Due metodi per stabilire primarie cellule umane endometriale stromali da isterectomia campioni

Riepilogo

Stabilire sistemi di coltura primarie endometriali stromali di cellule da campioni di isterectomia è una tecnica biologica prezioso e un passo fondamentale prima di perseguire una vasta gamma di ricerca mira. Qui, descriviamo due metodi utilizzati per stabilire culture stromali da tessuto endometriale chirurgicamente resecati di pazienti umani.

Abstract

Molti sforzi sono stati dedicati ad elaborare sistemi di colture cellulari in vitro. Questi sistemi sono progettati per modellare un vasto numero di processi in vivo. Sistemi di colture cellulari derivanti da campioni endometriali umane non fanno eccezione. Le applicazioni spaziano dai normali processi fisiologici ciclici a patologie endometriali come i tumori ginecologici, malattie infettive, e carenze riproduttive. Qui, mettiamo a disposizione due metodi per stabilire cellule stromali endometriali primarie da campioni di isterectomia endometriale chirurgicamente asportati. Il primo metodo è indicato come "metodo raschiatura" e incorpora raschiatura meccanica usando lame chirurgiche o rasoio mentre il secondo metodo è chiamato "il metodo tripsina." Quest'ultimo metodo utilizza l'attività enzimatica di tripsina per promuovere la separazione di cellule e primaria escrescenza cellulare. Illustriamo metodologia step-by-step per immagini digitali e microscopia. Abbiamo anche provide gli esempi per convalidare le linee di cellule stromali endometriali mediante reazioni quantitative in tempo reale catena della polimerasi (qPCR) e di immunofluorescenza (IF).

Introduzione

Il corpus utero umano è costituito da tre strati, il perimetrium (o sierosa), miometrio, e l'endometrio. Distinguere ciascuno di questi livelli è un passo importante per stabilire linee di cellule endometriali. Il perimetrium è strato più esterno dell'utero e composto, cellule sierose sottili. Il miometrio è la spessa, strato intermedio dell'utero e composta da cellule muscolari lisce. L'endometrio è identificato come strato interno dell'utero e comprende popolazioni epiteliali e cellule stromali.

L'endometrio è ulteriormente suddivisa in strato basale il cui stelo popolazione cellulare è ipotizzato di ripopolare il livello functionalis circa ogni 28 giorni ^1. Lo strato functionalis dell'endometrio umano subisce significative variazioni biochimiche e morfologiche in risposta agli ormoni circolanti. Questi ormoni sono derivati ​​dalla ghiandola pituitaria e le ovaie.

Ilproduzione coordinata e il rilascio di ormoni risultati in un ciclo riproduttivo. Il ciclo riproduttivo è progettato per preparare l'endometrio per potenziali eventi impianto dell'embrione. Negli esseri umani, il ciclo riproduttivo è conosciuto come "il ciclo mestruale" e suddiviso in tre fasi - proliferativa, secretori, e mestruali. La fase proliferativa comporta la proliferazione del functionalis livello endometriale mentre la fase secretoria è segnato da functionalis maturazione. In particolare, alterazioni extracellulari, secrezioni e differenziazione cellulare segnalano un potenziale impianto. Se l'impianto non si verifica prima della fine della fase secretoria, lo strato functionalis endometriale è sparso durante la fase mestruale. L'importanza delle mestruazioni e gli eventi che attivano lo spargimento dello strato functionalis sono ancora in discussione. Negli esseri umani, è stato posto che le mestruazioni è il risultato di un evento specifico metà secretoria differenziazione fase conosciutacome "decidualizzazione spontanea" ^2. In questo manoscritto, forniamo metodologia dettagliata per entrambi i metodi di isolamento delle cellule stromali dell'endometrio, e usiamo una combinazione di immunofluorescenza e immagini digitali per dimostrare l'efficacia di questi approcci. Inoltre, si applica una comunemente usato modello in vitro di decidualizzazione spontaneo per confermare endometriale isolamento delle cellule stromali.

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Protocollo

I campioni isterectomia utilizzati in questo manoscritto sono stati raccolti in concordanza con un protocollo di etica dell'Università IRB approvato numerato IRB-HSR # 14424.

1. Acquisizione di esempio da Fonte clinica

1. Ottenere governo e orientamenti etici basata sulle istituzioni e la documentazione approvazione prima dell'inizio.
2. Eseguire tutti i passaggi condizioni sterili.
3. Preservare il tessuto derivato dal paziente nei media (RPMI o DMEM / Alto glucosio) in un tubo da 50 ml a 4 ° C, se il campione non può essere elaborata nella cultura immediatamente. I campioni possono essere conservati in questo stato per un massimo di 24 ore.
4. Lavare campione di tessuto tre volte con 1X sterile tampone fosfato (PBS) e scartare la soluzione tra i lavaggi.

2. Preparazione di linee cellulari primarie che utilizzano il metodo raschio

1. Aggiungere 4-10 ml di terreno di coltura (RPMI o DMEM / Alto glucosio supplementato con 10% siero fetale bovino e 1% penicillina-streptomycin) al tessuto e aggiungere Fungizone (0,25 mg / ml concentrazione finale) per 30 min.
2. Eliminare i mezzi di crescita.
3. Lavare il tessuto due volte con PBS 1X.
4. Collocare il tessuto su una piastra di coltura cellulare 6 centimetri di distinguere tra miometrio e strati di endometrio (vedi figure 2A-2C per una descrizione più dettagliata). Separare l'endometrio.
5. Usando un bisturi o un rasoio, transezione il tessuto in piccoli pezzi mentre graffi sul piatto di coltura cellulare 6 cm. Questi graffi facilitano il fissaggio delle cellule endometriali primarie emergenti. Rispetto al metodo tripsina, è necessaria più tessuto (vedi Figura 2D per approssimazione).
6. Delicatamente, aggiungere 2 ml di terreni di crescita per piatto graffiato (frammenti di tessuto saranno visibili e, idealmente, immobilizzato dal moto graffi).
7. Trasferire la piastra (s) per un incubatore di coltura cellulare designata (37 ° C e 5% CO _2). Designare un luogo per linee cellulari primarie, lontano da OTHer piatti di coltura di cellule. Colture primarie sono più sensibili all'infezione e contaminazione.
8. Esaminare le cellule al microscopio luce del giorno. Piccole popolazioni di cellule dovrebbero emergere dal giorno due o tre intorno ai tessuti fette (vedere Figura 3B).
9. Per mantenere le culture, lavare delicatamente con 1X PBS e aggiungere terreni di crescita fresco (2 ml) ogni tre giorni. Quando aumenta la velocità di proliferazione, terreni di crescita supplementare (3-4 ml) possono essere aggiunti alla piastra di coltura 6 cm (s).
   Nota: durante il lavaggio e dei media cambia, pezzi di tessuto saranno probabilmente aspirati. Questo non influenzerà la crescita di cellule aderenti. I pezzi di tessuto devono essere aspirati dal passo successivo (2.10) come nuove colonie difficilmente emergere dopo una settimana.
10. Quando la piastra 6 CM è circa il 75 - 80% confluenti (vedere Figura 3B), passaggio utilizzando 0,05% tripsina. Cellule primarie non possono essere diversi passaggi a tempo indeterminato - congelamento giù una piastra di cellule appena due o tre piatti sono maintained. Se sono necessari ulteriori passaggi, seguire un protocollo immortalization (rivisto nel Rif. ^​​3).

3. Preparazione di linee cellulari primarie che utilizzano il metodo tripsina

1. Mettere un piccolo pezzo di tessuto endometriale (vedere Figura 2D per una approssimazione) in 2 ml di 0,25% tripsina integrati con kanamicina (0,03 mg / ml concentrazione finale).
2. Incubare il tessuto a 37 ° C su piattaforma rotante per 30 min.
3. Brevemente vortice del tessuto.
4. Centrifugare il campione a 200-400 xg per 2 minuti e scartare il surnatante.
5. Aggiungi tripsina fresco e kanamicina.
6. Incubare il tessuto a 37 ° C durante la rotazione per un ora.
7. Agitare il tessuto per 5-10 sec.
8. Aggiungere 2 ml di terreni di crescita (supplementato con 10% siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina) per disattivare la tripsina.
9. Centrifugare le cellule a 200-400 xg per 2-3 min.
10. Eliminare il surnatante e aggiungere 2 ml di crescereth supporti alle cellule pellet.
11. Piatto su un piatto di coltura cellulare 6 centimetri. Raschiare la piastra come nella Fase 2.5 su Preparazione linee cellulari primarie utilizzando il metodo raschio non è necessaria, ma esalta l'attaccamento e la conseguenza di colture primarie.
12. Controllo cellule al microscopio luce giornaliera. Le cellule sono solitamente visibili al microscopio ottico dopo 24-48 ore (vedi Figura 3C).
13. Per mantenere le culture, monitorare le cellule e modificare i media ogni 2-3 giorni, come nel passo 2.9.
14. Per passare le cellule, usa 0,05% o 0,25% tripsina quando le cellule raggiungono il 75-80% di confluenza (vedi Figura 3C).

4. Risparmio tessuto extra per l'analisi (Snap Congelamento e Formalina Fixation)

1. Lavare campione due volte con PBS 1X.
2. Aspirare quanto più liquido possibile.
3. Per Snap congelamento, collocare campione di tessuto endometriale in una provetta 1,7 centrifuga (vedi figure 2F e 2G). Posizionare il 1.7provetta da centrifuga in azoto liquido per 10 secondi o finché si può notare che il tessuto è congelato giù.
   Nota: Fare attenzione a non toccare direttamente l'azoto liquido durante la preparazione dei campioni. I campioni possono essere conservati a -80 ° C fino ad ulteriore trattamento o l'analisi.
4. Per la fissazione in formalina, tagliare un piccolo pezzo di tessuto endometriale (vedere Figura 2H), e immergere nel 10% formalina tamponata zinco. Dopo 24 ore, scartare in formalina e aggiungere il 70% di etanolo per i campioni di tessuto fino ad ulteriore trasformazione.

5. Immunofluorescenza (IF)

1. Fissazione delle cellule
   1. Preparare le cellule su un vetrino cultura o piastra.
   2. Delicatamente, lavare le cellule con PBS 1X.
   3. Aggiungere pre-raffreddata (4 ° C) metanolo e acetone (miscelati in un rapporto 1:1) per 5 min.
   4. Asciugare il vetrino prima di procedere. Diapositiva può essere conservato a 4 ° C per 1-2 settimane se necessario.
2. Elaborazione IF
   1. Reidratare le cellule con PBS 1X per 10 min. Per il following passaggi 1-6, condurre tutti lavaggi e incubazione su una piattaforma rotante.
   2. Blocco con 1X PBS supplementato con 1% di sieroalbumina bovina (BSA) e 1% specie siero specifico (fonte di anticorpo 2 ^°) per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Incubare in anticorpo primario (vedi produttori raccomandazioni per la diluizione di anticorpi). Vedi Materiali per anticorpi specifici. Diluire l'anticorpo primario in tampone di bloccaggio fresco come al punto 5.2.2. Questo incubazione può essere condotta per almeno 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
   4. Lavare 3 volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
   5. Incubare in anticorpo secondario (vedi produttori raccomandazioni per la diluizione di anticorpi). Diluire l'anticorpo secondario in tampone di bloccaggio fresco come al punto 5.2.2. Per evitare fotometabolismo, è importante condurre questo e gradini successivi in ​​assenza di luce.
   6. Lavare 3 volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
   7. Thoroughly asciugare le diapositive.
   8. Aggiungi mezzi di montaggio e la soluzione di contrasto DAPI.
   9. Applicare coprioggetto e sigillare i bordi con sigillante (s). I vetrini possono essere conservati a 4 ° C al buio per un massimo di due settimane.

6. RNA Estrazione

1. Pellet 1 x 10 ⁷ cellule per centrifugazione. Tutti i materiali e reagenti di questo protocollo devono essere RNasi libero.
2. Lisare le cellule in 1 ml di reagente TRIZOL, e incubare i campioni omogeneizzati per 10 min a temperatura ambiente per completare dissociazione dei complessi nucleoproteici.
3. Aggiungere 200 ml di cloroformio per 1 ml di TRIZOL. Agitare vigorosamente a mano per 15 secondi e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente.
4. Centrifugare alla massima velocità (15.000 xg) per 15 min a 4 ° C. Tre strati comporteranno.
5. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Aggiungere 1 ml di glicogeno per aumentare la resa di RNA; tuttavia, questa fase è necessaria solo quando un piccoloquantità di RNA è anticipato.
6. Aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico per lo strato acquoso, e invertire i campioni 3-5 volte. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Per aumentare la resa, i campioni possono essere collocati in -20 ° C o -80 ° C per 30 min.
7. Centrifugare alla massima velocità per 10 min a 4 ° C.
8. A questo punto, un piccolo pellet di RNA deve essere visibile. Scartare il surnatante.
9. Lavare l'RNA di 1 ml di etanolo al 75%.
10. Centrifugare alla massima velocità per 5 minuti e scartare il surnatante. I campioni possono essere lavati più per liberarsi contaminanti inorganici volta, ma questo passaggio non è necessario.
11. In breve, asciugare il pellet di RNA fino RNA pellet è asciutto (solitamente richiede 7-10 min).
    Nota: Un passo aggiuntivo può essere utilizzato per diminuire materia inorganica e diminuire il tempo di asciugatura. Dopo aver scartato il supernatante dal etanolo di lavaggio, campioni centrifuga alla massima velocità per un altro minuto e aspirare liquido residuo. Fare attenzione a non aspirare il pellet.
12. Sciogliere RNA in acqua priva di RNasi, a seconda delle dimensioni del pellet di RNA. Volumi in genere varia 10-50 ml.
13. Incubare i campioni a 55 ° C per 10 min, e misurare la concentrazione di RNA.
14. Conservare i campioni a -20 ° C fino ad ulteriore trasformazione.

7. Trascrizione inversa

1. Portare il campione di RNA (1-3 mg) ad un volume di 9 ml con H ₂ O.
2. RNA calore a 70 ° C per 10 min.
3. Per generare un master mix AMV, combinare i seguenti reagenti: 5 ml di dNTP (concentrazione di lavoro di 50 pm), 5 microlitri di oligo DNA N6 (concentrazione di lavoro di 80 micron), 5 ml di tampone 5X AMV e 1 ml di AMV . Questa soluzione master mix è progettata per un campione.
4. Aggiungere 16 microlitri della miscela master al RNA riscaldata. Il volume di reazione finale sarà di 25 microlitri di reazione.
5. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR per la trascrizione inversa: (fase 1) 42 ° C per 90 min, (STAge 2) 95 ° C per 5 min, e (Fase 3) 4 ° C fino ad ulteriore lavorazione.

8. Real Time PCR

1. Condurre reazioni di PCR utilizzando i primer, temperature di ricottura, numero di cicli e reagenti elencati nella tabella 1.
   Nota: E 'ideale per seguire le istruzioni del produttore quando si utilizzano reagenti PCR (fare riferimento alla società e catalogo numeri in Materials).

9. In vitro decidualizzazione Protocol (Derivato da Rif. ^​​4 e ⁵⁾

1. Piatto cellule endometriali.
2. Crescere ad una confluenza del 75-85%.
3. Dopo cellule diventano confluenti, lavare una volta con PBS 1X.
4. Rapidamente, aggiungere contenuti multimediali senza ormoni (fenolo libero RPMI supplementato con 5% di carbone striscia di FBS e 1% di penicillina-streptomicina).
5. Dopo 24 ore, aggiungere media ormone libero, completata con medrossiprogesterone acetato (MPA) ad una concentrazione finale di 1 mM e 8-bromoadenosine 3 ', 5'-Monofosfato ciclico (cAMP) ad una concentrazione finale di 0,5 mM.
6. Dopo almeno 48 ore, bloccare la reazione e salvare la piastra (s) per un'ulteriore elaborazione.

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Risultati

Come sottolineato nella sezione Protocollo, assicurarsi di effettuare tutti i metodi sotto il governo, istituzionali e orientamenti etici durante la manipolazione e preparazione di tessuti umani.

Inclusi in questo manoscritto è un esempio del flusso di lavoro generale di "metodo scraping" (Figura 1A) e "il metodo tripsina" (Figura 1B) utilizzato per stabilire colture primarie endometriali. Questi metodi sono descritti in...

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Discussione

Altri gruppi hanno descritto e adattato metodologia per la preparazione di colture stromali endometriali, molti dei quali utilizzano collagenasi ^{4,12,13,15-18.} In questo manoscritto, abbiamo fornito metodologia e prove per due metodi di coltura stromale semplificate primarie endometriali, entrambi i quali sono utilizzati dal nostro laboratorio per motivi economici e conveniente disponibilità di tripsina e / o una lama di rasoio.

Quando si confrontano i nostri due metodi, entrambi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin	Hyclone	SH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube	Genesee Scientific	22-272A
1 µl, 20 µl, 200 ml and 1,000 µl Pipette	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml Conical Tube	Hyclone	339650
50 ml Conical Tube	Hyclone	339652
6 cm Cell Culture Dish	Thermo scientific	12-556-002
8 well Chambers	Thermo Scientific	AB-4162
Acetate	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzyme/Buffer	Bio Labs	M077L
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Buffered Zinc Formalin	Thermo	59201ZF
Charcoal strip FBS	Fisher	NC9019735
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Cover slip	Fisher Brand	12-544D
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/High Glucose	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Donkey Anti Goat -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Donkey Serum	Jackson’s lab	017-000-002
E Cadherin Antibody	Epitomics	1702-1
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Fungizone Amphotericin B	Gibco	15290-018
GAPDH Probe	Life Technologies	HS99999905
Glycogen	5Prime	2301440
Goat Anti Mouse - FITC	Jackson’s Lab	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Medroxyprogesterone acetate (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Methanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
Mounting Media (w/DAPI)	Vector Labratories	H-1500
N6 DNA Oligos	Invitrogen
Number 15 Scraper	BD	371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB	Cell Signaling	4545
PBS (phosphate buffered saline)	Fisher Scientific	BP-399-4
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Goat Anti body	Santa Cruz	SC-9862
Primer(s)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (Phenol free)	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Vimentin Antibody	Epitomics	4211-1