Extracellulaire fil Tetrode enregistrement dans le cerveau des insectes Marcher librement

Résumé

Nous avons déjà développé une technique d'implantation fils tétrode dans le complexe central de cerveau de cafards qui nous permet de surveiller l'activité en unités individuelles de cafards captifs. Nous présentons ici une version modifiée de cette technique qui nous permet d'enregistrer également l'activité du cerveau en se déplaçant librement insectes.

Résumé

L'intérêt croissant pour le rôle de l'activité du cerveau dans le contrôle moteur insectes exige que nous soyons en mesure de suivre l'activité neuronale et les insectes effectuent comportement naturel. Nous avons déjà développé une technique d'implantation fils tétrode dans le complexe central de cerveau de cafards qui nous ont permis d'enregistrer l'activité de plusieurs neurones simultanément tout un cafard attaché tourné ou la vitesse de marche altérée. Même si un grand pas en avant, préparations captifs permettent d'accéder à des comportements limités et manquent souvent de processus de rétroaction qui se produisent chez les animaux se déplaçant librement. Nous présentons maintenant une version modifiée de cette technique qui nous permet d'enregistrer à partir du complexe central de se déplacer librement cafards comme ils marchent dans une arène et faire face à des obstacles en tournant, de l'escalade ou de tunnels. Couplé avec la vidéo haute vitesse et la coupe de la grappe, nous pouvons maintenant porter l'activité cérébrale à différents paramètres du mouvement des insectes se comporter librement.

Introduction

Cet article décrit un système efficace d'enregistrement des neurones dans le complexe central (CC) du cafard, discoidalis Blaberus, comme l'insecte se promène dans une arène et traite avec des objets qui la font tourner, tunnel sous, ou grimper sur des obstacles. Les fils peuvent également être connectés à un stimulateur pour évoquer l'activité dans le neuropile environnant avec des changements comportementaux qui en découlent.

Au cours de la dernière décennie une attention considérable a été réalisé sur les rôles joués par les différentes régions du cerveau à contrôler le comportement des insectes. Une grande partie de ce foyer a été dirigé vers les neuropils cérébrales médianes qui sont collectivement appelés le complexe central (CC). Des progrès ont été réalisés à la suite de grandes variétés de techniques de ciblage des questions sur le rôle du CC dans le comportement. Ces techniques vont de manipulations neurogénétiques, principalement chez la drosophile, couplés avec behavianalyse orale ^1-3, à des techniques électrophysiologiques qui surveillent l'activité neuronale dans le CC et tentative de relier cette activité à des paramètres pertinents comportemental.

Les techniques électrophysiologiques comprennent l'enregistrement intracellulaire des neurones individuels identifiés ^4-9 et enregistrement extracellulaire, souvent avec des sondes multi-canaux ^10,11. Ces deux techniques sont complémentaires. Enregistrement intracellulaire avec des électrodes pointus ou patch cellule entière fournit des données très détaillées sur les neurones identifiés, mais se limite à une ou deux cellules à la fois, nécessite un mouvement limité ou non, et peut être maintenue pour des périodes de temps relativement courtes. Enregistrements extracellulaires peuvent être facilement mis en place, ne nécessite pas de retenue, et peuvent être maintenus pendant des heures. Avec tétrodes multicanaux et la coupe de la grappe, assez grandes populations de neurones peuvent être analysés simultanément ^9,12. Alors que CPAE de cellules entièresh a été utilisé avec succès chez les insectes captifs ^13, nous pensons qu'il ya aussi un besoin de techniques qui nous permettent d'enregistrer l'activité neuronale dans le cerveau pendant de longues périodes de temps en se comporter librement insectes car ils traitent des obstacles au déplacement vers l'avant.

La nécessité de constater que les insectes se déplace et rebondit nous a poussé vers des méthodes d'enregistrement extracellulaires. Nous avons eu un bon enregistrement de succès dans les préparations sobres avec des sondes disponibles dans le commerce 16 canaux de silicium ^11, mais la petite taille, même de grandes cafards signifie que les sondes doivent être montées hors du corps. Cela, couplé avec la délicatesse des dents de la sonde, les rendait inapproprié pour une préparation de marche libre. Dans deux précédents projets, nous avons utilisé des faisceaux de fils fins formant une tétrode à accomplir propriétés d'enregistrement similaires, mais dans un arrangement plus robuste. Ces faisceaux de tétrode nous a permis d'enregistrer de cafards captifs uneD portent l'activité de l'unité de CC aux changements de vitesse ¹⁴ à pied et en tournant le comportement résultant d'un contact antennaire avec une tige ^10.

Aussi utile que ces préparations captifs ont été et continueront d'être, ils ne présentent certaines limitations. Tout d'abord, les comportements que l'insecte peut effectuer sont limitées à un seul plan. Autrement dit, nous pourrions facilement évoquer les changements de vitesse de marche ou tournant, mais l'escalade et de tunneling actions n'était pas possible, au moins avec l'agencement d'attache typique. Deuxièmement, nos préparations sont captifs "boucle ouverte". Autrement dit, ils ne permettent pas de mouvements liés à la normale à la rétroaction du système. Ainsi, comme le cafard activée notre attache, son monde visuel n'a pas été modifiée en conséquence. Il est possible de construire des systèmes de boucle d'attache fermés à introduire ce genre de commentaires. Cependant, elles sont limitées par la complexité de la programmation et du matériel de l'environnement visuel simulé. Nevertheless, nous avons pensé que nous pourrions améliorer nos méthodes d'enregistrement captifs existants par l'enregistrement de l'animal car il marchait librement dans une arène ou la piste et objets rencontrés comme il le ferait dans son milieu naturel.

Bien que les systèmes sans fil pour l'enregistrement de l'activité cérébrale ^{de 15} serait idéal, les systèmes actuels ont des limites dans le nombre de canaux d'enregistrement, le temps d'acquisition des données, la vie et le poids batterie. Par conséquent, nous avons opté pour essayer d'adapter notre système d'enregistrement captif pour une utilisation dans les préparations se déplacer librement. Comme de meilleurs systèmes sans fil sont disponibles, cette technique peut être aisément adapté à de tels dispositifs. Le système qui est décrit dans cet article est léger, fonctionne très bien et semble avoir peu d'effet néfaste sur le comportement du cafard. Avec une caméra à grande vitesse et peu coûteux logiciel de coupe de la grappe, l'activité dans les neurones du cerveau individuels peut être liée au mouvement. Nous décrivons ici la prépaation des fils tétrode et leur implantation dans le cerveau de l'insecte, ainsi que les techniques d'enregistrement de l'activité électrique et le mouvement et la façon dont ces données peuvent être réunis pour une analyse ultérieure.

Protocole

Une. Préparation des fils TETRODE

1. Tirez un très mince fil de nichrome (12 um de diamètre, revêtement PAC) d'environ 1,1 m de longueur. Fixez une étiquette de bande à chaque extrémité. Accrocher le fil sur une tige filetée horizontale de telle sorte que les deux extrémités sont à la même hauteur près de la paillasse.
2. Répétez l'étape 1.1 pour un second fil, faisant deux autres extrémités pour un total de 4, et placez-le à côté du premier fil (environ 1 cm entre les deux).
3. Collez les quatre extrémités avec une étiquette de bande et l'attacher à un dispositif d'enroulement rotatif motorisé. Ce dispositif peut être réalisé à partir d'un moteur à courant continu peu coûteux.
4. Enroulez la tétrode dans un sens pendant 2 min (60 min) et détendez-vous dans la direction opposée pendant 30 sec.
5. Utilisez un pistolet à air chaud pour faire fondre les fils ensemble. Ne touchez pas les fils avec le pistolet. Utilisez trois de haut en bas passe de directions alternées, à chaque passage de prendre environ 10 secondes.
6. Couper le haut et le bas des fils enroulés. Les quatre fils sont torsadés und La fusionnés ensemble à une extrémité mais se séparer à l'autre.
7. Ajouter le tube de support. Couper une longueur de 30 cm d'un tube en polyéthylène (diamètre: 0,28 mm à l'intérieur, à l'extérieur de 0,61 mm). Enfilez la tétrode très lentement et avec précaution dans le tube de support de sorte qu'il n'est pas tordu.
8. Une fois que l'extrémité fondue apparaît sur l'autre côté, le passer à travers de sorte qu'il existe une longueur égale de fil aux deux extrémités du tube de guidage.
9. Prenez l'extrémité séparée de chaque fil avec une pince. Utilisation de la base de la flamme d'un brûleur à gaz, brûler soigneusement l'isolation hors du 2 ou 3 derniers mm de chaque fil. Chauffer le fil jusqu'à ce qu'il brille, mais ne pas se courber.
10. Connectez la tétrode avec un IC adaptateur prise mâle-femelle qui s'adapte à votre appareil d'enregistrement. Mettre l'extrémité de chaque fil deinsulated dans une autre prise de l'adaptateur avec une pince. Stabiliser le fil dans la prise avec une petite broche en laiton. Utilisez un fer à souder pointe fine et remplir la douille avec la soudure fondue. Attention à ne pas communiquerle fil fragile avec le fer à souder.
11. Vérifier l'impédance de chaque fil et le inter impédance de chaque paire de fils.
    1. Placer l', extrémité torsadée condensé dans un récipient de solution saline et de connecter un conducteur de fil de cuivre à partir de la solution saline à l'ohmmètre.
    2. Connecter l'autre extrémité de l'appareil de mesure à l'axe de la douille contenant le fil. L'impédance de chaque fil doit être inférieure à 3 MQ.
    3. Si les valeurs ci-dessus ne sont pas atteints, retenter les connexions à souder.
    4. Retirez les fils de la solution saline, rincez-les avec de l'eau, et de tester l'impédance entre de fil pour chaque paire (n = 6). L'impédance entre devrait être supérieure à 5 MQ.
    5. Si les valeurs ci-dessus ne sont pas atteints, découper une petite quantité de la pointe d'envoi à la fin fondu et retester.
    6. Jeter n'importe quel fil ensemble qui ne répond pas à la fois des exigences d'impédance pour tous les fils.
12. Fixez la tétrode.
    1. Pliez une petite boîte rectangulaire de papier slightly plus grande que l'adaptateur de prise de courant.
    2. Transférer l'adaptateur dans la boîte avec le côté mâle au fond. Pénétrer dans la boîte de telle sorte que toutes les broches du côté masculin sont en dehors de la boîte tandis que le reste de la carte est dans la boîte.
    3. Collez les coins de la boîte à l'extérieur. Utilisez de petits morceaux de ruban adhésif double face à l'intérieur de la boîte à stabiliser les brins individuels de fil. Le fil doit être fusionné à sa sortie de la boîte.
    4. Mélanger prise rapide 2 partie époxy et verser dans la boîte pour fixer l'adaptateur et tous les fils.
    5. Fixer l'extrémité proche du tube de guidage d'un côté de la boîte avec de la cire dentaire, tout en laissant le tube ouvert de telle sorte que la tétrode peut être tiré à travers librement aux deux extrémités.
13. Aiguiser la tétrode.
    1. Avant chaque expérience, couper la pointe de la tétrode avec une lame de scalpel, pas de ciseaux. Ceci permet d'éviter l'écrasement et évasement des extrémités du fil, tout en offrant un bord plat propre pour l'étape suivante.
       1. Utilisez un petit outil rotatif monté verticalement avec un grain moyen et fin disques de ponçage (ceux-ci peuvent être combinés sur une plate-forme) pour polir la tétrode et enlever une certaine isolation de pointe. Tenez le paquet près de son extrémité avec une pince. Inclinez le fil mis fin à un angle de 45 ° par rapport au disque de ponçage et doucement toucher à modéré disque rotatif de vitesse pendant environ 1 ou 2 secondes à chaque sur le support et les beaux grains. Répétez cette trois fois de plus, la rotation axiale du faisceau de 90 ° à chaque fois. Il est essentiel que la direction de rotation des disques de ponçage est une distance à partir de l'angle peu profond des extrémités des fils, autrement séparation des fils peut se produire.
       2. Le résultat désiré transforme l'extrémité du faisceau à partir d'un bord droit pour une extrémité pointue avec de petites quantités d'isolation retirée de l'extrémité de chaque fil. Vérifier le point à l'aide d'un microscope de dissection avant l'étalement de la tétrode. Si un effilochage se produit à la pointe, recouper et repolir.
       3. Si le test de l'impédance au cours de la subsequent étape de placage montre extrêmement faibles valeurs inter-fils (moins de 4 MQ), cela indique trop de matière enlevée au cours de l'étape de polissage. Recouper et repolir la tétrode.
    2. Plaque la tétrode. Mettre l'extrémité de la tétrode dans une solution saturée de sulfate de cuivre (85 ml d'eau, 5 ml d'acide sulfurique, 50 g de sulfate de cuivre). Plate chaque fil avec un courant de 2,5 pA avec un isolateur de stimulus. Injecter le courant pendant 1 seconde, une pause de 1 sec et répéter ce processus 4x.
    3. Vérifier l'impédance de chaque fil et la interimpedance de chaque paire de fils. L'impédance de chaque fil doit être comprise entre 0,5-1 MQ et l'impédance entre doit être supérieure à 4 MQ.
    4. Monter l'adaptateur sur le headstage d'un système d'enregistrement multivoie.
    5. Attacher une épingle d'insectes plié à un micromanipulateur. Attachez l'extrémité de la tétrode à la broche insecte avec de la cire dentaire

2. Préparation des animaux

1. Anesthésier lablattes avec de la glace.
2. Après le cafard cesse de bouger, retenir le cafard verticalement sur une surface de liège plat avec de grandes épingles de selle qui chevauchent l'insecte mais ne pénètrent pas dans n'importe quelle partie de son corps.
3. Transférer la préparation dans un récipient en plastique et placer de la glace autour de l'animal afin de minimiser la circulation sanguine et des mouvements du corps.
4. Placez un collier en plastique au niveau du col pour soutenir la tête et placer la cire dentaire autour de la tête pour le stabiliser.
5. Couper une petite fenêtre entre les ocelles avec une lame de rasoir et enlever la cuticule de la tête.
6. Retirer les tissus conjonctifs et de graisse avec une pince pour exposer le cerveau.
7. Mettre un peu de solution saline de cafard dans la capsule de la tête pour couvrir le tissu cérébral.
8. Pour desheath le cerveau, utiliser une pince fine pour saisir délicatement la gaine sur le dessus du cerveau et utiliser un autre pince fine à déchirer la gaine en dehors de la zone implantée de fil.
9. Ouvrez un petit trou dans la tête capsule antérieure à l'esprit du cerveauh une broche insecte. Insérez une tresse de trois grands diamètres (56 um) isolées des fils de cuivre dans le trou pour servir une électrode de référence / sol.
10. Abaissez la pointe de la tétrode à la surface du cerveau avec le micromanipulateur et le positionner à proximité de la région du cerveau d'intérêt.
11. Placez délicatement deux petits morceaux de feuille d'acétate mince (2 mm x 1 mm), légèrement plus grand que le trou dans la capsule de la tête, antérieure et postérieure à la tétrode.
12. Mettre en marche le système d'enregistrement.
13. Abaisser lentement la tétrode 150-250 um en dessous de la surface du cerveau en fonction de la qualité de l'enregistrement.
14. Éteignez le système d'enregistrement.
15. Déplacez les deux morceaux de feuille d'acétate comme proches de la tétrode possible sans le toucher (figure 1A).
16. Chauffer une petite spatule ou d'une aiguille hypodermique aplatie et la mettre en cire dentaire telle qu'il y ait de la cire liquide à l'extrémité de la spatule. Toucher délicatement le bout de chaque morceau de feuille d'acétate de latétrode avec la spatule afin que la cire liquide peut s'écouler sur chaque morceau et sceller l'écart entre elle et la cuticule de la tête.
17. Répétez l'étape 2.16. Déposez une petite quantité de cire liquide sur la feuille d'acétate à chaque fois. Lancer le processus loin de la tétrode et évoluer progressivement vers elle. Finalement, la tétrode sera ancré par de la cire dentaire. Évitez tout contact avec la cire chaude dans la cavité et sur le cerveau.
18. Utilisez la même méthode que les étapes 2.16 et 2.17 pour ancrer l'électrode de référence / sol avec de la cire.
19. Chauffez la cire qui attache la tétrode à la micromanipulateur pour libérer la tétrode de lui.
20. Boucle la tétrode dans la cire dentaire sur la tête pour fournir une décharge de traction (figure 1B).
21. Couvrir la boucle de décharge de traction avec de la cire dentaire (figure 1C).
22. Retirez délicatement les contraintes et transférer la préparation sur une boîte de Pétri. Retenir le côté préparation dorsale avec de grandes épingles de selle.
23. Joindreune tige à l'pronotum utilisant un pistolet à colle. Il s'agit d'un bâtonnet de bois qui s'étend depuis le pronotum sur l'abdomen.
24. Fixer l'extrémité du tube tétrode à l'extrémité postérieure de la tige avec de la cire dentaire.
25. Ancrer la tétrode et l'électrode de référence / sol à l'extrémité antérieure de la tige avec de la cire dentaire.
26. Tirer la tétrode de l'extrémité femelle du tuyau, autant que possible, mais ne pas tirer sur elle, afin d'éliminer la possibilité que l'animal risque d'endommager la partie de la tétrode à l'extérieur du tube (Figure 1D).
27. Retirez toutes les contraintes. Fixez l'électrode de référence / sol au tube tétrode avec de la cire dentaire.
28. Attendez au moins 60 minutes pour l'animal de récupérer de l'anesthésie de la glace avant toute expérience.

3. Procédures expérimentales

1. Connecter un PC à la fois le système d'enregistrement et une lumière LED à l'aide d'un câble USB vers port série.
2. Lancer enregistrements de neurones.
3. Lancer des enregistrements vidéo à 20 images par seconde pour des expériences marche en utilisant le paquet d'acquisition d'image de Motmot ¹⁶ ou 120 images par seconde pour monter des expériences à l'aide d'une caméra à haute vitesse.
4. Placez le cafard dans un 40 cm x 40 cm plexiglas arène pour des expériences de marche ou un 58 cm de long, 5 cm de large et 5 cm de haut arène pour grimper expériences. L'arène de marche a une barrière transparente s'étendant à partir du milieu du mur de droite du centre de l'arène, au-dessus duquel la headstage se trouve. La barrière est utilisé pour empêcher les animaux de se promener dans les zones où la vue de la caméra est bloqué par le headstage. L'arène d'escalade a un bloc acrylique (soit 1,2 cm ou 1,8 cm de haut et 5 cm de large) ou sur une étagère située à une hauteur comparable dans le centre.
5. Générer une impulsion TTL de l'ordinateur à l'aide d'une commande de MATLAB personnalisée. (S = série ("COM4"); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = 'on' /; fclose (s); supprimer (s) ;). L'impulsion TTL génère une foistasser pour le système d'enregistrement et soit active ou désactive la lumière LED.
6. Autoriser le cafard pour explorer la scène jusqu'à ce qu'il arrête de bouger pendant plus de 30 secondes pour les expériences à pied. Laisser le cafard soit montée sur le bloc / tablette ou un tunnel à travers la plate-forme pour l'escalade expériences.
7. Arrêtez enregistrements vidéo.
8. Arrêtez enregistrements de neurones.
9. Notez l'horodatage généré par l'impulsion TTL.
10. Retirez le cafard de l'arène et attendre au moins 3 minutes.
11. Répétez les étapes 03.02 à 03.10 pour le prochain procès.
12. Une fois tous les enregistrements ont été réalisés, passer 5 sec de courant 5 uA DC par l'un des conseils de fil (anode) et l'électrode de référence (cathode) pour déposer du cuivre dans le cerveau à la pointe du fil.

4. Analyse déconnecté

1. Synchroniser des données vidéo et de neurones en reliant l'image où l'éclairage à LED est allumé et l'estampille temporelle enregistrée par le système d'enregistrement àce moment-là.
2. Marquer fil pointe endroits. Utiliser des procédures d'intensification Timms à précipiter et observer le cuivre dans 12 sections um série ^17. Dépôts importants doivent être visibles dans 3-8 sections adjacentes (environ 18-48% de la longueur de l'avion ventrale dorsale de la région nous enregistrer à partir de) (figure 2).
3. Corrélation des impulsions électriques spécifiques à l'activité de neurones individuels. Suivez pic procédures de tri énoncées en détail ailleurs ^10,14,18. Utilisez le programme KlustaKwik (version 1.5, l'auteur K. Harris, de l'Université Rutgers) pour générer initiale, le regroupement automatisé. Les importer dans le programme MClust (version 3.5, les auteurs AD rougeâtre et al., Université du Minnesota) pour plus de raffinement et d'analyse (Figure 3).
4. Suivre les mouvements de la blatte. Pour les expériences de marche, extraire la position du (visuel) centre de masse et l'orientation du corps dans chaque image de la vid de la blatteenregistrements eo utilisant le Caltech multiple Fly Tracker (version 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) et la boîte à outils FixErrors associé pour MATLAB ^19. Pour l'escalade expériences, extraire la position du bloc et la tête et pronotum du cafard dans chaque image de la vidéo à l'aide du progiciel d'analyse de mouvement.

Résultats

Nous avons enregistré l'activité neuronale de 50 unités de la CC dans 27 préparations pour les expériences de marche. Pour 15 de ces préparations (23 unités), les expériences d'escalade ont également été réalisées. Les unités individuelles sont nommés selon les chiffres de préparation et d'unité (par exemple, l'unité 1-2 indique la préparation 1, unité 2).

Instantanés de la vidéo d'un essai d'escalade sont présentés dans la fig...

Discussion

Alors que les études électrophysiologiques antérieures sur la CC ou d'autres régions du cerveau de l'insecte nous ont fourni un aperçu de la commande centrale du comportement, la plupart d'entre eux ont été réalisées soit dans des préparations sobres ^9,11 ou les captifs ^10,14. En conséquence, l'animal de l'expérience sensorielle et l'état physiologique pourrait être très différents de ceux dans un cadre naturel. En outre, les tâches comportementales que l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis