In Vitro aggregazione Assays Utilizzando iperfosforilata Tau Protein

Riepilogo

Proteine ​​tau non modificate e iperfosforilata sono stati utilizzati in due metodiche di aggregazione in vitro per rivelare la cinetica di aggregazione veloce iperfosforilazione-dipendente. Questi test aprono la strada per schermi future per i composti che possono modulare la propensione di tau iperfosforilata a formare fibrille che sono alla base della progressione della malattia di Alzheimer.

Abstract

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduzione

La malattia di Alzheimer (AD) è uno di una grande collezione di malattie neurodegenerative noti come taupatie. Il taupatia patologia sottostante per eccellenza sono i grovigli neurofibrillari, NFTs, in neuroni, astrociti e microglia ^1-4. La densità NFT correlato con deterioramento cognitivo ^3,5 e neurone perdita ^6. NFT contiene proteine ​​tau principalmente iperfosforilata (denominato "p-tau" d'ora in poi) che forma filamenti elicoidali diritte o appaiati (PHF) ^7,8. Tau è una proteina associata ai microtubuli che facilita il trasporto assonale che è essenziale per la segnalazione neuronale e il traffico di ^9,10. Ogni molecola tau contiene 2-3 fosfati nel cervello normale, ma il contenuto fosforil aumenta di diverse pieghe in pazienti taupatia ^11. Più chinasi sono suscettibili di contribuire al tau iperfosforilazione compreso GSK3β (glicogeno sintasi chinasi 3β) e CDK5 (ciclina-dechinasi pendent 5) ^12,13, ma il grilletto diretto per la fosforilazione patologico rimane sfuggente ^14. Fosforilazione anormale nella zona di motivi microtubuli vincolante dissocia tau dal microtubuli ^15, e causa tau mis-localizzazione al comparto Somatodendritic, dove p-tau oligomerizes in filamenti elicoidali diritti o coppie che può eventualmente polimerizzare in inclusioni NFT. Il legame stretto tra tau iperfosforilazione, formazione NFT, e neurodegenerazione ha portato ad una ipotesi prevalente che grovigli p-tau inducono risposte citotossiche apoptotici e altri, e, quindi, è la causa di fondo per taupatia neurodegenerazione ^16,17. Schermi di droga e primi test clinici basati su questo presupposto sono stati lanciati ^18. Tuttavia, questa ipotesi deve affrontare sfide ^19,20. Ad esempio, SantaCruz et al. Hanno mostrato che le funzioni cognitive di topi transgenici possono essere migliorate sopprimendo l'espressione di un mutantetau umana, anche se NFTs continuato a formare da molecole di tau esistenti ^21. In un modello di Drosophila, NFT ha dimostrato di sequestrare il citosolico tau tossico per proteggere le cellule neuronali sottostanti ^22,23. Chiaramente, il ruolo patogenesi di NFT, se presente, urterà notevolmente la direzione di sviluppo terapie taupatia.

In alte concentrazioni, proteina tau cervello ricombinante o normale spontaneamente ma lentamente polimerizza in una struttura PHF-come in vitro, come indicato dal legame dei diversi coloranti β-sheet preferiti fluorescenti, microscopia elettronica, e la luce spettroscopia di scattering ^24-27. L'aggiunta di eparina o acido arachidonico, un acido grasso abbondante nel cervello umano, accelera drasticamente la formazione di PHF tau in isoform- e modi di concentrazione-dipendente induttore ^28-32. Curiosamente, tau iperfosforilata purificato da cervelli AD o preparato esaustivo in reazioni di fosforilazione in vitro unggregates più veloce ed efficiente ^26,33-35. Questi risultati sono in eccellente accordo con i ruoli patologiche di p-tau. Un sistema in vitro basato sull'aggregazione di p-tau può quindi servire come un potente strumento per lo screening di stupefacenti AD.

Data la stretta associazione tra l'aggregazione di tau e la neurodegenerazione progressiva di AD, così come il recente fallimento nello sviluppo di farmaci mira la targa Ap, un altro tasto marcatore istologica di AD ^36-38, l'interesse per la scoperta di farmaci che controllano l'aggregazione di tau è in aumento. Infatti, diversi gruppi hanno già iniziato schermi di droga a velocità differenti, utilizzando in vitro le reazioni di aggregazione tau, come il test primario. Sono stati trovati una serie di sostanze chimiche per esporre le attività inibitoria o di inversione di aggregazione tau in vitro ^39-42. Tuttavia, tutti gli schermi attuali regolatore di aggregazione tau usano tau non modificato che manca il bersaglio patologico chiave di fosforoylation, sollevando una preoccupazione per la specificità e l'efficacia di utilizzo di questi composti in trattamento dC.

Uno dei principali ostacoli di sviluppare metodiche di aggregazione per la caratterizzazione biochimica e screening di farmaci AD è la produzione di quantità sufficienti di fisiopatologicamente relativa proteina tau iperfosforilata. Utilizzando il sistema di catalisi Zippers-assistita in cui l'isoforma 1N4R del tau e la chinasi GSK-3β sono co-espressi in E. coli come proteine ​​di fusione leucina cerniera, abbiamo superato questa sfida (. Sui et al, ha presentato, vedere la Figura 1 per i prodotti finali di tau e P-tau, anche vedere ⁴³ di pronuncia caratterizzazione spettrometria di massa di p-tau). Da un gruppo di nove anticorpi specifici per i diversi siti di fosforilazione di tau, segnali positivi sono stati osservati in otto posizioni (dati non riportati). Qui di seguito, descriviamo protocolli e strumentazioni in grado di differenziare l'aggregazione d cineticaifferences tra tau non modificato e specie p-tau. Questi test sono stati modificati da protocolli pubblicati che misuravano l'aumento della fluorescenza del tioflavina T (ThT) o thioflavin S (ThS) su amiloide (aggregati tau) vincolante ^26. Nel primo "terminale", approccio senza colorante, reazioni aggregazione sono assemblati e incubate in assenza del colorante amiloide. A tempi diversi, un'aliquota di ogni reazione viene rimosso e mescolato con un volume uguale di tampone contenente ThT fermare aggregazione e consentire di impegnare ThT aggregati tau. La fluorescenza è misurata da un IAP FluoroMax-2 fluorimetro. Nel secondo "con-dye" continuo monitoraggio del dosaggio, ThT o ThS è incluso nelle reazioni di aggregazione. Fluorescenza può essere misurato continuamente durante l'intero esperimento manualmente oppure utilizzando un lettore multi-piastra. Inoltre, descriviamo un metodo che utilizza una concentrazione quasi fisiologica di tau e P-tau per l'aggregazione nel mo misura continuade. L'effetto di fosforilazione rimane facilmente rilevabile. Qui di seguito, descriveremo step-by-step procedure operative, e mostrano risultati rappresentativi di questi test. Discussione di alcuni dei pro e contro di ogni approccio, così come le potenziali applicazioni di screening di stupefacenti seguiranno.

Ad una concentrazione elevata, tau aggregati in strutture amiloidi simili spontaneamente. Tuttavia, in laboratorio, tau fibrillization è tipicamente accelerato da tali induttori come eparina (peso molecolare medio, 6.000 g / mol) e acido arachidonico. Gli esempi riportati qui sono 30 micron eparina. La formazione di tau aggregati amiloidi è monitorata dalla fluorescenza risultante di legarsi da tioflavina T (ThT) o thioflavin S (ThS) amiloide. Al legame aggregati tau, ThT presenta uno spostamento rosso della fluorescenza (eccitazione: 450 nm; picco di emissione: 485 nm). ThS, d'altra parte, ha debole emissione a 510 nm (eccitazione a 450 nm) prima dell'associazione amiloide, ma questo fluorescence aumenta significativamente in presenza di una proteina amiloide come la tau aggregato ^44. Entrambi i coloranti funzionano bene nel rilevare tau e P-tau aggregazione. A causa del picco forte e relativamente ampio emissione di ThT (vedi Figura 2), vi è solo il 30% di riduzione in unità di fluorescenza a 510 nm. Per comodità, usiamo la stessa combinazione di lunghezze d'onda di eccitazione / emissione (ad esempio, 450 nm / 510 nm) per monitorare l'aggregazione di tau quando si utilizza dye.

Tau aggregazione può essere effettuata in presenza o assenza del colorante, a seconda dello scopo del dosaggio e la disponibilità di proteina tau. Entrambe le modalità di reazione sono riportati di seguito. Inoltre, abbiamo dimostrato il funzionamento di due strumenti diversi - un fluorimetro singolo campione (ISA-SPEX FluoroMax-2) e un lettore multidisco (SpectraMax M2). I lettori dovrebbero essere in grado di adattarsi questi protocolli per soddisfare le loro esigenze specifiche e la disponibilità dello strumento.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare buffer di aggregazione (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Conservare a temperatura ambiente, stabile per mesi. Supplemento 1 ditiotreitolo mm (DTT) prima dell'uso.
   NOTA: tampone-HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) produce anche risultati simili in aggregazione tau.
2. Preparare tioflavina T o thioflavin soluzione S stock (3 mm, disciolto in tampone aggregazione), e il filtro da 0,22 micron unità filtro sterile. Conservare a -20 ° C in un tubo rivestito da un foglio di alluminio, stabile per mesi.
3. Preparare eparina soluzione madre (300 micron, disciolti in tampone di aggregazione). Conservare a -20 ° C, stabile per mesi.
4. Preparare ditiotreitolo (DTT) stock (1 M, sciolto in acqua). Aliquota in provette da 1,5 ml. Conservare a -20 ° C. Prima di metodiche di aggregazione, scongelare la soluzione 1 M a RT. Da questo 1,000x magazzino, preparare una aliquota di 100 mm magazzino lavorano con acqua deionizzata. Lascia sul ghiacciofino al momento.
5. Rimuovere tau da -80 ° C freezer. Scongelare su ghiaccio. Regolare tau a concentrazione prefissata con il tampone di aggregazione. Spin in una microcentrifuga a 20.800 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere grandi aggregati preformati. Questa fase di pre-filatura aumenta coerenza nella successiva misura della fluorescenza di ciascun lotto della preparazione proteine. Trasferire il surnatante in un'altra provetta; lasciare in ghiaccio fino al momento di montare la reazione di aggregazione.

2. No-dye, Assay Terminal

NOTA: La reazione aggregazione di questa analisi viene effettuata in assenza del colorante fluorescente. Dopo la miscelazione di tutti i componenti, la reazione viene lasciata procedere a predeterminati intervalli di tempo. Aliquote vengono poi portati fuori della reazione aggregazione e mescolati con ThT o ThS per vincolante prima della lettura della fluorescenza amiloide. Il volume iniziale della reazione aggregazione dipende dal numero di punti temporali necessari. Questo approccio può require una grande quantità di proteina tau, ma è veloce, semplice, e può essere fatto in un fluorimetro o un lettore di piastre a più pozzetti (vedi Discussione). Di seguito è riportato il funzionamento passo-passo, con l'ISA SPEX FluoroMax-2 spettrofluorimetro compatto per la fluorescenza quantificazione.

1. Impostare la miscela aggregazione in 1,5 ml provette Eppendorf come in Tabella 1. Ciascuna colonna rappresenta gli ingredienti necessari per una reazione di 100 microlitri, che è sufficiente per una misurazione time-point. Regolare la quantità per l'intera miscela aggregazione in base ai punti di tempo necessari per la particolare esperimento. Aggiungere ulteriore 10% di ciascun componente per dare spazio a pipettaggio errore. La tipica reazione contenente eparina qui illustrato può essere sostituito da acido arachidonico o buffer di aggregazione. Aggiungere DTT 1 mM alla miscela di reazione. Se l'intera reazione dura più di un giorno, integrare fresco DTT quotidiana (1 mm) per garantire un ambiente riducente.
2. Invertire la provetta un paio di volte per mescolare. PlaCe ogni reazione in un incubatore o bagnomaria 37 ° C. L'agitazione non è necessario per l'aggregazione tau.
3. Prima di misurare la fluorescenza, accendere la spettrofluorimetro (lampada, poi computer).
   NOTA: La lampada ad arco allo xeno che può essere utilizzato immediatamente. Tuttavia, per i migliori risultati permettono alla macchina di riscaldare per circa 10 minuti prima di leggere la fluorescenza.
4. Avviare il software sul computer.
   1. Scegli Tempo reale modalità di visualizzazione in Instrument Control Center, impostare l'eccitazione lunghezza d'onda di 450 nm (slit a 2 nm) e lunghezza d'onda di emissione di 510 nm (fessura di 5 nm). Chiudere la finestra Modalità di visualizzazione tempo reale per tornare al Centro di controllo dello strumento.
   2. Scegli Constant chiave analisi Lunghezza d'onda, premere Aggiungi >> nel frame superiore per aggiungere lunghezze d'onda set. Impostare i parametri di acquisizione di errore standard a 1 e Trials massimo a 3, quindi fare clic su Aggiungi. Fare clic su Go! Per aprire la visualizzazione di datifinestra.
   3. Nella finestra di visualizzazione dei dati, fare clic su Start Acq per aprire la finestra di dialogo Nuovo campione. Scegliere "sconosciuto" per tipo di campione.
5. Per ogni miscela aggregazione 100 ml, aggiungere 98 microlitri di buffer di aggregazione e 2 pl 3 mM thioflavin T. Dispensare più volte per mescolare.
6. Trasferire la miscela in una provetta (FCA3, la dimensione esterna, WxLxH = 12,5 millimetri x 12,5 millimetri x 45 mm). Posizionare la cuvetta nel portacampioni nel campione-vano e chiudere il coperchio. Fare clic su Esegui per raccogliere i dati di fluorescenza. Registrare i dati.
7. Rimuovere la cuvetta e decantare la soluzione. Sciacquare la cuvetta da acqua distillata 3 volte. Dry soffiando aria dentro e fuori la cuvetta.

3. Con-dye, continua Modalità Assay on a Plate Reader SpectraMax M2

NOTA: Questo test differisce dalla precedente in quanto il colorante fluorescente ThT o ThS è incluso nel aggregareazione zione. Questo permette la misura continua della stessa serie di reazioni. A causa dell'uso ripetitivo della reazione, questo metodo è migliore fatto con un lettore automatico piastra multi-pozzetto (come mostrato di seguito il funzionamento del SpectraMax M2). Un fluorimetro regolare funziona anche, ma la frequenza di misura delle reazioni veloci aggregazione è piuttosto limitata, a causa della natura manuale dell'operazione.

1. Impostare il mix di aggregazione in una piastra a 96 pozzetti (96 pozzetti nero piastra solida, ben volume 360 ml, fondo piatto), come nella tabella 2. Ogni colonna rappresenta gli ingredienti necessari per una reazione di 200 ml, che è sufficiente per una misurazione del tempo-point. Mescolare bene pipettando più volte. Supplemento fresco 1mM DTT ogni giorno nel corso di esperimenti.
2. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C.
3. Ad ogni punto di tempo prima della misurazione della fluorescenza, accendere il lettore di micropiastre multi-mode e il computer. Lasciare il tempo sufficiente per la machine per stabilizzare, circa 10 min.
4. Avviare il software sul computer. Temperatura impostata a 37 ° C e scegli fluorescenza intensità modalità (FI-Top Read), impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 450 nm ed emissione lunghezza d'onda a 510 nm.
5. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel cassetto e premere il tasto per avviare la misurazione LEGGI.
6. Dopo aver letto, rimuovere la piastra e tornare indietro al C incubatore 37 °. Copiare i dati e incollare in un foglio di calcolo Excel per l'analisi dei dati e la stampa.

4. Con-dye, continua la modalità del test su un Compact Spettrofluorimetro

1. Impostare la miscela aggregazione in 1,5 ml provette Eppendorf come nella Tabella 3. Ciascuna colonna rappresenta gli ingredienti necessari per una reazione di 200 microlitri, che è sufficiente per una misurazione time-point.
2. Invertire la provetta un paio di volte per mescolare.
3. Accendere il spettrofluorimetro e impostare il software in passi 2.3 e 2.4.
4. Trasferire la miscela toa cuvetta. Posizionare la cuvetta nel portacampioni nel campione-vano e chiudere il coperchio. Fare clic su Esegui per raccogliere i dati di fluorescenza. Registrare i dati.
5. Continua a leggere ad intervalli appropriati facendo clic su Esegui e la registrazione dei dati. Se l'aggregazione deve essere controllata ad una frequenza elevata (ad esempio, ogni 30 o 60 sec), lasciano la reazione nella cuvetta e nella macchina fino a quando la misura è terminato, o quando vi è tempo sufficiente per scambiare reazioni o cuvette.
6. Rimuovere la cuvetta e decantare la soluzione. Sciacquare la cuvetta da acqua distillata 3 volte. Dry soffiando aria dentro e fuori la cuvetta.

Risultati

Utilizzando ricombinante tau e P-tau (Figura 1), abbiamo stabilito due protocolli per confrontare la cinetica di aggregazione di tau e P-tau, sfruttando la forte emissione di fluorescenza di ThT e ThS dal legame di amiloide aggregati proteici, compresi tau e p-tau (Figura 2). Con o senza colorante fluorescente nella reazione aggregazione, abbiamo osservato miglioramento consistente di aggregazione tau da hyperphosphorylation (figure 3-5). Questa stimolazione è indipend...

Discussione

Questo protocollo dimostra diverse condizioni e strumenti che rilevano i tau veloce cinetica di aggregazione fosforilazione-dipendente saggio. Nel saggio terminale, il colorante fluorescente ThT viene aggiunto ad una porzione della reazione rimossa dal master mix ad ogni tempo. Amiloide legame-Induced Fluorescence viene poi misurato ^26. Nel secondo, con colorante modalità, aggregazione tau viene effettuata in presenza di ThT o ThS, rendendo questo tipo di reazione adatto per la valutazione automatica in temp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C