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Resumen

El establecimiento de los sistemas primarios de células endometriales estromales de cultivo a partir de especímenes de histerectomía es una técnica biológica valiosa y un paso crucial antes de continuar con una amplia gama de objetivos de investigación. Aquí se describen dos métodos utilizados para establecer cultivos de estroma de los tejidos del endometrio resecado quirúrgicamente de pacientes humanos.

Resumen

Muchos esfuerzos se han dedicado a establecer en sistemas de cultivo celular in vitro. Estos sistemas están diseñados para modelar un gran número de procesos in vivo. Sistemas de cultivos celulares derivados de muestras endometriales humanas no son una excepción. Las aplicaciones varían desde procesos fisiológicos normales cíclicos a patologías endometriales, tales como los cánceres ginecológicos, enfermedades infecciosas, y fallos del aparato reproductor. Aquí, le ofrecemos dos métodos para establecer células estromales endometriales primarios a partir de especímenes de histerectomía endometrio resecado quirúrgicamente. El primer método se conoce como "el método de raspado" e incorpora raspado mecánico utilizando cuchillas quirúrgicas o de afeitar mientras que el segundo método se denomina "el método de tripsina." Este último método utiliza la actividad enzimática de tripsina para promover la separación de células y primaria excrecencia celular. Nos ilustran la metodología paso a paso a través de imágenes digitales y la microscopía. También provide ejemplos de validación de líneas celulares del estroma endometrial por medio de reacciones cuantitativas en tiempo real de la cadena de la polimerasa (qPCR) e inmunofluorescencia (IF).

Introducción

El corpus útero humano se compone de tres capas, la perimetrio (o serosa), el miometrio, y el endometrio. Distinguir cada una de estas capas es un paso importante para establecer líneas celulares del endometrio. El perimetrio es la capa más externa del útero y compone de células delgadas y serosas. El miometrio es la capa gruesa, medio del útero y compuesta de células del músculo liso. El endometrio se identifica como la capa interior del útero e incluye células epiteliales y estromales poblaciones.

El endometrio se subdivide a su vez en la capa basal cuyo tallo población celular es la hipótesis de la repoblación de la capa functionalis aproximadamente cada 28 días 1. La capa functionalis del endometrio humano sufre cambios bioquímicos y morfológicos significativas en la respuesta a las hormonas circulantes. Estas hormonas se derivan de la glándula pituitaria y los ovarios.

Lacoordinó la producción y liberación de hormonas resulta en un ciclo reproductivo. El ciclo reproductivo está diseñado para preparar el endometrio para eventos potenciales de implantación del embrión. En los humanos, el ciclo reproductivo se conoce como "ciclo menstrual" y se divide en tres fases - proliferativa, secretora y menstrual. La fase proliferativa implica la proliferación de la capa de endometrio functionalis mientras que la fase secretora se caracteriza por functionalis maduración. En concreto, las alteraciones extracelulares, secreciones y la diferenciación celular señalan un potencial de implantación. Si la implantación no se produce antes de que el final de la fase secretora, la capa de endometrio functionalis se desprende durante la fase menstrual. La importancia de la menstruación y los acontecimientos que desencadenan el desprendimiento de la capa functionalis todavía se está debatiendo. En los seres humanos, se ha planteado que la menstruación es el resultado de un evento específico mediados de secretora diferenciación fase conocidacomo "decidualization espontánea" 2. En este manuscrito, proporcionamos metodología detallada para ambos métodos de aislamiento de células estromales endometriales, y utilizamos una combinación de inmunofluorescencia e imágenes digitales para demostrar la eficacia de estos enfoques. Además, se aplica una de uso común en modelo in vitro de decidualización espontánea para confirmar el aislamiento de células del estroma endometrial.

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Protocolo

Especímenes de histerectomía utilizados en este manuscrito se recogieron en concordancia con un protocolo de ética aprobado por la IRB Universidad numerada IRB-HSR # 14424.

1. Adquisición de la muestra de la Fuente Clínica

  1. Obtener el gobierno y las normas éticas basadas en instituciones y la documentación de aprobación antes de comenzar.
  2. Llevar a cabo todos los pasos en condiciones estériles.
  3. Preservar el tejido derivado del paciente en los medios de comunicación (RPMI o DMEM / de alta glucosa) en un tubo de 50 ml a 4 ° C si la muestra no se puede procesar en la cultura de inmediato. Las muestras pueden conservarse en este estado durante un máximo de 24 horas.
  4. Lavar muestra de tejido tres veces con 1X solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y desechar la solución entre los lavados.

2. Preparación de líneas celulares primaria mediante el método de raspado

  1. Añadir 4-10 ml de medio de crecimiento (medio RPMI o DMEM / de alta glucosa suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-streptomyCIN) al tejido y añadir Fungizone (/ ml de concentración final 0,25 g) durante 30 min.
  2. Descartar el medio de crecimiento.
  3. Lavar el tejido dos veces con 1X PBS.
  4. Coloque el tejido en una placa de cultivo de 6 cm de células para distinguir entre miometrio y endometrio capas (refiérase a las Figuras 2A-2C para una descripción adicional). Separe el endometrio.
  5. Uso de una hoja de bisturí o la maquinilla de afeitar, seccionar el tejido en trozos pequeños, mientras que rascarse en la placa de cultivo de 6 cm de células. Estos arañazos facilitar la fijación de las células endometriales primarios emergentes. En comparación con el método de tripsina, se necesita más tejido (véase la Figura 2D para una aproximación).
  6. Suavemente, añadir 2 ml de medio de cultivo para el plato rayado (fragmentos de tejido serán visibles e idealmente inmovilizado a partir del movimiento de rasguño).
  7. Transferencia de la placa (s) a una incubadora de cultivo celular designada (37 ° C y 5% de CO 2). Designe un lugar para que las líneas de células primarias, lejos de other placas de cultivo celular. Los cultivos primarios son más sensibles a la infección y la contaminación.
  8. Examine las células bajo un microscopio de luz diaria. Pequeñas poblaciones de células deberían surgir por dos o tres días a partir de alrededor de los tejidos en rodajas (ver Figura 3B).
  9. Para mantener los cultivos, lavar suavemente con 1X PBS y añadir medio de cultivo fresco (2 ml) cada tres días. Cuando aumenta la tasa de proliferación, el medio de crecimiento adicional (3-4 ml) se pueden añadir a la placa de cultivo de 6 cm (s).
    Nota: Durante el lavado y los medios de comunicación los cambios, es probable que se aspiraron piezas de tejido. Esto no va a afectar el crecimiento de células adherentes. Las muestras de tejido deben ser aspirados por el paso subsiguiente (2,10), como es probable que surjan después de una semana de nuevas colonias.
  10. Cuando la placa de 6 cm es aproximadamente el 75 - 80% confluentes (véase la Figura 3B), el paso usando 0,05% de tripsina. Las células primarias no pueden ser pasados ​​por tiempo indefinido - congelar por una placa de células tan pronto como dos o tres placas son maintained. Si se requieren más pasos, siga un protocolo de inmortalización (revisado en Ref. 3).

3. Preparación de líneas celulares primaria mediante el método de tripsina

  1. Coloque un pedazo pequeño de tejido endometrial (ver Figura 2D para una aproximación) en 2 ml de tripsina al 0,25% suplementado con kanamicina (0,03 mg / ml de concentración final).
  2. Incubar el tejido a 37 ° C en la plataforma giratoria durante 30 min.
  3. Brevemente agite el tejido.
  4. Centrifugar la muestra a 200-400 xg durante 2 min y descartar el sobrenadante.
  5. Añadir tripsina fresca y kanamicina.
  6. Incubar el tejido a 37 ° C mientras se hace girar por una hora.
  7. Agite el tejido durante 5-10 segundos.
  8. Añadir 2 ml de medio de crecimiento (suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina) para desactivar la tripsina.
  9. Centrifugar las células a 200-400 xg durante 2-3 min.
  10. Desechar el sobrenadante y añadir 2 ml de cultivoª medios a las células sedimentadas.
  11. Placa sobre una placa de cultivo de 6 cm de células. Raspar la placa como en el Paso 2.5 Preparación de líneas celulares primaria mediante el método de raspado no es necesario, pero facilita la unión y el crecimiento de los cultivos primarios.
  12. Monitorear las células bajo un microscopio de luz diaria. Las células son generalmente visibles con un microscopio óptico después de 24 a 48 horas (ver Figura 3 C).
  13. Para mantener los cultivos, monitorear las células y cambiar el medio cada 2-3 días como en el paso 2.9.
  14. Para el paso de las células, utilizan 0,05% o 0,25% de tripsina cuando las células alcanzan 75-80% de confluencia (véase la Figura 3C).

4. Ahorro de tejido extra for Analysis (Snap Congelación y Fijación de formalina)

  1. Lavar la muestra dos veces con 1X PBS.
  2. Aspirar la mayor cantidad de líquido posible.
  3. Para Snap congelación, coloque la muestra de tejido endometrial en un tubo de centrífuga de 1,7 (ver Figuras 2F y 2G). Coloque el 1,7tubo de centrífuga en nitrógeno líquido durante 10 segundos o hasta que se puede ver que el tejido ha congelado hacia abajo.
    Nota: Tenga cuidado de no tocar directamente el nitrógeno líquido en la preparación de muestras. Las muestras se pueden almacenar a -80 ° C hasta su posterior procesamiento o análisis.
  4. Para la fijación en formol, cortar un pequeño trozo de tejido endometrial (ver Figura 2 H) y sumergirlo en el 10% formalina tamponada zinc. Después de 24 horas, deseche formalina y añadir etanol al 70% para muestras de tejido hasta su posterior procesamiento.

5. Inmunofluorescencia (IF)

  1. La fijación de la célula
    1. Preparar las células en un portaobjetos de la cultura o de la placa.
    2. Suavemente, lavar las células con PBS 1X.
    3. Añadir pre-enfriada (4 º C) metanol y acetona (mezclado en una proporción de 1:1) durante 5 min.
    4. Seque el portaobjetos antes de proceder. Slide se puede almacenar a 4 ° C durante 1-2 semanas si es necesario.
  2. Procesamiento SI
    1. Rehidrate células con 1X PBS durante 10 min. Para la following los pasos 1-6, llevar a cabo todos los lavados e incubaciones en una plataforma giratoria.
    2. Bloquear usando 1X PBS suplementado con 1% albúmina de suero bovino (BSA) y 1% de especies de suero específico (fuente de anticuerpo 2 º) durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Incubar en anticuerpo primario (ver las recomendaciones del fabricante para las diluciones de anticuerpos). Ver Sustancias de anticuerpos específicos. Diluir el anticuerpo primario en tampón de bloqueo fresco como en el Paso 5.2.2. Esta incubación puede llevarse a cabo durante al menos 2 horas a RT o durante la noche a 4 ° C.
    4. Lavar 3 veces con 1X PBS durante 5 min cada uno.
    5. Incubar en anticuerpo secundario (ver las recomendaciones del fabricante para las diluciones de anticuerpos). Diluir el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo fresco como en el Paso 5.2.2. Para evitar la foto-blanqueo, es importante llevar a cabo esto y los pasos subsiguientes en la ausencia de luz.
    6. Lavar 3 veces con 1X PBS durante 5 min cada uno.
    7. Thoroughly secar las diapositivas.
    8. Añadir un medio de montaje y solución de contratinción DAPI.
    9. Aplicar cubreobjetos y sellar los bordes usando sellante (s). Los portaobjetos se pueden almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas.

6. Extracción de ARN

  1. Pellet 1 x 10 7 células por centrifugación. Todos los materiales y reactivos de este protocolo deben RNasa libre.
  2. Lisar células en 1 ml de reactivo de TRIZOL, e incubar las muestras se homogeneizaron durante 10 min a temperatura ambiente para completar la disociación de los complejos de nucleoproteínas.
  3. Añadir 200 l de cloroformo por 1 ml de TRIZOL. Agitar enérgicamente a mano durante 15 segundos y se incuba durante 2-3 minutos a temperatura ambiente.
  4. Se centrifuga a la velocidad máxima (15.000 xg) durante 15 min a 4 ° C. Darán como resultado tres capas.
  5. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga nuevo. Añadir 1 l de glucógeno para aumentar el rendimiento de ARN; Sin embargo, este paso sólo es necesario cuando un pequeñoSe prevé cantidad de ARN.
  6. Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico a la capa acuosa, y invertir las muestras 3-5 veces. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. Para aumentar el rendimiento, las muestras se pueden colocar en -20 ° C o -80 ° C durante 30 min.
  7. Centrifugar a máxima velocidad durante 10 min a 4 ° C.
  8. En este punto, un pequeño sedimento de ARN debe ser visible. Eliminar el sobrenadante.
  9. Lavar el ARN con 1 ml de etanol al 75%.
  10. Centrifugar a máxima velocidad durante 5 min y descartar el sobrenadante. Las muestras se pueden lavar una vez más para eliminar contaminantes inorgánicos, pero este paso no es necesario.
  11. En pocas palabras, se seca el precipitado de ARN hasta el ARN de pellets está seca (por lo general toma 7-10 min).
    Nota: Un paso adicional puede ser utilizado para disminuir la materia inorgánica y disminuir el tiempo de secado. Después de desechar el sobrenadante del lavado con etanol, las muestras de centrifugado a la velocidad máxima durante un minuto adicional y aspirar líquido residual. Tenga cuidado de no aspirar pellet.
  12. Disolver ARN en agua libre de RNasa, dependiendo del tamaño del sedimento de ARN. Los volúmenes varían típicamente desde 10 hasta 50 l.
  13. Incubar las muestras a 55 ° C durante 10 min, y medir la concentración de ARN.
  14. Almacene las muestras a -20 ° C hasta su posterior procesamiento.

7. Transcripción inversa

  1. Llevar el ARN de la muestra (1-3 mg) hasta un volumen de 9 l con H 2 O.
  2. ARN de calor a 70 ° C durante 10 min.
  3. Para generar una mezcla maestra de AMV, combinar los siguientes reactivos: 5 l de dNTP (concentración de trabajo de 50 mM), 5 l de oligos de ADN N6 (concentración de trabajo de 80 mM), 5 l de tampón 5X de AMV, y 1 l de AMV . Esta solución de mezcla maestra está diseñado por una muestra.
  4. Añadir 16 l de la mezcla maestra a la ARN climatizada. El volumen final de reacción será de 25 l de reacción.
  5. Utilice las siguientes condiciones de PCR para la transcripción inversa: (Etapa 1) 42 ° C durante 90 min, (StaGE 2) 95 ° C durante 5 min, y (Etapa 3) 4 ° C hasta su posterior procesamiento.

8. Tiempo real PCR

  1. Llevar a cabo las reacciones de PCR usando los cebadores, temperaturas de recocido, los números de ciclo, y los reactivos se encuentran en la Tabla 1.
    Nota: Es ideal para seguir las instrucciones del fabricante al usar reactivos de PCR (consulte los números de la empresa y catálogo de Materiales).

9. In vitro Protocolo decidualization (Derivado de Ref. 4 y 5)

  1. Placa células endometriales.
  2. Haga crecer hasta una confluencia del 75-85%.
  3. Después las células se vuelven confluentes, lavar una vez con PBS 1X.
  4. Rápidamente, agregar elementos multimedia sin hormonas (fenol libre de RPMI suplementado con 5% de carbón tira de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina).
  5. Después de 24 horas, agregue los medios libres de hormonas complementadas con acetato de medroxiprogesterona (MPA) a una concentración final de 1 mM y 8-bromoadenosine 3 ', 5'Monofosfato cíclico (AMPc) a una concentración final de 0,5 mM.
  6. Después de al menos 48 horas, detener la reacción y salvar a la placa (s) para su posterior procesamiento.

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Resultados

Como se destaca en la sección Protocolo, asegúrese de llevar a cabo todos los métodos en el gobierno, institucionales y directrices éticas al manipular y preparar los tejidos humanos.

Se incluyen en este manuscrito es una ilustración del flujo de trabajo general de "el método de raspado" (Figura 1A) y "el método de tripsina" (Figura 1B) se utiliza para establecer cultivos endometriales primarios. Estos métodos se ...

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Discusión

Otros grupos han descrito y adaptado metodología para la preparación de cultivos estromales endometriales, la mayoría de los cuales utilizan colagenasa 4,12,13,15-18. En este manuscrito, hemos proporcionado la metodología y la evidencia de dos métodos de cultivo estromal simplificados primarias endometrial, los cuales son utilizados por nuestro laboratorio por razones económicas y de la disponibilidad adecuada de tripsina y / o una hoja de afeitar.

Al comparar nuestros dos m...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que la divulgación.

Agradecimientos

Damos las gracias a los esfuerzos de colaboración de Dr. Thao Dang y los miembros de su laboratorio para el uso de su equipo de imagen y el microscopio. También agradecemos al biorepositorio y Tejidos del centro de investigación (BTRF) núcleo, Jeff Harper, y los residentes de la Universidad de Virginia para que nos proporciona el tejido uterino. Damos las gracias a Karol Szlachta por la ayuda con Esquema general.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin HycloneSH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube  Genesee Scientific22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette  Genesee Scientific24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube Hyclone339650
50 ml Conical Tube Hyclone339652
6 cm Cell Culture Dish Thermo scientific12-556-002
8 well Chambers Thermo ScientificAB-4162
Acetate Fisher scientificC4-100
AMV RT Enzyme/Buffer Bio LabsM077L
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher ScientificBP-1605-100
Buffered Zinc Formalin Thermo59201ZF
Charcoal strip FBS FisherNC9019735
Chloroform Fisher ScientificBP1145-1
Cover slip Fisher Brand12-544D
Cyclic AMP (cAMP) SigmaB7880
DMEM/High Glucose HycloneSH30243FS
dNTP BiolineBIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC Santa CruzSC-3855
Donkey Serum Jackson’s lab017-000-002
E Cadherin Antibody  Epitomics1702-1
Ethanol Fisher ScientificBP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific03-600-511
Fungizone Amphotericin B Gibco15290-018
GAPDH Probe Life TechnologiesHS99999905
Glycogen 5Prime2301440
Goat Anti Mouse - FITC Jackson’s Lab115-096-003
Isopropanol Fisher ScientificBP2618-1
Kanamycin  Fisher ScientificBP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA) SigmaM1629
MeOH (Methanol) Fisher ScientificA4-08-1
Mounting Media (w/DAPI) Vector LabratoriesH-1500
N6 DNA Oligos Invitrogen
Number 15 Scraper  BD371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB Cell Signaling4545
PBS (phosphate buffered saline) Fisher ScientificBP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X  HycloneSV30082.01
PML Anti Goat Anti body Santa CruzSC-9862
Primer(s) Eurofins
RPMI HycloneSH30027FS
RPMI (Phenol free) Gibco11835
Sybr Green  Thermo ScientificAB-4162
Taqman ThermoAB-4138
Trizol Life Technologies15596018
Vimentin Antibody Epitomics4211-1

Referencias

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