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Resumo

Estabelecimento de sistemas de cultura primária de células do estroma endometrial a partir de espécimes de histerectomia é uma técnica biológica valioso e um passo crucial antes de prosseguir uma vasta gama de pesquisa objetiva. Aqui, descrevemos dois métodos utilizados para estabelecer culturas de tecidos do estroma endometriais ressecados cirurgicamente de pacientes humanos.

Resumo

Muitos esforços têm sido dedicados a estabelecer em sistemas de cultura de células in vitro. Estes sistemas são concebidos para modelar um vasto número de processos in vivo. Sistemas de cultura de células resultantes de amostras endometriais humanos não são excepção. As aplicações vão desde processos fisiológicos normais cíclicos de patologias endometriais, tais como cancros ginecológicos, doenças infecciosas, e deficiências na função reprodutora. Aqui, oferecemos dois métodos para o estabelecimento de células estromais endometriais primários de espécimes ressecados cirurgicamente histerectomia endometriais. O primeiro método é referido como "o método de raspagem" e incorpora raspagem mecânica usando lâminas cirúrgicas ou de barbear ao passo que o segundo método é denominado "o método de tripsina." Este último método utiliza a actividade enzimática da tripsina para promover a separação de células e primário conseqüência celular. Nós ilustramos metodologia passo-a-passo através de imagens digitais e microscopia. Nós também provide exemplos para validar as linhas de células estromais do endométrio através de tempo real, as reacções em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e imunofluorescência (IF).

Introdução

O corpo do útero humano é composto por três camadas, a perimétrio (ou serosa), miométrio e endométrio. Distinguindo cada uma destas camadas é um passo importante para estabelecer linhas de células do endométrio. O perimétrio é a camada mais exterior do útero e do composto, as células serosas finas. O miométrio é a espessura da camada, meio do útero e composta por células de músculo liso. O endométrio é identificada como a camada interna do útero e inclui populações epiteliais e células estromais.

O endométrio é subdividida na camada basal, cuja população de células-tronco é a hipótese de repovoar a camada functionalis aproximadamente a cada 28 dias 1. A camada functionalis do endométrio humano é submetido a alterações bioquímicas e morfológicas significativas na resposta a hormonas circulantes. Estas hormonas são derivados a partir da glândula pituitária e os ovários.

Oprodução coordenada e liberação de hormônios resulta em um ciclo reprodutivo. O ciclo reprodutivo é projetado para preparar o endométrio para potenciais eventos de implantação do embrião. Nos seres humanos, o ciclo de reprodução é conhecido como "ciclo menstrual" e divide-se em três fases - proliferativa, secretora, e menstruais. A fase proliferativa envolve a proliferação do endométrio functionalis camada enquanto que a fase de secreção está marcada por functionalis maturação. Especificamente, as alterações extracelulares, secreções e diferenciação celular sinalizar uma implantação potencial. Se o implante não ocorrer antes do final da fase de secreção, a camada functionalis endométrio é eliminado durante a fase menstrual. A importância da menstruação e os eventos que provocam o desprendimento da camada functionalis ainda estão sendo debatidas. Nos seres humanos, tem-se colocado que a menstruação é o resultado de um evento específico mid-secretora diferenciação fase conhecidacomo "decidualização espontânea" 2. Neste manuscrito, nós fornecemos metodologia detalhada para ambos os métodos de isolamento de células do estroma endometrial, e usar uma combinação de imunofluorescência e imagens digitais para demonstrar a eficácia dessas abordagens. Além disso, foi aplicado um comumente utilizado em modelo in vitro de decidualização espontânea para confirmar o isolamento de células do estroma endometrial.

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Protocolo

Espécimes de histerectomia utilizadas neste manuscrito foram coletadas em concordância com um protocolo de ética da Universidade IRB-aprovado numeradas IRB-HSR # 14424.

1. Aquisição de exemplo de origem clínica

  1. Obter governo e diretrizes éticas baseadas em instituições e documentação de aprovação antes de começar.
  2. Realizar todas as etapas condições estéreis.
  3. Preservar tecido derivado do paciente em meio (RPMI ou DMEM / Glucose alta) em um tubo de 50 ml a 4 ° C, se a amostra não pode ser processada em cultura imediatamente. As amostras podem ser armazenadas neste estado por um período máximo de 24 horas.
  4. Lavar amostra de tecido, três vezes com 1X tampão fosfato salino estéril (PBS) e descartar a solução entre as lavagens.

2. Preparação de linhas de células primárias, utilizando o Método de raspagem

  1. Adicionar 4-10 ml de meio de crescimento (RPMI ou DMEM / alto teor de glucose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de Penicilina-streptomycin) de tecido e adiciona Fungizona (0,25 ug / ml de concentração final) durante 30 min.
  2. Descartar o meio de cultura.
  3. Lavar o tecido duas vezes com 1X PBS.
  4. Colocar o tecido de uma placa de cultura de 6 centímetros de células para distinguir entre miométrio e endométrio camadas (ver as Figuras 2A-2C para uma descrição mais detalhada). Separa-se o endométrio.
  5. Usando uma lâmina de bisturi ou navalha, transecto o tecido em pedaços pequenos, enquanto arranhando sobre o prato de cultura de seis centímetros celular. Estes riscos facilitar a fixação das células endometriais primárias emergentes. Em comparação com o método de tripsina, é necessário mais do tecido (ver Figura 2D para uma aproximação).
  6. Gentilmente, adicionar 2 ml de meio de cultura para prato riscado (fragmentos de tecido será visível e idealmente imobilizado a partir do movimento coçar).
  7. Transferir a placa (s) para uma incubadora de cultura de células designada (37 ° C e 5% CO 2). Designar um lugar para as linhas de células primárias, longe de other placas de cultura de células. As culturas primárias são mais sensíveis para a infecção e contaminação.
  8. Examine as células sob um microscópio de luz por dia. Pequenas populações de células que surgem de dois dias ou de três em torno dos tecidos cortadas (ver Figura 3B).
  9. Para manter as culturas, lavar cuidadosamente com PBS 1X e adicionar o meio de crescimento fresco (2 mL) a cada três dias. Quando aumenta a taxa de proliferação, o meio de crescimento adicional (3-4 ml) pode ser adicionado à placa de cultura de 6 centímetros (s).
    Nota: Durante a lavagem e mídia alterações, pedaços de tecido provavelmente será aspirado. Isso não vai afetar o crescimento de células aderentes. Pedaços de tecido deve ser aspirado pelo passo subsequente (2,10) como novas colónias é improvável que emergem após uma semana.
  10. Quando a placa de 6 cm é cerca de 75 - 80% confluentes (ver Figura 3B), a passagem utilizando 0,05% de tripsina. Pilhas não podem ser passadas por tempo indeterminado - congelar baixo uma placa de células assim que duas ou três placas são maintained. Se forem necessárias mais passagens, siga um protocolo de imortalização (revisado em Ref 3).

3. Preparação de linhas celulares primárias utilizando o Método de tripsina

  1. Coloque um pequeno pedaço de tecido endometrial (ver Figura 2D para uma aproximação) em 2 ml de tripsina a 0,25% suplementado com canamicina (0,03 mg / ml de concentração final).
  2. Incubar tecido a 37 ° C na plataforma rotativa durante 30 min.
  3. Resumidamente vortex do tecido.
  4. Centrifugar a amostra a 200-400 x g durante 2 min e desprezar o sobrenadante.
  5. Adicionar tripsina fresco e Kanamycin.
  6. Incubar o tecido a 37 ° C durante a rotação durante uma hora.
  7. Vortex o tecido durante 5-10 seg.
  8. Adicionar 2 ml de meio de crescimento (suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina) para desactivar a tripsina.
  9. Células centrifugar a 200-400 g durante 2-3 min.
  10. Desprezar o sobrenadante e adicionar 2 ml de crescerª mídia para as células peletizadas.
  11. Placa para um prato de cultura de 6 centímetros de células. Raspar a placa como no Passo 2.5 de Preparação Lines célula primária utilizando o Método raspagem não é necessário, mas melhora a fixação e crescimento de culturas primárias.
  12. Monitorar as células em um microscópio de luz por dia. As células são geralmente visíveis ao microscópio de luz após 24-48 horas (Figura 3C).
  13. Para manter as culturas, monitorar as células e meios de mudar a cada 2-3 dias, como no passo 2.9.
  14. Para passagem, as células, utilizar 0,05% ou 0,25% de tripsina, quando as células atingem 75-80% de confluência (ver Figura 3C).

4. Salvando tecido extra para Análise (pressão congelamento e formalina Fixation)

  1. Lavar as amostras duas vezes com 1X PBS.
  2. Aspirar o máximo de líquido possível.
  3. Por pressão de congelamento, coloque amostra de tecido endometrial em um tubo de centrífuga de 1,7 (ver Figuras 2F e 2G). Coloque a 1,7tubo de centrífuga, em azoto líquido durante 10 segundos ou até que ele pode ser visto que o tecido foi congelado para baixo.
    Nota: Tenha cuidado para não tocar diretamente nitrogênio líquido durante a preparação de amostras. As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C até processamento adicional ou análise.
  4. Para a fixação em formalina, corte um pequeno pedaço de tecido endometrial (ver Figura 2H), e submergir em 10% de formalina tamponada a zinco. Após 24 horas, descartar formalina e adicionar 70% de etanol para as amostras de tecido, até processamento posterior.

5. Imunofluorescência (IF)

  1. Fixação celular
    1. Prepare as células em um slide cultura ou prato.
    2. Delicadamente, lave as células com PBS 1X.
    3. Adicionar pré-arrefecida (4 ° C), metanol e acetona (misturadas a uma razão de 1:1) durante 5 min.
    4. O ar seco do slide antes de prosseguir. Slide pode ser armazenado a 4 ° C durante 1-2 semanas, se necessário.
  2. Processamento IF
    1. Rehidratar células com 1X PBS durante 10 min. Para o following Passos 1-6, realizar todas as lavagens e incubações em uma plataforma giratória.
    2. Bloco utilizando 1X PBS suplementado com 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) e 1% de espécies de soro específico (fonte de anticorpo 2 nd) durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
    3. Incubar no anticorpo primário (ver recomendações do fabricante para diluições de anticorpos). Consulte Materiais para detecção de anticorpos específicos. Dilui-se o anticorpo primário em tampão de bloqueio fresco como no Passo 5.2.2. Esta incubação pode ser realizada por pelo menos duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    4. Lavar 3 vezes com PBS 1X durante 5 minutos cada.
    5. Incubar no anticorpo secundário (ver recomendações do fabricante para diluições de anticorpos). Dilui-se o anticorpo secundário em tampão de bloqueio fresco como no Passo 5.2.2. Para evitar foto-branqueamento, é importante para a realização desta e os passos subsequentes na ausência de luz.
    6. Lavar 3 vezes com PBS 1X durante 5 minutos cada.
    7. Thoroughly secar os slides.
    8. Adicionar mídia de montagem e solução contracoloração DAPI.
    9. Aplicar lamela e selar as bordas com selante (s). As lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C no escuro, durante cerca de 2 semanas.

6. Extração de RNA

  1. Granulado de 1 x 10 7 células por centrifugação. Todos os materiais e reagentes neste protocolo deve ser livre de RNase.
  2. Lisar as células em 1 ml de reagente TRIZOL, e incuba-se as amostras homogeneizadas durante 10 min à temperatura ambiente para completar a dissociação de complexos nucleoproteicos.
  3. Adicionar 200 ul de clorofórmio por cada 1 ml de TRIZOL. Agitar vigorosamente à mão por 15 segundos e incubar por 2-3 min à temperatura ambiente.
  4. Centrifugar a uma velocidade máxima (15000 xg) durante 15 minutos a 4 ° C. Três camadas vai resultar.
  5. Transferir a fase aquosa superior para um tubo de microcentrifugação fresco. Adicionar 1 mL de glicogénio para aumentar o rendimento de ARN; no entanto, esta etapa só é necessária quando uma pequenaquantidade de ARN é antecipado.
  6. Adicionar 0,5 ml de álcool isopropílico para a camada aquosa, e inverter as amostras 3-5 vezes. Incubar as amostras a temperatura ambiente durante 10 min. Para aumentar o rendimento, as amostras podem ser colocadas em -20 ° C ou -80 ° C durante 30 min.
  7. Centrifugar a uma velocidade máxima durante 10 minutos a 4 ° C.
  8. Neste ponto, uma pequena bola de ARN deve ser visível. Desprezar o sobrenadante.
  9. Lava-se a ARN com 1 ml de etanol a 75%.
  10. Centrifugar a uma velocidade máxima durante 5 minutos e descarta-se o sobrenadante. As amostras podem ser lavadas mais para eliminar contaminantes inorgânicos, uma vez, mas este passo não é necessário.
  11. Resumidamente, secar o sedimento de ARN ARN até pelota é seca (normalmente demora 7-10 min).
    Nota: Um passo adicional pode ser usada para diminuir a matéria inorgânica e diminuir o tempo de secagem. Após o descarte do sobrenadante da lavagem de etanol, as amostras de rotação à velocidade máxima por mais um minuto e aspirado líquido residual. Tome cuidado para não aspirar pelota.
  12. Dissolve-se o ARN em água livre de RNase, dependendo do tamanho do sedimento de ARN. Volumes variam tipicamente 10-50 ul.
  13. Incubar as amostras a 55 ° C durante 10 min, e medir a concentração de ARN.
  14. Armazenar as amostras a -20 ° C até posterior processamento.

7. Transcrição Reversa

  1. Traga o ARN da amostra (1-3 mg) com um volume de 9 mL com H 2 O.
  2. ARN de calor a 70 ° C durante 10 min.
  3. Para gerar uma mistura principal de AMV, combinar os reagentes seguintes: 5 ul de dNTPs (concentração de trabalho de 50 uM), 5 ul de oligonucleótidos de ADN de N6 (concentração de trabalho de 80 uM), 5 ul de tampão 5X AMV, e 1 ul de AMV . Esta solução master mix foi concebido por uma amostra.
  4. Adicionar 16 ul da mistura de base para a ARN aquecida. O volume de reacção final de 25 ul de reacção.
  5. Use as seguintes condições de PCR para a transcrição reversa: (fase 1), 42 ° C por 90 min, (STAge 2) 95 ° C durante 5 min, e (Fase 3) 4 ° C até posterior processamento.

8. PCR em Tempo Real

  1. Realizar as reacções de PCR utilizando os iniciadores, a temperatura de recozimento, números de ciclos, e os reagentes presentes no Quadro 1.
    Nota: É ideal para acompanhar as instruções do fabricante ao utilizar reagentes de PCR (consulte os números da empresa e catálogo de materiais).

9. In vitro decidualização Protocol (Derivado Ref 4 e 5)

  1. Placa células endometriais.
  2. Crescer até uma confluência de 75-85%.
  3. Após as células se tornam confluentes, lavar uma vez com 1X PBS.
  4. Rapidamente, adicionar mídia sem hormônio (fenol livre RPMI suplementado com 5% de carvão tira FBS e 1% de penicilina-estreptomicina).
  5. Após 24 horas, adicionar mídia da hormona livre suplementados com acetato de medroxiprogesterona (MPA), a uma concentração final de 1 uM e 8-bromoadenosine 3 ', 5'Monofosfato cíclico (cAMP), a uma concentração final de 0,5 mM.
  6. Depois de pelo menos 48 horas, parar a reacção e salvar a chapa (s) para posterior processamento.

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Resultados

Conforme enfatizado na seção de protocolo, não se esqueça de realizar todos os métodos sob governo, institucionais e diretrizes éticas ao manusear e preparar o tecido humano.

Incluídos neste manuscrito é uma ilustração do fluxo de trabalho geral de "o método de raspagem" (Figura 1A) e "o método de tripsina" (Figura 1B) utilizados para estabelecer culturas primárias de endométrio. Estes métodos são descrito...

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Discussão

Outros grupos descritos e adaptado metodologia para a preparação de culturas do estroma do endométrio, a maioria dos quais utilizam colagenase 4,12,13,15-18. Neste manuscrito, nós fornecemos metodologia e evidências para dois métodos de cultura de estroma endometriais simplificados primários, os quais são utilizados por nosso laboratório por razões económicas ea disponibilidade conveniente de tripsina e / ou uma lâmina de barbear.

Ao comparar os nossos dois métodos, a...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgação.

Agradecimentos

Agradecemos os esforços de colaboração do Dr. Dang Thao e membros de seu laboratório para o uso de seus equipamentos de imagem e microscópio. Agradecemos também a biorepository e Tissue Research Facility (BTRF) núcleo, Jeff Harper, e os moradores da Universidade de Virginia por nos fornecer o tecido uterino. Agradecemos Karol Szlachta pela ajuda com esquemática Overview.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin HycloneSH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube  Genesee Scientific22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette  Genesee Scientific24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube Hyclone339650
50 ml Conical Tube Hyclone339652
6 cm Cell Culture Dish Thermo scientific12-556-002
8 well Chambers Thermo ScientificAB-4162
Acetate Fisher scientificC4-100
AMV RT Enzyme/Buffer Bio LabsM077L
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher ScientificBP-1605-100
Buffered Zinc Formalin Thermo59201ZF
Charcoal strip FBS FisherNC9019735
Chloroform Fisher ScientificBP1145-1
Cover slip Fisher Brand12-544D
Cyclic AMP (cAMP) SigmaB7880
DMEM/High Glucose HycloneSH30243FS
dNTP BiolineBIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC Santa CruzSC-3855
Donkey Serum Jackson’s lab017-000-002
E Cadherin Antibody  Epitomics1702-1
Ethanol Fisher ScientificBP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific03-600-511
Fungizone Amphotericin B Gibco15290-018
GAPDH Probe Life TechnologiesHS99999905
Glycogen 5Prime2301440
Goat Anti Mouse - FITC Jackson’s Lab115-096-003
Isopropanol Fisher ScientificBP2618-1
Kanamycin  Fisher ScientificBP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA) SigmaM1629
MeOH (Methanol) Fisher ScientificA4-08-1
Mounting Media (w/DAPI) Vector LabratoriesH-1500
N6 DNA Oligos Invitrogen
Number 15 Scraper  BD371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB Cell Signaling4545
PBS (phosphate buffered saline) Fisher ScientificBP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X  HycloneSV30082.01
PML Anti Goat Anti body Santa CruzSC-9862
Primer(s) Eurofins
RPMI HycloneSH30027FS
RPMI (Phenol free) Gibco11835
Sybr Green  Thermo ScientificAB-4162
Taqman ThermoAB-4138
Trizol Life Technologies15596018
Vimentin Antibody Epitomics4211-1

Referências

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