En Vitro agregación ensayos usando hiperfosforilada proteína tau

Resumen

Proteínas tau no modificados y hiperfosforiladas fueron utilizados en dos ensayos de agregación in vitro para revelar la cinética de agregación rápida hiperfosforilación-dependiente. Estos ensayos allanar el camino para futuras pantallas para los compuestos que pueden modular la propensión de tau hiperfosforilada para formar fibrillas que subyacen a la progresión de la enfermedad de Alzheimer.

Resumen

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una de una gran colección de los trastornos neurodegenerativos conocidos como tauopatías. El tauopatía patología subyacente por excelencia es los ovillos neurofibrilares, NFT, en las neuronas, astrocitos y microglia ^1-4. La densidad NFT correlaciona con deterioro cognitivo ^3,5 y pérdida de neuronas ^6. NFT contiene proteína tau hiperfosforilada principalmente (referido como "p-tau" de ahora en adelante) que forma filamentos helicoidales apareados o rectas (PHF) ^7,8. Tau es una proteína asociada a microtúbulos pensado para facilitar el transporte axonal que es esencial para la señalización neuronal y el tráfico de ^9,10. Cada molécula de tau contiene de 2 a 3 fosfatos en el cerebro normal, pero el contenido de fosforilo aumenta en varios pliegues en pacientes tauopatía ^11. Múltiples quinasas pueden contribuir a la hiperfosforilación de tau incluyendo GSK3 (glucógeno sintasa quinasa 3β) y CDK5 (ciclina-dequinasa pendiente 5) ^12,13, pero el gatillo directo para la fosforilación patológica sigue siendo difícil de alcanzar ^14. Fosforilación anormal en o cerca de los motivos de unión a microtúbulos tau se disocia de los microtúbulos ^15, y causa tau mala localización al compartimiento somatodendrítico, donde p-tau oligomeriza en filamentos helicoidales rectos o pareadas que eventualmente pueden polimerizarse en inclusiones NFT. La estrecha relación entre la hiperfosforilación de tau, la formación de NFT, y la neurodegeneración condujo a una hipótesis prevalente que ovillos p-tau provocan respuestas citotóxicas apoptóticas y otros, y por lo tanto es la causa subyacente de tauopatía neurodegeneración ^16,17. Las pruebas toxicológicas y ensayos clínicos preliminares en base a esta premisa se ​​han puesto en marcha ^18. Sin embargo, esta hipótesis se enfrenta a retos ^19,20. Por ejemplo, SantaCruz et al. Mostró que las funciones cognitivas de los ratones transgénicos se pueden mejorar mediante la supresión de la expresión de un mutantetau humana, aunque NFTs continuaron para formar a partir de moléculas de tau existentes ^21. En un modelo de Drosophila, NFT se demostró para secuestrar la tau citosólica tóxico para proteger las células neuronales subyacentes ^22,23. Claramente, el papel patogénesis de NFT, en su caso, será de gran impacto la dirección del desarrollo de la terapéutica tauopatía.

En concentraciones altas, la proteína tau recombinante cerebro o normal espontáneamente pero poco a poco se polimeriza en una estructura de PHF como in vitro, como se indica por la unión de varios colorantes β-hoja preferidos fluorescentes, microscopía electrónica, y la espectroscopia de dispersión de luz ^24-27. La adición de heparina o ácido araquidónico, un ácido graso abundante en el cerebro humano, se acelera drásticamente la formación de PHF tau en isoform- e inductor dependientes de la concentración modales ^28-32. Curiosamente, tau hiperfosforilada purificó a partir de cerebros con EA o preparado por exhaustiva en las reacciones de fosforilación in vitro unaggregates más rápido y más eficientemente ^26,33-35. Estos resultados están en excelente acuerdo con las funciones patológicas de p-tau. Un sistema in vitro basado en la agregación de p-tau puede así servir como una poderosa herramienta para la detección de drogas AD.

Dada la estrecha asociación entre la agregación de tau y la neurodegeneración progresiva de AD, así como el reciente fracaso en el desarrollo de fármacos dirigidos la placa Aß, otro marcador histológico clave de AD ^36-38, el interés en el descubrimiento de fármacos que controlan la agregación de tau está en aumento. De hecho, varios grupos han comenzado ya las pantallas de drogas en diferentes rendimiento, utilizando en las reacciones de agregación de tau in vitro como el ensayo principal. Se encontró un número de productos químicos que presentan actividades inhibidoras o de reversión sobre la agregación de tau in vitro ^39-42. Sin embargo, todas las pantallas actuales reguladores de agregación de tau tau usan sin modificar que pierde la marca patológica clave de fósforoilación, elevando la preocupación por la especificidad y la eficacia del uso de estos compuestos en el tratamiento de la EA.

Uno de los principales obstáculos para desarrollar ensayos de agregación para la caracterización bioquímica y la detección de drogas AD es la producción de cantidades suficientes de la proteína tau hiperfosforilada patofisiológicamente relevante. Utilizando el sistema de Catálisis Cremalleras asistida en la que la isoforma 1N4R de tau y la quinasa GSK-3β se coexpresarse en E. coli como proteínas de fusión de cremallera de leucina, hemos superado este desafío (. Sui et al, presentado; véase la Figura 1 para los productos finales de tau y P-tau; ver también ⁴³ para la caracterización preliminar de espectrometría de masas de p-tau). Desde un panel de nueve anticuerpos específicos para diferentes sitios de fosforilación de tau, las señales positivas se observaron en ocho posiciones (datos no mostrados). A continuación, se describen los protocolos y las instrumentaciones que pueden diferenciar la agregación d cinéticaiferencias entre tau no modificado y especies de p-tau. Estos ensayos se modificaron a partir de los protocolos publicados que midieron el aumento de la fluorescencia de tioflavina T (ThT) o tioflavina S (THS) sobre amiloide (agregados de tau) de unión ^26. En el primero "terminal", enfoque sin tinte, reacciones de agregación se ensamblan y se incubaron en ausencia del colorante amiloide. En diferentes puntos de tiempo, se retira una alícuota de cada reacción y se mezcló con un volumen igual del tampón THT-que contiene para detener y permitir la agregación de ThT de obligar a los agregados de tau. La fluorescencia se midió mediante un FluoroMax-2 fluorómetro IAP. En la segunda "con tinte" ensayo de monitoreo continuo, ThT o de ThS está incluido en las reacciones de agregación. La fluorescencia se puede medir de forma continua durante todo el experimento de forma manual o usando un lector de placas múltiples. Además, se describe un ensayo que utiliza una concentración casi fisiológica de tau-tau y p para la agregación en el mo medición continuade. El efecto de la fosforilación sigue siendo fácilmente detectable. A continuación, vamos a describir los procedimientos de operación paso a paso, y mostrar resultados representativos de estos ensayos. La discusión de algunos de los pros y los contras de cada enfoque, así como las aplicaciones de detección de drogas potenciales seguirán.

En una alta concentración, tau agregados en las estructuras de tipo amiloide espontáneamente. Sin embargo, en el laboratorio, fibrillization tau es típicamente acelerado por inductores tales como la heparina (peso molecular medio, 6.000 g / mol) y ácido araquidónico. Ejemplos mostrados en el presente documento incluyen 30 mM de heparina. La formación de agregados amiloides tau se controla por la fluorescencia resultante de la unión por tioflavina T (ThT) o tioflavina S (THS) amiloide. Tras la unión de los agregados de tau, ThT presenta un desplazamiento hacia el rojo de la fluorescencia (excitación: 450 nm; pico de emisión: 485 nm). Ths, por otro lado, tiene débil emisión a 510 nm (excitación a 450 nm) antes de la unión de amiloide, pero esta fluorescencE aumenta significativamente en presencia de una proteína amiloide tales como la tau agregada ^44. Ambos colorantes funcionan bien en la detección de tau y P-tau agregación. Debido a la fuerte pico y relativamente amplia emisión de ThT (véase la Figura 2), sólo hay 30% de reducción en la unidad de fluorescencia a 510 nm. Por conveniencia, se utiliza la misma combinación de longitudes de onda de excitación / emisión (es decir, 450 nm / 510 nm) para controlar la agregación de tau cuando se utiliza colorante.

La agregación de tau se puede realizar en presencia o ausencia del colorante, dependiendo del propósito del ensayo y la disponibilidad de la proteína tau. Ambos modos de reacciones se muestran a continuación. Además, se demuestra el funcionamiento de dos instrumentos diferentes - un fluorómetro de una sola muestra (ISA-SPEX FluoroMax-2) y un multi-lector de placa (SpectraMax M2). Los lectores deben ser capaces de adaptar estos protocolos para satisfacer sus necesidades específicas y la disponibilidad de instrumentos.

Protocolo

1. Preparación de los reactivos

1. Preparar tampón de agregación (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Guarde a temperatura ambiente, estable durante meses. Suplemento ditiotreitol 1 mM (DTT) antes de su uso.
   NOTA: un búfer basado en HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) también produce resultados similares en la agregación de tau.
2. Preparar tioflavina T o tioflavina S solución madre (3 mM, disuelto en tampón agregación), y filtrar por 0,22 micras unidad de filtro estéril. Almacenar a -20 ° C en un tubo cubierto con papel de aluminio, estables durante meses.
3. Prepare la solución de heparina de valores (300 mM, disueltos en tampón de agregación). Almacenar a -20 ° C, estable durante meses.
4. Preparar ditiotreitol (DTT) stock (1 M, se disuelve en agua). Alícuota en tubos de 1,5 ml. Almacenar a -20 ° C. Antes de ensayos de agregación, descongelar la solución 1 M a temperatura ambiente. A partir de este 1,000x madre, preparar una alícuota de 100 mM de solución madre de trabajo con agua destilada. Deja en el hielohasta que esté listo.
5. Eliminar tau de -80 ° C congelador. Descongele en hielo. Ajuste tau a la concentración predeterminada con el tampón de agregación. Centrifugado en una microcentrífuga a 20.800 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar grandes agregados pre-formadas. Esta etapa de pre-hilado aumenta la coherencia en la medición de fluorescencia posterior de cada lote de la preparación de proteína. Transferir el sobrenadante a otro tubo; dejar en hielo hasta que esté listo para montar la reacción de agregación.

2. No-dye, Ensayo Terminal

NOTA: La reacción de agregación de este ensayo se realiza en ausencia del colorante fluorescente. Después de mezclar todos los componentes, la reacción se deja proceder a puntos de tiempo predeterminados. Las alícuotas son llevados a cabo de la reacción de agregación y mezclado con ThT o de ThS para la unión antes de la lectura de fluorescencia amiloide. El volumen inicial de la reacción de agregación depende del número de puntos de tiempo necesarios. Este enfoque puede REQUire una gran cantidad de la proteína tau, pero es rápido, sencillo, y se puede hacer en un fluorómetro o un lector de placas de múltiples pocillos (ver Discusión). A continuación se muestra la operación paso a paso, usando el ISA SPEX FluoroMax-2 espectrofluorómetro compacto para la cuantificación de la fluorescencia.

1. Establecer la mezcla de agregación en 1,5 ml tubos Eppendorf como en la Tabla 1. Cada columna representa los ingredientes necesarios para una reacción de 100 l, que es suficiente para una medición de punto de tiempo. Ajuste la cantidad para toda la mezcla de agregación basado en los puntos de tiempo necesarios para el experimento en particular. Añadir 10% adicional de cada componente para dar margen para el error pipetear. La heparina de reacción que contiene típica se muestra aquí puede ser reemplazado por ácido araquidónico o tampón agregación. Añadir DTT a 1 mM a la mezcla de reacción. Si toda la reacción dura más de un día, complementar fresco TDT cotidiana (1 mM) para asegurar un ambiente reductor.
2. Invierta el tubo varias veces para mezclar. Place cada reacción en una incubadora o baño de agua 37 ° C. La agitación no es necesario para la agregación de tau.
3. Antes de medir la fluorescencia, encienda el espectrofluorómetro (lámpara primero, y luego la computadora).
   NOTA: La lámpara de arco de xenón que se puede utilizar de inmediato. Sin embargo, para obtener mejores resultados permiten que la máquina se caliente durante unos 10 minutos antes de la lectura de fluorescencia.
4. Inicie el software en el ordenador.
   1. Seleccione el modo de visualización en tiempo real en el Centro de Control de Instrumentos, ajuste la longitud de onda de excitación de 450 nm (hendidura a 2 nm) y la longitud de onda de emisión a 510 nm (hendidura a 5 nm). Cerrar la ventana Modo de visualización en tiempo real para volver al Centro de Control de Instrumentos.
   2. Elija clave Constant Análisis de longitud de onda, pulse Agregar >> en el marco superior para agregar longitudes de onda conjuntos. Establecer los parámetros de adquisición de error estándar a 1 y Ensayos máximo a 3, a continuación, haga clic en Agregar. Haga clic en Ir para abrir la pantalla de datosventana.
   3. En la ventana de visualización de datos, haga clic en Inicio Acq para abrir el cuadro de diálogo Muestra Nuevo. Elija "desconocido" para el tipo de muestra.
5. Para cada mezcla de agregación 100 l, añadir 98 l de tampón agregación y 2 l 3 mM tioflavina T. Pipet varias veces para mezclar.
6. Transferir la totalidad de la mezcla a una cubeta (FCA3, la dimensión exterior, WxLxH = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Colocar la cubeta en el soporte de muestra en la muestra-compartimento y cerrar la tapa. Haga clic en Ejecutar para recoger los datos de fluorescencia. Grabe los datos.
7. Retire la cubeta y decantar la solución. Enjuague la cubeta de agua destilada 3 veces. Seco soplando aire dentro y fuera de la cubeta.

3. Con-dye, continua Ensayo modo en un lector de placas SpectraMax M2

NOTA: Este ensayo difiere de la anterior en que el colorante fluorescente ThT o de ThS está incluido en el, la agregaciónreacción ción. Esto permite la medición continua de la misma serie de reacciones. Debido al uso repetitivo de la reacción, este método se realiza mejor con un lector de placas de múltiples pocillos automático (como se muestra a continuación el funcionamiento de SpectraMax M2). Un fluorómetro regular también funciona, pero la frecuencia de la medición de las reacciones de agregación rápidos es algo limitada, debido a la naturaleza manual de la operación.

1. Establecer la mezcla de agregación en una placa de 96 pocillos (placa de 96 pocillos de color negro sólido, bien volumen 360 l, de fondo plano) como en la Tabla 2. Cada columna representa los ingredientes necesarios para una reacción de 200 l, que es suficiente para una la medición del tiempo de punto. Mezclar bien pipeteando varias veces. Suplemento fresco DTT 1 mM cada día durante todo el curso de los experimentos.
2. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 ° C.
3. En cada punto de tiempo antes de la medición de la fluorescencia, encienda el lector de microplacas multimodo y el ordenador. Deje tiempo suficiente para que el mamáquina para estabilizar, a unos 10 min.
4. Inicie el software en el ordenador. Ajuste la temperatura a 37 ° C y elegir la intensidad de fluorescencia de modo (FI-Top Leer), ajuste la longitud de onda de excitación a 450 nm y emisión a 510 nm de longitud de onda.
5. Inserte la placa de 96 pocillos en el cajón y pulse la tecla READ para iniciar la medición.
6. Después de leer, eliminar la placa y volver de nuevo a los 37 ° C incubadora. Copie los datos y pegar en una hoja de cálculo Excel para análisis de datos y el trazado.

4. Con-dye, continua el modo de ensayo en una Spectrofluorometer compacto

1. Establecer la mezcla de agregación en 1,5 ml tubos Eppendorf como en la Tabla 3. Cada columna representa los ingredientes necesarios para una reacción de 200 l, que es suficiente para una medición de punto de tiempo.
2. Invierta el tubo varias veces para mezclar.
3. Encienda el espectrofluorómetro y configurar el software como en los pasos 2.3 y 2.4.
4. Transfiera la mezcla entera tcubeta OA. Colocar la cubeta en el soporte de muestra en la muestra-compartimento y cerrar la tapa. Haga clic en Ejecutar para recoger los datos de fluorescencia. Grabe los datos.
5. Continuar leyendo a intervalos apropiados haciendo clic en Ejecutar y registrar los datos. Si la agregación es ser controlados en una alta frecuencia (por ejemplo, cada 30 o 60 seg), dejar la reacción en la cubeta y en la máquina hasta que la medición ha terminado, o cuando hay tiempo suficiente para intercambiar reacciones o cubetas.
6. Retire la cubeta y decantar la solución. Enjuague la cubeta de agua destilada 3 veces. Seco soplando aire dentro y fuera de la cubeta.

Resultados

Uso de tau recombinante y p-tau (Figura 1), se establecieron dos protocolos diferentes para comparar la cinética de la agregación de tau y p-tau, aprovechando la fuerte emisión de fluorescencia de ThT y de ThS tras la unión a amiloide agregados de proteínas, incluyendo tau y p-tau (Figura 2). Con o sin el colorante fluorescente en la reacción de agregación, se observó mejora consistente de la agregación de tau por la hiperfosforilación (Figuras 3-5). Esta esti...

Discusión

Este protocolo demuestra diferentes condiciones de ensayo y los instrumentos que detectan las tau rápida cinética de agregación dependientes de la fosforilación. En el ensayo de terminal, se añade el colorante de fluorescencia ThT a una porción de la reacción retirado de la mezcla maestra en cada punto de tiempo. Amiloide inducida por la unión de fluorescencia se mide entonces ^26. En el segundo, con tinte modo, la agregación de tau se lleva a cabo en presencia de ThT o de ThS, lo que hace este tipo d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C