведения, большинство из них были выполнены либо в сдержанных препаратов ^9,11 или привязных них ^10,14. В результате животног?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis