JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Создание первичных эндометрия системы стромальных клеточных культур от гистерэктомии образцов является ценным биологическим техника и решающим шагом до проводит широкий спектр исследований направлена. Здесь мы описываем два методы, используемые для установления стромальных культур из хирургически удаленных эндометрия тканях больных людей.

Аннотация

Много усилий было посвящено установить в пробирке системах клеточных культур. Эти системы предназначены для моделирования огромное количество естественных условиях процессов в. Клеточные культуры системы, вытекающие из эндометрия образцов человека не являются исключением. Область применения простирается от нормальных циклических физиологических процессов в эндометрии патологий, таких как гинекологического рака, инфекционных заболеваний, а также репродуктивных недостатков. Здесь мы предоставляем два метода для создания первичных эндометрия стромальных клеток из хирургически удаленных эндометрия гистерэктомии образцов. Первый метод называют "методом очищающего" и включает в себя механическое выскабливание с помощью хирургических или бритвенных лезвий в то время как второй метод называют "метод трипсин". Этот последний метод использует ферментативную активность трипсина, чтобы способствовать отделению клеток и первичных клетки вырост. Проиллюстрируем шаг за шагом методологии с помощью цифровых изображений и микроскопии. Мы также Providпримеры е для проверки эндометрия линии стромальных клеток с помощью количественных реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) и иммунофлюоресценции (ИФ).

Введение

Человеком матки корпус состоит из трех слоев, в периметрий (или серозной), миометрия и эндометрия. Отличительные каждый из этих слоев является важным шагом для установления эндометрия клеточных линий. Периметрий является самой внешней слой матки и состоит из тонких, серозных клеток. Миометрия является толстый, средний слой матки и состоит из гладкомышечных клеток. Эндометрий идентифицируется как внутреннего слоя матки и включает эпителиальные и стромальных клеток населения.

Эндометрий далее подразделяется в базального слоя которого стволовых клеток населения Предполагается для повторного заполнения functionalis слой примерно каждый 28 дней 1. Functionalis слой человеческого эндометрия претерпевает значительные биохимические и морфологические изменения в связи с циркулирующих гормонов. Эти гормоны являются производными от гипофиза и яичников.

координирует производство и выброс гормонов приводит к репродуктивного цикла. Репродуктивный цикл предназначен для подготовки эндометрия для потенциальных событий имплантации эмбриона. У людей, репродуктивный цикл известен как "менструального цикла" и делится на три этапа - пролиферативная, секреторных и менструальных. Пролиферативная фаза включает в себя пролиферацию functionalis эндометрия слоя в то время как секреторная фаза отмечена functionalis созревания. В частности, внеклеточные изменения, выделениями и клеточная дифференцировка сигнал потенциального имплантации. Если имплантация не происходит до конца секреторную фазу, functionalis эндометрия слой пролить в течение менструального фазы. Важность менструации и событий, которые вызывают пролития на functionalis слоя все еще обсуждаются. В организме человека он был поставлен что менструации является результатом конкретного события середины секреторную фазу дифференцировки известнойкак "спонтанное decidualization" 2. В этой рукописи, мы предоставляем подробную методологию для обеих эндометрия методов изоляции стромальных клеток, и использовать комбинацию иммунофлюоресценции и цифровых изображений, чтобы продемонстрировать эффективность этих подходов. Кроме того, мы применяем обычно используют искусственное модели спонтанного decidualization для подтверждения изоляции эндометрия стромальных клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Гистерэктомия образцы, используемые в этой рукописи были собраны в соответствии с Университетом IRB-утвержденным протоколом этики пронумерованных IRB-HSR # 14424.

1. Приобретение Образец от клинической Источник

  1. Получить правительство и учреждение на основе этических принципов и документацию утверждения перед началом.
  2. Провести все шаги в стерильных условиях.
  3. Сохранение пациента, полученных ткани в медиа-среде RPMI (или DMEM с высоким содержанием глюкозы /) в 50 мл пробирку при 4 ° С, если образец не может быть обработан в культуре немедленно. В течение максимум 24 часов Образцы могут храниться в этом состоянии.
  4. Промыть образец ткани три раза стерильной 1X фосфатно-буферным раствором (PBS) и отменить решение между стирок.

2. Подготовка первичных клеточных линий с использованием очищающего метод

  1. Добавить 4-10 мл питательной среды (RPMI или DMEM с высоким содержанием глюкозы /, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-streptomyCIN) в ткани и добавить Fungizone (0,25 мкг / мл конечная концентрация) в течение 30 мин.
  2. Откажитесь от средств массовой информации роста.
  3. Вымойте ткань дважды 1X PBS.
  4. Поместите ткань на планшет для культивирования 6 см клеток различать миометрия и эндометрия слоев (см. рис 2А-2С также описание). Отделите эндометрий.
  5. Использование скальпеля или лезвия бритвы, секут ткани на мелкие кусочки, почесывая на блюдо 6 см клеточной культуре. Эти царапины облегчить присоединение развивающихся первичных клеток эндометрия. По сравнению с методом трипсина, больше ткани требуется (см. рисунок 2D для приближения).
  6. Аккуратно добавьте 2 мл питательной среды для поцарапал блюдо (фрагменты ткани будут видны и в идеале иммобилизованных от движения царапин).
  7. Передача пластину (ы) для назначенного инкубаторе для клеточных культур (37 ° C и 5% CO 2). Назначить место для линий первичных клеточных, от др.э клеточных культур блюда. Первичные культуры более чувствительны к инфекции и контаминации.
  8. Осматривают клетки под световым микроскопом ежедневно. Небольшие популяции клеток должна выйти на второй или третий день со всего нарезанных тканей (см. рис 3B).
  9. Для поддержания культуры, мыть осторожно с 1X PBS и добавить свежей питательной средой (2 мл) каждые три дня. При увеличении скорости пролиферации, дополнительные носители роста (3-4 мл) можно добавить к 6 см культуральный планшет (ы).
    Примечание: Во время стирки и СМИ изменений, кусочки ткани, вероятно, будет атмосферный. Это не повлияет на рост ненужных клеток. Кусочки ткани следует всасывается последующей стадии (2.10), поскольку новые колонии вряд ли появится после одной недели.
  10. Когда 6 см пластины составляет примерно 75 - 80% сливной (см. рисунок 3B), прохождение с помощью 0,05% трипсина. Первичные элементы не могут быть пассировать на неопределенный срок - заморозить вниз на одну тарелку клеток, как только два или три пластины маintained. Если несколько каналов требуется, выполните протокол увековечении (обзор в работе 3).

3. Подготовка первичных клеточных линий с использованием трипсин метод

  1. Поместите небольшой кусочек ткани эндометрия (см. рис 2D для приближения) в 2 мл 0,25% трипсина с добавлением канамицина (0,03 мг / мл конечная концентрация).
  2. Инкубируйте ткани при 37 ° С на вращающихся платформу в течение 30 мин.
  3. Кратко вихрь ткани.
  4. Центрифуга образца при 200-400 мкг в течение 2 мин и отбросить супернатант.
  5. Добавить свежий трипсин и канамицин.
  6. Инкубируйте ткани при 37 ° С при вращении в течение часа.
  7. Vortex ткани для 5-10 сек.
  8. Добавить 2 мл питательной среды (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин), чтобы отключить трипсина.
  9. Центрифуга клетки при 200-400 мкг в течение 2-3 мин.
  10. Удалите супернатант и добавить 2 мл Growй СМИ к гранулированных клеток.
  11. Пластина на чашку 6 см клеточной культуре. Зачистка тарелку, как в шаге 2.5 Подготовка первичных клеточных линий с использованием очищающего метод не является необходимым, но усиливает привязанность и разрастание первичных культурах.
  12. Монитор клетки под световым микроскопом ежедневно. Клетки обычно видны под световым микроскопом после 24-48 часов (см. фиг.3С).
  13. Для поддержания культур, мониторинг клетки и изменить медиа каждые 2-3 дня, как в шаге 2.9.
  14. Для прохождения клетки, используйте 0,05% или 0,25% трипсин, когда клетки достигают 75-80% слияния (см. рис 3в).

4. Сохранение дополнительных ткани для анализа (SNAP Холодильные и формалина крепление)

  1. Вымойте образец дважды 1X PBS.
  2. Аспирируйте столько жидкости, сколько возможно.
  3. Для оснастки замораживания поместите образец ткани эндометрия в 1,7 трубки центрифуги (см. рис 2F и 2G). Наведите 1,7центрифужную пробирку в жидком азоте в течение 10 сек или до можно видеть, что ткань замораживали.
    Примечание: Будьте осторожны, не прикасайтесь непосредственно жидкого азота при подготовке образцов. Образцы можно хранить при -80 ° С до дальнейшей обработки или анализа.
  4. Для формалина фиксации, вырезать небольшой кусочек ткани эндометрия (см. рис 2H), и погрузите в 10% буферном цинка формалина. Через 24 ч отбрасывать формалин и добавить 70% этанола в образцах ткани до дальнейшей обработки.

5. Иммунофлуоресценции (ИФ)

  1. Фиксация Сотовый
    1. Подготовка клеток на культуральной слайда или пластины.
    2. Осторожно, мыть клетки с 1X PBS.
    3. Добавить предварительно охлажденной (4 ° С) метанола и ацетона (смешивали в соотношении 1:1) в течение 5 мин.
    4. Воздух сухой слайд прежде чем продолжить. Slide можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1-2 недель, если это необходимо.
  2. Обработка ЕСЛИ
    1. Увлажняет клетки с 1X PBS в течение 10 мин. Для FOllowing шаги 1-6, проводить все моет и инкубации на вращающейся платформе.
    2. Блок использованием 1X PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1% видов конкретных сыворотки (источник 2-й антитела) в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Выдержите в первичных антител (см. производителей рекомендации для разведения антител). См. Материалы для специфических антител. Развести первичных антител в свежем буфере блокирующего как на шаге 5.2.2. Это инкубирование может быть проведено в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
    4. Промыть 3 раза с 1X PBS в течение 5 мин каждый.
    5. Выдержите в вторичными антителами (см. производителей рекомендации для разведения антител). Развести вторичного антитела в свежем буфере блокирующего, как в шаге 5.2.2. Для предотвращения фото-отбеливание, важно проводить это и последующие шаги в отсутствие света.
    6. Промыть 3 раза с 1X PBS в течение 5 мин каждый.
    7. Thoroughlу высохнуть слайды.
    8. Добавить монтажные СМИ и DAPI контрастного решение.
    9. Применить покровное и запечатать края с использованием герметика (ы). Слайды можно хранить при температуре 4 ° С в темноте в течение до 2 недель.

6. Экстракция РНК

  1. Гранул 1 × 10 7 клеток путем центрифугирования. Все материалы и реагенты в этом протоколе должны быть РНКазы.
  2. Клетки лизируют в 1 мл реагента TRIZOL и инкубировать гомогенизированных образцов в течение 10 мин при комнатной температуре до полной диссоциации комплексов нуклеопротеидных.
  3. Добавить 200 мкл хлороформа на 1 мл TRIzol. Встряхивать вручную в течение 15 с и инкубировать в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
  4. Центрифуге при максимальной скорости (15000 мкг) в течение 15 мин при 4 ° С. Три слоя приведет.
  5. Передача верхнюю водную фазу в свежую пробирку микроцентрифужных. Добавить 1 мкл гликогена увеличить выход РНК; Однако, этот шаг необходим только когда маленькийколичество РНК ожидается.
  6. Добавить 0,5 мл изопропилового спирта к водному слою, и инвертировать образцы в 3-5 раз. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин. Чтобы увеличить выход, образцы могут быть помещены в -20 ° С или -80 ° С в течение 30 мин.
  7. Центрифуге при максимальной скорости в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. В этот момент, небольшой осадок РНК должны быть видны. Удалите супернатант.
  9. Вымойте РНК с 1 мл 75% этанола.
  10. Центрифуге при максимальной скорости в течение 5 мин и отбросить супернатант. Образцы можно мыть больше, чтобы избавиться неорганические загрязнения один раз, но этот шаг не является необходимым.
  11. Вкратце, высушить РНК гранул до осадок РНК не высохнет (обычно занимает 7-10 мин).
    Примечание: Еще один шаг может быть использован для уменьшения неорганические вещества и уменьшить время сушки. После удаления супернатанта из этанола стирки, образцов спиновых на максимальной скорости за дополнительную минуту и ​​аспирации остаточной жидкости. Будьте осторожны, не аспирации осадок.
  12. Растворить в РНК РНКазы без воды, в зависимости от размера гранул РНК. Объемы обычно составляет от 10-50 мкл.
  13. Инкубируйте образцы при 55 ° С в течение 10 мин, и измерения концентрации РНК.
  14. Храните образцы при -20 ° С до дальнейшей обработки.

7. Обратной транскрипции

  1. Доведите образца РНК (1-3 мкг) до объема 9 мкл Н 2 О.
  2. Тепло РНК до 70 ° С в течение 10 мин.
  3. Чтобы создать основной смеси AMV, объединить следующие реагенты: 5 мкл дНТФ (рабочий концентрация 50 мкМ), 5 мкл олигонуклеотидов ДНК (N6 работает концентрации 80 мкМ), 5 мкл 5X из AMV буфера и 1 мкл AMV . Это решение мастером микс предназначен в одном образце.
  4. Добавить 16 мкл мастер-микс к нагретой РНК. Конечный реакционный объем будет 25 мкл реакции.
  5. Используйте следующие ПЦР условия для обратной транскрипции: (1 этап) 42 ° C в течение 90 мин, (STAGE 2) 95 ° C в течение 5 мин, и (Этап 3) 4 ° С до дальнейшей обработки.

8. Настоящее ПЦР Время

  1. Проведение ПЦР-реакции с использованием праймеров, температуры отжига номера цикла, и реагенты, найденные в таблице 1.
    Примечание: Это идеальное место, чтобы следовать инструкциям производителя при использовании ПЦР реагенты (см. каталог компании и чисел в материалах).

9. Экстракорпоральное Decidualization протокол (полученный из работы 4 и 5)

  1. Plate клетки эндометрия.
  2. Расти к слияния 75-85%.
  3. После клетки становятся сливающиеся, мыть один раз с 1X PBS.
  4. Быстро, добавить гормонов без СМИ (Фенол бесплатно RPMI с добавлением 5% угля полосы FBS и 1% пенициллин-стрептомицина).
  5. После 24 часов, добавить гормональные бесплатно среде с медроксипрогестеронацетата (MPA) в конечной концентрации 1 мкМ и 8-bromoadenosine 3 ', 5'-Циклического монофосфата (цАМФ) в конечной концентрации 0,5 мМ.
  6. После по меньшей мере 48 ч, остановить реакцию и сохранить пластину (ы) для дальнейшей обработки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Как подчеркивается в разделе протокола, обязательно проводить все методы в рамках государственных, институциональных и этических принципов при обращении и подготовки ткани человека.

В эту рукопись является иллюстрацией общего процесса по методу "очищающе?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Другие группы описали и адаптированы методологии для подготовки эндометрия стромальных культур, большинство из которых используют коллагеназы 4,12,13,15-18. В этой рукописи, мы обеспечили методику и доказательства в течение двух упрощенных первичных стромальных эндометрия методов ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим совместные усилия доктора Тао Данг и членов своей лаборатории за использование их изображений и микроскопа оборудования. Мы также благодарим Biorepository и тканей исследований фонда (BTRF) основной, Джефф Харпер и жителей в университете Вирджинии за предоставление нам ткани матки. Мы благодарим Karol шляхты за помощь с схематический обзор.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin HycloneSH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube  Genesee Scientific22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette  Genesee Scientific24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube Hyclone339650
50 ml Conical Tube Hyclone339652
6 cm Cell Culture Dish Thermo scientific12-556-002
8 well Chambers Thermo ScientificAB-4162
Acetate Fisher scientificC4-100
AMV RT Enzyme/Buffer Bio LabsM077L
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher ScientificBP-1605-100
Buffered Zinc Formalin Thermo59201ZF
Charcoal strip FBS FisherNC9019735
Chloroform Fisher ScientificBP1145-1
Cover slip Fisher Brand12-544D
Cyclic AMP (cAMP) SigmaB7880
DMEM/High Glucose HycloneSH30243FS
dNTP BiolineBIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC Santa CruzSC-3855
Donkey Serum Jackson’s lab017-000-002
E Cadherin Antibody  Epitomics1702-1
Ethanol Fisher ScientificBP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific03-600-511
Fungizone Amphotericin B Gibco15290-018
GAPDH Probe Life TechnologiesHS99999905
Glycogen 5Prime2301440
Goat Anti Mouse - FITC Jackson’s Lab115-096-003
Isopropanol Fisher ScientificBP2618-1
Kanamycin  Fisher ScientificBP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA) SigmaM1629
MeOH (Methanol) Fisher ScientificA4-08-1
Mounting Media (w/DAPI) Vector LabratoriesH-1500
N6 DNA Oligos Invitrogen
Number 15 Scraper  BD371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB Cell Signaling4545
PBS (phosphate buffered saline) Fisher ScientificBP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X  HycloneSV30082.01
PML Anti Goat Anti body Santa CruzSC-9862
Primer(s) Eurofins
RPMI HycloneSH30027FS
RPMI (Phenol free) Gibco11835
Sybr Green  Thermo ScientificAB-4162
Taqman ThermoAB-4138
Trizol Life Technologies15596018
Vimentin Antibody Epitomics4211-1

Ссылки

  1. Heller, D. in The endometrium: a clinicopathologic approach. Heller, D. , 56-75 (1994).
  2. Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
  3. Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
  4. Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
  5. Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
  6. Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
  7. Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
  8. Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
  9. Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
  10. Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
  11. Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
  12. Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
  13. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
  14. Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
  15. Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
  16. Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
  17. Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
  18. Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
  19. Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
  20. Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
  21. Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
  22. American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322 (2013).
  23. Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

87decidualization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены