In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

Resumo

Proteínas tau não modificados e hiperfosforiladas foram utilizados em dois ensaios in vitro de agregação para revelar a cinética de agregação rápida dependente de hiperfosforila�o. Estes ensaios pavimentar o caminho para futuras telas para os compostos que podem modular a propensão de tau hyperphosphorylated para formar fibrilas que fundamentam a progressão da doença de Alzheimer.

Resumo

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introdução

Doença de Alzheimer (DA) é uma de uma grande colecção de desordens neurodegenerativas conhecidos como tauopatias. O tauopathy patologia de base por excelência é os emaranhados neurofibrilares, NFTs, nos neurônios, astrócitos e microglia ^1-4. A densidade NFT se correlaciona com comprometimento cognitivo ^3,5 e neurônio perda ^6. NFT contém proteína tau hiperfosforilada principalmente (referido como "p-tau" daqui em diante), que forma filamentos helicoidais emparelhados (linear ou APC) ^7,8. Tau é uma proteína associada à microtúbulos pensado para facilitar o transporte axonal, que é essencial para a sinalização neuronal e tráfico de ^9,10. Cada molécula de tau contém 2 a 3 fosfatos em cérebro normal, mas o conteúdo de fosforilo aumenta em várias dobras em pacientes taupatia ^11. Várias cinases são susceptíveis de contribuir para a tau hyperphosphorylation incluindo GSK3β (glicogênio sintase-quinase 3β) e CDK5 (ciclina-dequinase pendente 5) ^12,13, mas o gatilho direto para a fosforilação patológica permanece indefinida ^14. Fosforilação anormal em ou perto dos motivos de ligação de microtúbulos dissocia tau do microtúbulos ^15, e faz com que tau mis-localização para o compartimento somatodendrítico, onde p-tau oligomerizes em filamentos helicoidais retas ou emparelhados que pode, eventualmente, polimerizam em inclusões NFT. A relação estreita hyperphosphorylation tau, formação NFT, e neurodegeneração levou a uma hipótese prevalente de que emaranhados p-tau extrair respostas citotóxicas apoptóticos e outros, e, portanto, é a causa subjacente para tauopathy neurodegeneração ^16,17. Telas de drogas e testes clínicos iniciais com base nesta premissa, foram lançados ^18. No entanto, esta hipótese enfrenta desafios ^19,20. Por exemplo, SantaCruz et al., Mostraram que as funções cognitivas de ratinhos transgénicos pode ser melhorada através da supressão da expressão de um mutantetau humana, embora NFTs continuou a formar a partir de moléculas de tau existentes ^21. Em um modelo de Drosophila, NFT foi mostrado para sequestrar a proteína tau citosólica tóxico para proteger as células neuronais subjacentes ^22,23. Claramente, o papel patogénese de NFT, se houver, serão de grande impacto no sentido do desenvolvimento de agentes terapêuticos taupatia.

Em concentrações elevadas, a proteína tau recombinante de cérebro normais ou espontaneamente, mas lentamente polimeriza numa estrutura semelhante a PHF in vitro, tal como indicado pela ligação de vários corantes β folhas preferidos fluorescentes, microscopia electrónica, e espectroscopia de dispersão de luz ^24-27. Adicionando heparina ou ácido araquidônico, um ácido graxo abundante no cérebro humano, acelera drasticamente a formação de PHF em isoform- tau e indutor dependentes da concentração maneiras ^28-32. Curiosamente, tau hyperphosphorylated purificada a partir de cérebros AD ou preparados por exaustiva em reações de fosforilação in vitro umggregates mais rápida e eficiente ^26,33-35. Estes resultados estão em concordância excelente com os papéis patológicos de p-tau. Um sistema in vitro baseado na agregação de p-tau pode, assim, servir como uma ferramenta poderosa para o rastreio de drogas AD.

Dada a estreita associação entre a agregação tau ea neurodegeneração progressiva da AD, bem como o recente fracasso no desenvolvimento de medicamentos visando a placa de Ap, outro marcador histológico chave de AD ^36-38, o interesse em descobrir medicamentos que controlam a agregação tau está subindo. De facto, vários grupos começaram já telas de droga no caudal diferente, utilizando, em reacções de agregação de tau in vitro como o ensaio primário. Uma série de compostos exibiram actividades inibitórias sobre a agregação de reversão ou a tau in vitro ^39-42. No entanto, todas as telas atuais regulador agregação tau tau usar inalterado que erra o alvo patológica chave de fósforoylation, levantando uma preocupação para a especificidade e eficácia da utilização destes compostos no tratamento AD.

Um dos principais obstáculos para desenvolver ensaios de agregação para caracterização bioquímica e rastreio de drogas AD é a produção de quantidades suficientes de proteína tau hiperfosforilada patofisiologicamente relevantes. Usando o sistema de Catálise Zippers assistidas em que a isoforma 1N4R de tau e da quinase GSK-3β são co-expressos em E. coli como proteínas de fusão de fecho de leucina, temos que superar esse desafio (. Sui et al, submetido; veja a Figura 1 para os produtos finais de tau e p-tau; veja também ⁴³ para caracterização de espectrometria de massa preliminar do p-tau). A partir de um painel de nove anticorpos específicos para diferentes locais de fosforilação de tau, sinais positivos foram observados em oito posições (dados não mostrados). A seguir, descrevemos os protocolos e instrumentações que podem diferenciar a agregação d cinéticaIFERENÇAS entre espécies de tau não modificado e p-tau. Estes ensaios foram modificados a partir de protocolos publicados que mediram o aumento da fluorescência de tioflavina T (ThT) ou tioflavina S (THS) sobre amilóides (agregados tau) vinculativo ^26. No primeiro "terminal", abordagem sem corante, reacções de agregação são montados e incubadas na ausência do corante amilóide. Em diferentes pontos de tempo, uma aliquota de cada reacção é removido e misturado com um volume igual de tampão de ThT contendo a parar a agregação e permitir ThT para ligar agregados tau. A fluorescência é medida por um IAP FluoroMax-2 fluorómetro. Na segunda "com corante" ensaio de monitorização contínua, ThT ou THS está incluído nas reacções de agregação. A fluorescência pode ser medida de forma contínua ao longo de toda a experiência manualmente ou utilizando um leitor de placas múltiplas. Além disso, descreve-se um ensaio que utiliza uma concentração quase fisiológica de tau e p-tau para a agregação na mo medição contínuade. O efeito de fosforilação permanece facilmente detectável. A seguir, vamos descrever os procedimentos passo-a-passo da operação, e mostrar resultados representativos destes ensaios. Discussão de alguns dos prós e contras de cada abordagem, bem como potenciais aplicações de rastreio de drogas vai seguir.

Numa elevada concentração, a tau se agrega em estruturas amilóides como espontaneamente. No entanto, no laboratório, tau fibrillization é tipicamente acelerada por indutores tais como heparina (peso molecular médio, 6.000 g / mol) e ácido araquidónico. Exemplos aqui apresentados incluem 30? M de heparina. A formação de agregados amilóides tau é monitorizada pela fluorescência resultante da sua ligação por tioflavina T (ThT) ou tioflavina S (THS) amilóide. Após a ligação aos agregados de tau, ThT exibe um desvio para o vermelho de fluorescência (excitação: 450 nm; emissão de pico: 485 nm). THS, por outro lado, tem fraca emissão a 510 nm (excitação a 450 nm) antes da ligação de amilóide, mas este fluorescence aumenta significativamente na presença de uma proteína amilóide, tais como a tau agregada ^44. Ambos os corantes funcionam bem na detecção de tau e p-tau agregação. Devido à forte pico de emissão relativamente amplo e de ThT (ver Figura 2), existe apenas 30% de redução na unidade de fluorescência a 510 nm. Por conveniência, utilizar a mesma combinação de comprimentos de onda de excitação / emissão (isto é, 450 nm / 510 nm), para controlar a agregação tau quando utilizado um ou corante.

Agregação de tau pode ser realizada na presença ou ausência do corante, dependendo do objetivo do ensaio e a disponibilidade da proteína tau. Ambos os modos de reacções são apresentados abaixo. Além disso, podemos demonstrar o funcionamento de dois instrumentos diferentes - um fluorometer single-amostra (ISA-SPEX FluoroMax-2) e um leitor multi-plate (SpectraMax M2). Os leitores devem ser capazes de se adaptar estes protocolos para atender às suas necessidades específicas e disponibilidade de instrumentos.

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes

1. Preparar tampão de agregação (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Armazenar à temperatura ambiente, estável por meses. Suplemento 1 mM de ditiotreitol (DTT) antes da utilização.
   NOTA: um tampão à base de HEPES (HEPES 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) também produz resultados semelhantes em agregação de tau.
2. Prepare tioflavina T ou S tioflavina solução estoque (3 mM, dissolvido em tampão de agregação), e um filtro de 0,22 um por unidade de filtro estéril. Armazenar a -20 ° C em um tubo coberto por folha de alumínio, estável durante meses.
3. Preparar a solução de heparina (300 uM, dissolvidos em tampão de agregação). Armazenar a -20 ° C, estável durante meses.
4. Prepare ditiotreitol (DTT) estoque (1 M, dissolvido em água). Alíquota em tubos de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C. Antes de ensaios de agregação, descongelar a solução a 1 M à temperatura ambiente. A partir deste 1.000x estoque, prepare uma alíquota de 100 mM estoque que trabalham com água deionizada. Deixar no geloaté que esteja pronto.
5. Remover tau a partir de -80 ° C congelador. Descongele no gelo. Ajustar a concentração predeterminada de tau com o tampão de agregação. Centrifugação numa microcentrífuga a 20.800 xg durante 10 min a 4 ° C para remover grandes agregados pré-formados. Este passo de pré-fiação aumenta a consistência da medição da fluorescência de cada lote subsequente da preparação de proteína. Transferir o sobrenadante para outro tubo; deixar no gelo até que esteja pronto para montar a reação de agregação.

2. Não-dye, Ensaio Terminal

NOTA: A reacção de agregação deste ensaio é realizado na ausência do corante fluorescente. Depois de misturar todos os componentes, a reacção é deixada prosseguir a pontos de tempo pré-determinados. As aliquotas são então retiradas da reacção de agregação e misturado com ThT ou THS para a ligação antes da leitura da fluorescência amilóide. O volume inicial da reacção de agregação depende do número de pontos de tempo necessários. Esta abordagem pode require uma grande quantidade de proteína tau, mas é rápido, simples, e pode ser feito de um fluorímetro ou um leitor de placa de multi-poços (ver discussão). Abaixo está o funcionamento passo-a-passo, usando o ISA SPEX FluoroMax-2 espectrofluorómetro compacto para quantificação de fluorescência.

1. Defina-se a mistura de agregação em tubos de 1,5 ml de Eppendorf como na Tabela 1. Cada coluna representa os ingredientes necessários para uma reacção de 100 ul, o que é suficiente para uma medição de ponto de momento. Ajuste a quantidade de todo o mix de agregação com base nos pontos de tempo necessário para a experiência particular. Adicionar adicional de 10% de cada componente para dar espaço para a pipetagem erro. A reacção contendo heparina típica mostrada aqui pode ser substituído por ácido araquidónico ou tampão de agregação. Adicionar DTT a 1 mM à mistura de reacção. Se toda a reacção demora mais do que um dia, complementar fresco todos os dias DTT (1 mM) para garantir um ambiente redutor.
2. Inverter o tubo algumas vezes para misturar. Place cada reacção numa incubadora de água ou banho de 37 ° C. A agitação não é necessária para a agregação de tau.
3. Antes de medir a fluorescência, ligue o espectrofluorómetro (lâmpada em primeiro lugar, em seguida, computador).
   NOTA: A lâmpada de arco de xenon que pode ser utilizado de imediato. No entanto, para obter melhores resultados permitem que a máquina aquecer por cerca de 10 min antes da leitura de fluorescência.
4. Inicie o software no computador.
   1. Escolha o modo de visualização em tempo real em Instrument Control Center, definir comprimento de onda de excitação de 450 nm (fenda de 2 nm) e comprimento de onda de emissão de 510 nm (fenda de 5 nm). Fechar a janela Modo de exibição Tempo real para retornar ao Centro de Controle de Instrumento.
   2. Escolha Constante chave Análise Wavelength, prima Add >> na estrutura superior para adicionar conjuntos de comprimentos de onda. Defina os parâmetros de aquisição de erro padrão para 1 e Trials máxima a 3, em seguida, clique em Adicionar. Clique em Go! Para abrir a tela de dadosjanela.
   3. Na janela exibir os dados, clique em Iniciar Acq para abrir a caixa de diálogo Sample Novo. Escolha "desconhecido" para o tipo de amostra.
5. Para cada mistura de agregação de 100 ul, adicionar 98 ul de tampão de agregação e 2 ul de 3 mM de tioflavina T. pipeta várias vezes para misturar.
6. Transfira a totalidade da mistura a uma cuvete (FCA3, dimensão exterior, CxLxH = 12,5 mm x 12,5 milímetros x 45 mm). Coloque a cuvete no porta-amostras em compartimento de amostra a e feche a tampa. Clique em Executar para coletar os dados de fluorescência. Grave os dados.
7. Retirar a cuvete e decantar a solução. Lavar o cadinho por água destilada 3 vezes. Dry, soprando ar para dentro e fora da tina.

3. Com-dye, Modo contínuo Assay num leitor de placas SpectraMax M2

NOTA: Este ensaio difere do anterior em que o corante fluorescente ou ThT THS está incluído no aggregareação ção. Isto permite a medição contínua do mesmo conjunto de reacções. Devido à utilização repetitiva de reacção, este método é melhor feita com um leitor de placas multi-poços automática (como mostrado a seguir a operação de SpectraMax M2). A fluorometer regular também funciona, mas a freqüência de medição de reações rápidas de agregação é um pouco limitado, devido à natureza manual da operação.

1. Defina-se a mistura de agregação em uma placa de 96 poços (placa de 96 poços preta sólida, bem volume de 360 ul, fundo plano) como na Tabela 2. Cada coluna representa os ingredientes necessários para uma reacção de 200 ul, o que é suficiente para uma medição do tempo de ponto. Misture bem por pipetagem várias vezes. Suplemento 1 mM de DTT fresco todos os dias ao longo do decorrer de experiências.
2. Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C.
3. Em cada ponto de tempo, antes da medição de fluorescência, ligar o leitor de microplacas multi-modo e ao computador. Dê tempo suficiente para o machine a se estabilizar, cerca de 10 min.
4. Inicie o software no computador. Ajuste da temperatura a 37 ° C e escolher o modo de intensidade de fluorescência (FI-Top Ler), definido pelo comprimento de onda de excitação de 450 nm e comprimento de onda de emissão a 510 nm.
5. Insira a placa de 96 poços na gaveta e pressione a tecla de leitura para iniciar a medição.
6. Após a leitura, retire a placa e devolvê-lo de volta para o 37 ° C incubadora. Copie os dados e cole em uma planilha do Excel para análise de dados e plotagem.

4. Com-dye, Modo contínuo Ensaio sobre uma Espectrofluorímetro Compact

1. Defina-se a mistura de agregação em tubos de 1,5 ml de Eppendorf como na Tabela 3. Cada coluna representa os ingredientes necessários para uma reacção de 200 ul, o que é suficiente para uma medição de ponto de momento.
2. Inverter o tubo algumas vezes para misturar.
3. Ligue o espectrofluorómetro e definir o software como nos passos 2.3 e 2.4.
4. Transferir toda a mistura toa cuvete. Coloque a cuvete no porta-amostras em compartimento de amostra a e feche a tampa. Clique em Executar para coletar os dados de fluorescência. Grave os dados.
5. Continue lendo a intervalos apropriados, clicando em Executar e gravar os dados. Se a agregação é para ser monitorizada, com uma frequência elevada (por exemplo, todos os 30 ou 60 seg), deixar a reacção na cuvete e na máquina até que a medição está concluída, ou quando não há tempo suficiente para trocar reacções ou cuvetes.
6. Retirar a cuvete e decantar a solução. Lavar o cadinho por água destilada 3 vezes. Dry, soprando ar para dentro e fora da tina.

Resultados

Usando tau recombinante e p-tau (Figura 1), que estabeleceu dois protocolos diferentes para comparar a cinética de agregação de tau e p-tau, aproveitando a forte emissão de fluorescência de ThT e THS por ligação a agregados de proteína amilóide, incluindo tau e p-tau (Figura 2). Com ou sem o corante fluorescente na reacção de agregação, observou-se aumento consistente de agregação de tau por hiperfosforilação (Figuras 3-5). Esta estimulação é indepen...

Discussão

Este protocolo demonstra diferentes condições e instrumentos que detectam as tau rápida cinética de agregação dependente da fosforilação de ensaio. No ensaio de terminal, o corante de fluorescência ThT é adicionada a uma porção da reacção foi removida a partir da mistura principal em cada ponto de tempo. Amilóide A ligação induzida por fluorescência é então medida ^26. Na segunda, com corante modo, a agregação tau é levada a cabo na presença de ThT ou THS, tornando este tipo de reacçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C