In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Özet

Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.

Özet

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Giriş

(AD), Alzheimer hastalığı tauopatıler olarak bilinen nörodejeneratif hastalıkların geniş bir koleksiyon biridir. Özetin özeti patoloji yatan tauopathy nöronlar, astrositler ve mikroglia ^1-4 nörofibrillerin, NFTler vardır. NFT yoğunluk kognitif bozukluk ^3,5 ve nöron kaybı ⁶ ile ilişkilidir. NFT düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanların (PHF) ^7,8 oluşturur (bundan böyle "s-tau" olarak anılacaktır) temel olarak hiperfosforile tau proteinini içerir. Tau nöronal sinyalizasyon ve insan ticareti ^9,10 için gerekli olan aksonal taşımacılığının kolaylaştırılması düşünülen bir mikrotübül ilişkili bir proteindir. Her tau molekülü 2 ila 3 normal beyin fosfat, ancak tauopathy hastalarda ¹¹ birkaç kat fosforıl içerik artar içerir. Çoklu kinazlar GSK3 (glikojen sintaz kinaz 3β) ve CDK5 (siklin-de dahil olmak üzere, Tau hiperfosforizasyon'un katkı muhtemeldirasılı kinaz 5) ^12,13, ancak patolojik fosforizasyonundan doğrudan tetik zor ¹⁴ kalır. Veya mikrotübül bağlanma motifleri yakınındaki anormal fosforilasyon mikrotübül ¹⁵ gelen tau ayırır ve p-tau sonunda, NFT inklüzyonlar içine polimerize olabilir, düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanlar halinde oligomerizes somatodendritik bölmesi yerine tau yanlış lokalizasyon neden olur. tau hiperfosforilasyon, NFT oluşumu ve nörodejenerasyonda arasındaki yakın bağ p-tau yumaklar apoptotik ve diğer sitotoksik tepkiler, ve böylece tauopathy nörodejenerasyonda ^16,17 altında yatan nedeni olduğunu bir yaygın hipotezine yol açtı. Bu öncül dayalı ilaç ekranları ve erken klinik testler ¹⁸ başlatılmıştır. Ancak, bu hipotez zorluklarla ^19,20 karşıyadır. Örneğin, SantaCruz ve diğ., Transgenik farelerin bilişsel işlevler bir mutant ekspresyonunu bastırmak suretiyle geliştirilebilir gösterdiNFTler mevcut tau molekülleri ²¹ oluşturmak için devam olsa insan tau. Bir Drosophila modelinde, NFT temel nöron hücreleri ^22,23 korumak için toksik sitosolik tau tecrit gösterilmiştir. Açıktır ki, NFT patogenezi rolü, eğer varsa, çok tauopathy terapötik geliştirme yönünde etkileyecektir.

Birkaç β-tabaka tercih edilen floresan boyalar, elektron mikroskobu, ışık saçılması spektroskopisi ^24-27 bağlanması ile gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda, yeniden birleştirici ya da normal beyin tau proteini içinde kendiliğinden yavaş yavaş, in vitro olarak, bir PHF-benzeri bir yapı haline polimerize eder. Ekleme heparin ya da arakidonik asit, insan beyninin bir miktarda yağ asidi, büyük ölçüde tau isoform- ve indükleyici, konsantrasyona bağımlı bir davranış ^28-32 içinde PHF oluşumunu hızlandırır. Ilginç hiperfosforilize tau AD beyinlerinden saflaştırılmış veya in vitro fosforilasyon reaksiyonlarında ayrıntılı tarafından hazırlananDaha hızlı ve daha verimli bir ggregates ^26,33-35. Bu sonuçlar p-tau patolojik rolleri ile mükemmel bir uyum içindedir. F-tau agregasyonu dayanan bir in vitro sistem, böylece, AD ilaç taraması için güçlü bir araç olarak hizmet edebilmektedir.

Tau toplanması ve AD ilerici nörodejenerasyona arasındaki yakın ilişki, yanı sıra Aβ plak hedefleme ilaç geliştirme son yetmezliği, MS ^36-38 başka önemli histolojik işaretleyici, tau toplama artıyor kontrol ilaçları keşfetmek ilgi göz önüne alındığında. Nitekim, çeşitli gruplar zaten birincil tahlil gibi in vitro tau toplama reaksiyonlarda kullanarak, farklı verim ilaç ekranları başladı. Bir kimyasal madde sayısı in vitro ^39-42 tau agregasyonu üzerinde inhibe edici ya da tersine aktivite sergilediği bulundu. Ancak, mevcut tüm tau toplama regülatörü ekranlar fosfor anahtar patolojik işareti özlüyor değiştirilmemiş tau kullanınylation, AD tedavisinde bu bileşiklerin kullanıldığı özgüllük ve etkinliği için bir endişe yükselterek.

Biyokimyasal karakterizasyonu AD ilaç taraması için çekiş tahlilleri geliştirilmesi önemli engellerden biri patofizyolojik ilgili hiperfosforile tau proteininin yeterli miktarlarda üretilmesidir. Tau 1N4R izoformu ve GSK-3β kinaz E. koeksprime edildiği Fermuarlar Destekli Kataliz sistemi kullanarak E. coli lösin zipper füzyon proteinleri olarak, bu sorunun üstesinden gelebilmek olan (. Sui ve arkadaşları, R.L. tau ve p-tau son ürünler için bakınız Şekil 1, aynı zamanda, p-tau ön kütle spektrometresi karakterizasyonu için ⁴³ bakınız). Tau'nun farklı fosforilasyon bölgeleri için özel dokuz bir antikorlar panelinin kaynaktan, pozitif sinyaller sekiz pozisyonda görülmüştür (veriler gösterilmemiştir). Aşağıda, biz toplama kinetik d ayırt edebilir protokolleri ve instrumentations tarifdeğiştirilmemiş tau ve p-tau türleri arasındaki ifferences. Bu testler amiloid (tau agrega) üzerine Tioflavin T (ThT) veya tioflavin S (THS) olarak floresan artışı ²⁶ bağlayıcı ölçülen yayınlanan protokolleri modifiye edildi. İlk "terminali", hiçbir boya yaklaşımı, toplama reaksiyonları monte edilir ve amiloid boya yokluğunda kuluçkaya. Farklı zaman noktalarında, her bir reaksiyonun bir tümböleni çıkarıldı ve tau toplulukları bağlamak için THT toplanmasını durdurmak ve izin vermek için ThT-içeren tampon eşit hacmi ile karıştırılmıştır. Floresans, bir IAP FluoroMax-2 florometre ile ölçülür. "Ile-boya" İkinci sürekli izleme deneyi, ThT veya THS toplama reaksiyonlarda yer almaktadır. Floresan elle tüm deney boyunca sürekli olarak ölçülür veya çok plaka okuyucu kullanarak olabilir. Buna ek olarak, sürekli ölçüm mo toplama için tau ve p-tau yakın bir fizyolojik konsantrasyon kullanan bir analiz tanımlamaktadırlarde. fosforilasyon etki hali hazırda farkedilebilir şekilde kalır. Aşağıda, biz adım adım operasyon prosedürlerini tanımlamak ve bu tahlillerin temsilcisi sonuçları gösterecektir. Her yaklaşımın artılarını ve eksilerini bazı Tartışma, yanı sıra potansiyel ilaç tarama uygulamaları takip edecek.

Yüksek konsantrasyonda tau kendiliğinden amiloid benzeri yapılar halinde toplanır. Bununla birlikte, laboratuvarda tau fibrillization tipik haliyle bu tür teşvik ediciler olarak heparin (ortalama molekül ağırlığı 6000 g / mol) ve arakidonik asit ile hızlandırılır. Burada gösterilen örnek 30 uM heparin içerir. Tau amiloid birikintilerinin oluşmasının Tioflavin T (ThT) ile ya da S (ths) Thioflavin bağlayıcı amiloid elde edilen fluoresans ile izlenir. (:;: 485 nm tepe emisyon 450 nm eksitasyon) tau topluluklarının bağlanma üzerine, ThT floresans kırmızı kayma gösterir. Ths, diğer taraftan, amiloid bağlayıcı önce 510 nm'de (450 nm'de uyanm) zayıf emisyon vardır, ancak bu fluorescencBu tür birleştirilmiş tau ⁴⁴ gibi önemli bir amiloid proteininin mevcudiyetinde E artar. Her iki boya da tau ve p-tau bağlantısını tespit iyi çalışır. Çünkü ThT (bakınız Şekil 2), güçlü ve nispeten geniş emisyon tepe, 510 nm'de flüoresan biriminde sadece% 30 bir azalma vardır. Ya boya kullanırken kolaylık sağlamak için, biz tau izlemek için uyarma / emisyon dalga boylarında (yani, 450 nm / 510 nm) aynı kombinasyonunu kullanabilirsiniz.

Tau agregasyonu deneyinin amacına ve tau proteininin mevcudiyetine bağlı olarak, boya varlığında veya yokluğunda yapılabilir. Reaksiyonların her ikisi de modları aşağıda gösterilmiştir. Tek-örneklem flüorometre (ISA-Spex FluoroMax-2) ve bir çok plaka okuyucu (SpectraMax M2) - Ayrıca, iki farklı araçların çalışmasını göstermektedir. Okuyucular kendi özel ihtiyaçlarını ve enstrüman kullanılabilirliğini uygun bu protokolleri adapte gerekir.

Protokol

Reaktifler 1. Hazırlık

1. Agregasyon tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA). Ay için oda sıcaklığında kararlı saklayın. Kullanımdan önce 1 mM ditiotreitol (DTT), Supplement.
   Not: HEPES bazlı tampon maddesi (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT) içinde, aynı zamanda tau toplanmasının içindeki sonuçlar verir.
2. T Thioflavin ya da 0.22 um'lik steril bir filtre birimi S stok (agregasyon tamponu içinde çözülmüş 3 mM) solüsyonu ve filtre Thioflavin hazırlayın. Ay, alüminyum folyo ile kararlı kapalı bir tüp içinde -20 ° C'de saklayın.
3. (300 uM, toplama tamponu içinde çözülmüş), heparin stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de saklayın, ay boyunca stabildir.
4. (Su içinde çözülmüş 1 M,), ditiotreitol (DTT) stok hazırlayın. 1.5 ml tüpler içine kısım. -20 ° C'de saklayın. Agregasyon deneyleri önce oda sıcaklığında 1 M çözelti eritin. Bu 1,000x stoktan deiyonize su ile stok çalışan 100 mM'lik bir kısım hazırlar. Buz üzerinde bırakınhazır olana kadar.
5. ° C derin dondurucuda -80 tau çıkarın. Buz üzerinde eritin. Agregasyon tamponu ile önceden belirlenmiş bir konsantrasyona tau ayarlayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,800 x g'de bir mikrosantrfuj spin önceden oluşturulmuş büyük topaklar kaldırın. Bu ön-iplik adım protein hazırlık her parti sonraki floresan ölçümü tutarlılık artırır. Başka bir tüp süpernatant aktarın; toplama reaksiyonu monte hazır olana kadar buz üzerinde bırakın.

2. Hayır-boya, Terminal Deneyi

NOT: Bu deneyde agregasyon reaksiyonu floresan boya yokluğunda yapılır. Tüm bileşenler karıştırıldıktan sonra reaksiyon, önceden belirlenmiş zaman noktalarında için devam etmesine izin verilir. Saatlik numuneleri daha sonra çekiş reaksiyonu üzerinden alındı ​​ve ThT veya flüoresan okumadan önce bağlayıcı amiloid ths ile karıştırılır. toplama reaksiyonun ilk hacmi gerekli zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Bu yaklaşım requ olabilirtau proteininin çok miktarda ire, ancak basit, hızlı ve florometre veya bir çoklu-çukurlu tabla okuyucusu (Tartışma) yapılabilir. Aşağıda adım adım operasyon, bir floresan ölçümü için ISA SPEX FluoroMax-2 kompakt spektrofotometreyi kullanarak.

1. Tablo 1 'deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 100 ml'lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder. Özellikle deney için gereken zaman noktalarında dayalı tüm toplama karışımı için miktarını ayarlayın. Hata pipetlenmesinden yer vermek için her bir bileşenin ek% 10 ekleyin. Burada gösterilen tipik reaksiyon heparin ihtiva eden arakidonik asit ya da agregasyon tamponu ile ikame edilmiş olabilir. Reaksiyon karışımına 1 mM DTT ekleyin. Tüm reaksiyon birden fazla gün sürerse, bir indirgeyici ortam sağlamak için taze DTT gün (1 mM) tamamlar.
2. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Pla37 ° C inkübatör ya da su banyosu içinde, her reaksiyon ce. Ajitasyon tau toplama için gerekli değildir.
3. Floresan ölçüm önce, (bilgisayar sonra, ilk lamba) spektroflorometre açın.
   NOT: hemen kullanılabilecek ksenon ark lambası. Ancak, en iyi sonuçlar makine floresan okumadan önce yaklaşık 10 dakika ısıtın.
4. Bilgisayarda yazılımı başlatın.
   1. 510 nm (5 nm yarık) için Enstrüman Kontrol Merkezi'nde Gerçek Zamanlı Görüntü modu, (2 nm yarık) 450 nm ayarlanmış dalgaboyu ve emisyon dalga boyu seçin. Kapat Gerçek Zamanlı Görüntü modu penceresi Enstrüman Kontrol Merkezi'ne dönmek için.
   2. Dalga boyu setleri eklemek için üst çerçevede Sabit Dalgaboyu Analizi, Ekle tuşuna basın >> tuşuna seçin. 1 Standart Hata Set satın alma parametreleri ve 3 Maksimum Denemeler, ardından Ekle'yi tıklatın. ! Git tıklatın Veri Ekran açmak içinpenceresi.
   3. Veri Görüntüleme penceresinde, Yeni Numune iletişim kutusunu açmak için Başlat ACQ tıklayın. Numune türü için "bilinmeyen" seçiniz.
5. Her 100 ul çekiş karışımına, 98 ul tampon maddesi birikme ve T. Pipet karıştırmak için birkaç kez, 3 mM Thioflavin 2 ul ekle.
6. Bir küvete (FCA3, dış boyut, WxLxH = 12,5 mm x 12.5 mm x 45 mm) tüm karışımı aktarın. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır'ı tıklatın. Verileri kaydetmek.
7. Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru.

Ile-boya 3. SpectraMax M2 Plaka Reader Sürekli Modu Deneyi

NOT: Bu deney, bir floresan boya ThT veya ths agrega dahil olması ile, bir öncekinden farklıdıryon reaksiyonu. Bu reaksiyonlar aynı seti sürekli ölçülmesini sağlar. (SpectraMax M2 çalışması aşağıda gösterildiği gibi) için reaksiyon tekrar kullanılması, bu yöntem, daha iyi bir otomatik, çok oyuklu bir plaka okuyucu ile yapılır. Düzenli florimetre de çalışır ama hızlı toplama reaksiyonların ölçüm sıklığı nedeniyle operasyon manuel doğası, biraz sınırlı.

1. (96-çukurlu, düz siyah levha, iyi ses düzeyini 360 ul, düz taban kısmı), Tablo 2 de olduğu gibi, bir 96-çukurlu plaka içindeki agregasyon karışımı ayarlayın. Her sütun biri için yeterli olan bir 200 ml'lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder zaman noktası ölçümü. Birkaç kez pipetleme iyice karıştırın. Deneyler boyunca her gün taze 1mM DTT Supplement.
2. 37 ° C'de 96-çukurlu plaka inkübe edin.
3. Floresan ölçümü öncesinde her bir zaman noktasında, çok modlu mikroplaka okuyucusu ve bilgisayarı açın. Ma için yeterli zaman tanıyınmakina, yaklaşık 10 dakika stabilize etmektir.
4. Bilgisayarda yazılımı başlatın. 37 ° C sıcaklık ayarlama ve floresan yoğunluğu (FI-en oku) modunda, 510 nm, 450 nm ve emisyon dalga boyuna ayarlanmış olan uyarım dalga boyunu seçin.
5. Çekmece içine 96-plaka takın ve ölçümü başlatmak için OKU tuşuna basın.
6. Okuduktan sonra, plaka kaldırmak ve 37 ° C inkübatör geri dönün. Veri analizi ve komplo için bir Excel elektronik veri kopyalayın ve yapıştırın.

4. ile-boya, Sürekli Modu Deneyi bir Kompakt spektroflorometre üzerinde

1. Tablo 3 deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 200 ml'lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder.
2. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
3. Spektroflorometre açın ve adımları 2.3 ve 2.4 gibi yazılım ayarlayın.
4. Bütün karışım, t aktarınoa küvet. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır'ı tıklatın. Verileri kaydetmek.
5. Veri Çalıştır'ı tıklatarak ve kayıt uygun aralıklarla okumaya devam edin. Toplama bir yüksek frekansta (örneğin, her 30 veya 60 sn) olarak izlenecek ise, ya ölüm bitene kadar makinenin küvete ve tepkiyi bırakın, ya da tepkiler veya küvetler takas için yeterli zamanı olduğunda.
6. Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru.

Sonuçlar

Rekombinant tau ve p-tau (Şekil 1) kullanılarak, protein agregatları amiloid bağlama sahasına bağlanması üzerine ThT ve TH'nin güçlü bir floresan emisyonu, aşağıdakileri içeren tau yararlanarak, tau ve p-tau agregasyonu kinetiklerini karşılaştırmak için iki farklı protokol kurulmuş ve p-tau (Şekil 2). Ile ya da toplama reaksiyonda floresan boya olmadan, biz hiperfosforilasyon (Şekil 3-5) tarafından tau toplanmasının tutarlı geliştirme g?...

Tartışmalar

Bu protokol, farklı tahlil koşulları ve fosforilasyon-bağımlı hızlı tau toplama kinetik tespit aletleri gösterir. Terminal deneyde, floresans boya ThT her zaman noktasında ana karışımı çıkarılır reaksiyonun bir kısmına ilave edilir. Amiloid floresan sonra ²⁶ ölçülür kaynaklı bağlanma. İkinci olarak, birlikte-boya modunda, tau agregasyonu tau topluluklarının büyüme gerçek-zamanda değerlendirilmesi için uygun bir reaksiyon, bu tür işleme, ThT veya ths mevcudiyetinde gerçekle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C