Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Resumen

Función de medición de anticuerpos es la clave para la comprensión de la inmunidad a la malaria Plasmodium falciparum. Este método describe la purificación de merozoitos viables, y la medición de la opsonización dependiente de la fagocitosis mediante citometría de flujo.

Resumen

Los antígenos de merozoitos de Plasmodium falciparum se están desarrollando como vacunas potenciales contra la malaria. Un aspecto de la inmunidad contra la malaria es la eliminación de merozoitos libres de la sangre por las células fagocíticas. Sin embargo la evaluación de la eficacia funcional de los anticuerpos específicos de merozoitos de opsonización es un reto debido a la corta vida media de merozoitos y la variabilidad de las células fagocíticas primarios. Descrito en detalle en el presente documento es un método para la generación de merozoitos viables usando el inhibidor de la proteasa E64, y un ensayo de merozoito-opsonina dependiente de la fagocitosis utilizando la línea celular monocítica THP-Pro-1. E64 evita la rotura schizont al tiempo que permite el desarrollo de merozoitos que son liberadas por la filtración de esquizontes tratados. Merozoitos bromuro de etidio marcadas se opsonizadas con muestras de plasma humano y se añadieron a las células THP-1. La fagocitosis se evalúa mediante un protocolo de alto rendimiento normalizado. Merozoitos viables son un recurso valioso para la evaluación de numeraspectos lizar la P. biología falciparum, incluyendo la evaluación de la función inmune. Los niveles de anticuerpos medidos por este ensayo están asociados con la inmunidad a la malaria clínica en individuos expuestos naturalmente. El ensayo también puede ser de utilidad para la evaluación de anticuerpos inducidos por la vacuna.

Introducción

La importancia de los anticuerpos de la inmunidad a la malaria por Plasmodium falciparum se demostró hace 40 años, cuando la inmunoglobulina hiperinmune de los adultos fue trasladado pasivamente a los niños que sufren de malaria grave resulta en la enfermedad aliviado ^1. En consecuencia, se ha buscado un esfuerzo considerable para identificar los objetivos de la inmunidad protectora de la malaria, principalmente a través de la medición de los títulos de anticuerpos a péptidos o proteínas expresadas en bacterias por ELISA. Serología basado en ELISA también ha demostrado ser altamente variable entre los estudios, y no aborda la funcionalidad de anticuerpos ^2. Muchos antígenos de malaria inducen una IgG1 cytophilic y perfil de anticuerpos IgG3, en particular antígenos de superficie de merozoito ^3. Este sesgo subclase sugiere que el anticuerpo-receptor de Fc (FcR) interacciones con los fagocitos son importantes para las funciones efectoras de los anticuerpos opsonizantes antimerozoite ^4. Varias vacunas de antígenos de merozoitos en desarrollo están diseñados paraobtener funciones efectoras fagocitos ^{5, 6} y aunque existe evidencia significativa de la importancia de las interacciones anticuerpo-FcR en los modelos de la malaria de roedores ^7-9, y algunos estudios recientes apoyan la importancia de los anticuerpos funcionales y funciones efectoras de los fagocitos para la inmunidad a la malaria en los seres humanos ^{10, 11,} esta área sigue siendo poco estudiada. Estudio en anticuerpos específicos de opsonización de merozoitos ha sido limitada por dos factores; la dificultad de aislar merozoitos de buena calidad; y las respuestas variables de fagocitosis de células primarias.

Hasta hace poco, se utilizaron de centrifugación de alta velocidad o de densidad de Percoll gradientes para aislar merozoitos de sobrenadantes de cultivo de la ruptura de las culturas esquizontes. Estos merozoitos rara vez viable, ya menudo manipulados adicionalmente por centrifugación de densidad y de lavado de múltiples etapas de ^12, o criopreservación ¹¹ antes de su uso en los ensayos. Estos proccesos potencialmente desprenden muchas proteínas asociadas periférica de la superficie de merozoitos, proteínas que se sabe que las metas antigénicas de inmunidad palúdica ^13. Recientemente, el inhibidor de la proteasa de cisteína trans-epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano (E64) se ha utilizado para generar merozoitos viables. E64 evita la ruptura de esquizontes, la generación de merozoitos de membrana cerrado ^14, que puede ser interrumpido por filtración para liberar merozoitos viables ^{15, 16.} Esta técnica ha dado lugar a la resolución espacial de numerosas proteínas durante la invasión de los eritrocitos ^{15, 17-19} y ha aclarado el efecto específico escenario de varios medicamentos antimaláricos ^{16, 20.} Sin embargo, la generación de merozoitos viables sigue siendo un reto técnico. Para ayudar en la difusión de esta técnica y su aplicación a los ensayos funcionales de la inmunidad, un protocolo detallado para la purificación de merozoitos viables y su uso en unensayo funcional estandarizado de anticuerpos: la cooperación celular en la opsonización y la fagocitosis se describe aquí.

Esta técnica demuestra un avance significativo respecto a los ensayos anteriores in vitro de la opsonización merozoito, tales como estallido respiratorio de neutrófilos, Anticuerpo celular dependiente de Inhibición (ADCI), y ensayos alternativos fagocitosis merozoito. Estos ensayos son poco reproducibles debido a la variación en las entradas de parásitos y la actividad de las células fagocíticas primarios ^{11, 21.} Hemozoin La contaminación también puede afectar profundamente la función fagocítica ^22. Un ensayo de la fagocitosis merozoíto robusta y reproducible informó recientemente ²³ utiliza la línea celular THP-1 promonocytic ^24. Este es un tipo de células ideales para ensayos de citometría de flujo de alto rendimiento, ya que es no adherente y específicamente realiza receptor Fc fagocitosis mediada por ^{25, 26.} Una complejidad adicional mientras investigatigating fagocitosis es que el grado de fagocitosis es dependiente del número de merozoitos en relación con células THP-1 y la concentración en plasma. Para asegurar la reproducibilidad entre los experimentos, los merozoitos deben ser enumeradas y una concentración definida utilizados. Debido a su pequeño tamaño, el flujo se requiere la cuantificación de citometría.

El procedimiento descrito aquí elimina hemozoína y genera merozoitos viables, y describe una aplicación de estos merozoitos para citometría de flujo enumeración de merozoitos seguido de la opsonización y la fagocitosis. Aunque técnicamente exigente, las técnicas descritas pueden resultar útiles en la aclaración de la contribución de las respuestas de anticuerpos específicos de la superficie de merozoito a adquirida de forma natural y vacuna inducida por la inmunidad.

Protocolo

NOTA: Todos los pasos, además de centrifugación y citometría de flujo, se deben realizar dentro de una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad. Asegúrese de que se tomen las debidas precauciones en cuanto a la manipulación de las muestras humanas. El ensayo es muy sensible para pequeñas cantidades de plasma. Las diluciones previstas son óptimas para la resolución de respuestas que van desde 5 hasta 78% con el plasma de los niños semi-inmunes de Papúa Nueva Guinea (PNG). La dilución óptima puede variar con los aparatos de plasma están probando, y por lo tanto se recomienda que el plasma se titula para determinar las condiciones experimentales para cada aplicación. Asegurar la inclusión de 2 controles negativos células THP-1 con merozoitos en ausencia de plasma; y THP-1 células con merozoitos opsonizadas con un pool de plasma procedente de individuos no tratados previamente de malaria. Esto permitirá que el control para la adherencia de merozoitos a las células THP-1 y para permitir rigurosa gating citometría de flujo de eventos de fagocitosis.

El uso de muestras de plasma fue PNGaprobado por el Comité Consultivo de Investigaciones Médicas, Papua Nueva Guinea Ministerio de Salud, el Walter y Eliza Pasillo Comité de Ética en Investigación del Instituto Humano (número de proyecto 04/04). Se obtuvo consentimiento escrito de los padres / tutores de todos los participantes.

1. THP-1 Cultura

1. Mantener la línea celular monocítica humana THP-1 en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 55 mM 2-mercaptoetanol (THP-1 medio) y a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ humidificado 5%.
2. Mantener las células a una densidad por debajo de 5 x 10 ⁵ células / ml. NOTA: El crecimiento excesivo dará lugar a la diferenciación en células adherentes y baja regulación de los receptores Fc. Una vez que las células han sido pases aproximadamente 10 veces, descongelar un nuevo vial para mantener el fenotipo celular.

2. Preparación de muestras y dilución de anticuerpos

1. Plasma inactive por calor a ensayar y el plasma de control de la malaria ingenuo mediante la incubación a 56 °; C durante 30 min
2. En serie diluir las muestras de plasma a 1/2, 000 en THP-1 medio.
3. Plasma tienda diluida a -20 ° C.

3. Cultura de altamente sincronizada P. falciparum

NOTA: La línea de parásitos que expresan GFP-D10 PfPHG ²⁷ fue utilizado debido a su ciclo de vida de 48 horas que ayuda a la sincronización de los parásitos y la sincronización controlada de adición E64. Además, dado que esta línea expresa GFP en el citosol, esta línea permite la detección de parasitemia y merozoitos libres por la detección de citometría de flujo de la GFP. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de GFP no es suficiente para proporcionar una visualización dentro de las células THP-1, y por lo tanto, los merozoitos se contratiñeron con bromuro de etidio (EtBr). Otras cepas de parásitos pueden ser utilizadas, a condición de que la sincronía apretado es alcanzable. Sincronizar parásitos usando una combinación de tratamiento de sorbitol para lisar formas maduras ²⁸ y heparina para inhibir la invasión ¹⁵ .

1. Mantener P. falciparum parásitos en O + eritrocitos humanos (RBC) en 3% de hematocrito en medio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado con 25 mg / ml de Hepes, 50 g / hipoxantina ml, 10% de suero humano combinado, 2 mg / bicarbonato de sodio ml, y 20 mg ml de gentamicina (medio Parásito) /. Añadir 5 mg / ml de blasticidina S-hidrocloruro para el medio de cultivo para seleccionar para GFP + parásitos.
2. Incubar culturas en cajas herméticas o frascos de cultivo, alternativamente doble sellado a 37 ° C en una atmósfera de 1% de O _2, 4% de _CO2 y 95% de _N2.
3. Preparar frotis delgados diapositivas, fijar en 100% de metanol durante 10 seg, y la tinción con solución de Giemsa al 10% en 6,7 mM (pH 7,1) tampón de fosfato (solución de Giemsa) durante 10 min para controlar la parasitemia. Después de la tinción, lavar el portaobjetos en agua y aire seco. Evaluar parasitemia usando un lente de inmersión en aceite de 100X.
4. Mantener las culturas del parásito a una parasitemia por debajo del 5% RBC infectado mediante el fraccionamiento de las culturas y la adición no infectadaRBC como se requiere.
5. Para sincronizar con la heparina, añadir 20 UI / ml de heparina de grado médico de anillo etapas culturas.
6. Cuando la mayoría de los parásitos se encuentran en la etapa de esquizonte sedimenta células a 300 xg durante 5 minutos, retire el medio que contiene heparina y resuspender en medio parásito para permitir la ruptura de esquizontes y merozoite invasión.
7. Después de 4 horas, se añaden 20 UI / ml de heparina de nuevo a las culturas, el bloqueo de cualquier invasión merozoite más. NOTA: Varios ciclos de sorbitol y el tratamiento con heparina pueden ser necesarios antes de parásitos están suficientemente sincronizados. Para generar un número adecuado de merozoitos, preparar 150 ml de cultivo de parásitos a las 3 - 5% de parasitemia.

4. Aislamiento de finales de la etapa P. falciparum trofozoítos

1. Treinta y seis horas después de volver a la heparina culturas, sedimentar las células cultivadas a 300 xg durante 5 min, y Resuspender el sedimento en medio del parásito al 25% de hematocrito.
2. Adjunte una gran columna magnética (volumen de la matriz de 6,3ml) a un imán, y equilibrar la columna con medio de parásito, asegurándose de que se eliminan todas las burbujas de aire.
3. Añadir el P. resuspendido cultura falciparum a la columna, y ajustar la tasa de flujo a una gota por segundo.
4. Una vez que la cultura ha pasado a través de la columna, lavar la columna con medio parásito hasta que el flujo a través salga clara.
5. Eluir parásitos de la columna en 30 ml de medio de parásito 37 ° C.
6. Preparar un frotis delgado de parásitos, fijar en metanol al 100% durante 10 segundos, y manchar con solución Giemsa durante 3 min. Examine el portaobjetos bajo el microscopio, y garantizar que los parásitos casi llenan los glóbulos rojos, y parecen estar en las etapas tempranas de esquizontes. Si los parásitos no han llegado a la etapa de maduración adecuado, regrese parásitos purificados a una incubadora a 37 ° C en una atmósfera de 1% de O _2, 4% de _CO2 y 95% de _N2 hasta desarrollado adecuadamente. Se requiere pureza mayor que 90% de las células rojas de la sangre infectadas para asegurar R: NOTAChalecos No contaminar las preparaciones de merozoitos.
7. Tratar esquizontes aislados con 10 mM E64 (epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano (E64) de 6 - 10 horas NOTA:. Tiempos de incubación más largos con E64 son posibles, sin embargo los merozoitos producidos ya no ser invasiva.

5. Aislamiento de P. falciparum merozoitos

1. Tras la incubación con E64, frotis parásitos, fijar las células en el 100% de metanol, y se tiñen con Giemsa solución para evaluar la formación de merozoitos rodeados de membrana. NOTA: Se obtendrá un buen rendimiento de merozoitos si más del 50% de los parásitos han formado membrana merozoitos cerrados.
2. Esquizontes Pellet E64 tratada a 1900 × g durante 8 min. Lavar con 50 ml de medio RPMI-1640 RT (pH 7,4) suplementado con 25 mg / ml de Hepes, 50 mg / ml de hipoxantina, 2 mg / ml de bicarbonato de sodio, y 20 mg / ml de gentamicina (medio de lavado) para retirar los restos de suero humano .
3. Resuspender el sedimento en 2 ml de medio de lavado. NOTA: El uso de FCS que contienen THP-1 producirá la formación de espuma durante la filtración.
4. Filtrar los 2 ml de resuspendidos E64-esquizontes a través de un filtro de jeringa de 1,2 mm μm/32. Recoger el filtrado en un tubo de 10 ml. NOTA: El filtrado contiene merozoitos y cristales hemozoína, con esquizontes un-roto y escombros recogidos en el filtro.
5. Coloque una pequeña columna magnética a un imán, y equilibrar con 500 l THP-1 medio.
6. Pase el filtrado sobre la columna magnética. Recoger el flujo a través. NOTA: hemozoína se unirá a la columna, mientras que pasarán a través de merozoitos.
7. Pasar el flujo a través sobre la columna dos veces más para eliminar hemozoína, recoger el flujo a través de cada vez.
8. Lavar la columna con 2 ml de RT de THP-1 medio para recoger cualquier merozoitos restantes.
9. Añadir EtBr a 10 g / ml (concentración final) y la mancha durante 30 min a TA. Proteger de la luz para evitar photobleaching. Nota: Asegúrese de que todo el líquido y p EtBr contaminadaresiduos Lastic está dispuesto de una manera adecuada para los productos químicos citotóxicos. Los merozoitos ya no son invasivos Después de esta incubación.
10. Decantar merozoitos a 4.000 xg durante 10 min.
11. Desechar el sobrenadante en un recipiente apropiado para desechos.
12. Resuspender pellet merozoito en 4 ml de THP-1 medio, y girar hacia abajo a 4000 xg durante 10 min.
13. Añadir THP-1 medio hasta un volumen de 15 ml, y protegerlo de la luz.

6. Cuantificación Merozoite Concentración por Citometría de Flujo

1. Lleve cuenta granos a RT.
2. Preparar PBS con 0,5% de BSA para diluir merozoitos.
3. Cuente merozoitos en 3 diluciones; 1 en 100; 1 en 50 y 1 en 25. Preparar tubos 3 FACS con 940, 930 y 910 l de PBS 0,5% BSA, respectivamente. Añadir 10, 20 y 40 l de merozoitos purificados por tubo, respectivamente.
4. Contar bolas Vortex durante 30 segundos, y añadir 50 l de perlas al tubo de FACS que contenía merozoitos diluidas.
5. Ejecute los tres dilmuestras de merozoitos buido en un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm. Establecer una puerta estricto para merozoitos basados ​​en EtBr y la fluorescencia de GFP fluorescencia dual, y contar bolas puerta por la fluorescencia en un canal separado. Adquirir eventos hasta que se recogieron 2.000 granos. Nota: Estas instrucciones se refieren a contar las buenas prácticas agrarias + merozoitos que han sido teñidos con mostrador con EtBr. Si no la utilización de parásitos que expresan GFP entonces establecidos puertas de merozoitos basado en la dispersión lateral y la fluorescencia de EtBr.
6. Determine la relación de merozoitos: Granos dividiendo el número de eventos de merozoitos por los 2.000 eventos de conteo de cuentas, calcular un coeficiente para cada dilución. Utilice las especificaciones de lote de cuentas de conteo para determinar el número de cuentas en los 50 l de cuentas añadidas por tubo.
7. Multiplicar el número de cuentas en 50 l por el factor de dilución y por el merozoito: relación de grano para que el factor de dilución. Este número es igual a la concentración de merozoitos por ml. RealizarlESE pasos para cada dilución.
8. La media de los merozoitos concentraciones medidos en las tres diluciones. NOTA: Las desviaciones estándar por encima de 10% para las concentraciones determinadas para 1 en 100, 1 en 50 y 1 en 25 diluciones indican imprecisiones técnicas en la preparación de muestras de recuento.
9. Resuspender merozoitos en 8 x 10 ⁶ merozoitos / ml en medio de THP-1 para garantizar una relación final de cuatro merozoitos por THP-1 células. NOTA: Otros merozoite a THP-1 coeficientes puede ser utilizada, y las concentraciones deben modificarse en consecuencia.

7. Ensayo de fagocitosis

1. Añadir 200 l de calor FCS inactivos por pocillo de 96 pocillos de fondo en U, y dejar a temperatura ambiente O / N para bloquear las placas. Después de la incubación, retire FCS y lavar los pocillos dos veces con 200 l de PBS estéril. Retirar PBS y las placas se almacenan a 4 ° C hasta que sea necesario.
2. Calcular el número de células THP-1 requeridos para poner a prueba las muestras de plasma y los controles, lo que permite pocillos triplicados por muestra a 1 x 10 ^{5 células THP-1 por pocillo.}
3. Determinar THP-1 concentración cultura mediante la carga de 10 l de la cultura sobre un porta hemocitómetro. Contar el número de células presentes en 4 series de 16 cuadrados de las esquinas del hemocitómetro bajo un microscopio, a continuación, el promedio de los conteos. Multiplicar el recuento promedio por 10000 para calcular el número de células por ml.
4. Decantar el número necesario de células THP-1 a 500 xg durante 5 min, y volver a suspender en 6,7 x 10 ⁵ células / ml en THP-1 medio.
5. Añadir 150 l de células THP-1 en células THP-1 medio por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo en U bloqueado-FCS, dando como resultado 10 ⁵ células / pocillo. Preparar 3 pocillos por muestra, que se probarán. Placa de retorno a la incubadora hasta que esté listo para agregar merozoitos.
6. Añadir 150 l de preparación de merozoitos en 8 x 10 ⁶ / ml por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U separada bloqueado-FCS. Preparar un pocillo por muestra analizada
7. Añadir 10 l de las muestras de plasma diluidas preparadas por pozo, en tél plato que contiene los merozoitos, y mezclar bien para asegurar una solución homogénea.
8. Retire la placa de THP-1 de la incubadora, y añadir 50 l de la solución de merozoitos / plasma por pocillo que contiene células THP-1, con tres pozos por muestra de plasma.
9. Mezclar bien e incubar a 37 ° C en 5% de CO _2, incubador humidificado durante 40 min. Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
10. Después de 40 min, las muestras de centrifugación durante 5 min a 500 xg en un 4 ° C preenfriar centrífuga para detener la fagocitosis.
11. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces en PBS enfriado con hielo 0,5% de BSA mM EDTA 2 (tampón FACS). NOTA: EDTA facilitará en el mantenimiento de una suspensión de células para análisis de citometría de flujo.
12. Fijar las células en 90 l de 2% de paraformaldehído (PFA) en PBS 0,5% BSA mM EDTA 2 (FACS fijador). Deja en hielo hasta la adquisición, protegido de la luz.

8. Citometría de Flujo

1. Adquirir muestras usando un citómetro de flujo equipado with un láser de 488 nm y un alto rendimiento lector de placa de fijación. NOTA: Esto permitirá que hasta 400 muestras de plasma para ser probado de una preparación de merozoitos. Las células también pueden ser transferidos a tubos para la carga manual de las muestras.
2. Gate viables THP-1 células de dispersión frontal y lateral.
3. Ajuste la puerta segura de EtBr en base a las "células THP-1 con merozoitos y no hay plasma 'control.
4. Adquiera un mínimo de 10.000 eventos por muestra.

9. Análisis de Datos

1. Analizar datos usando citometría de flujo de software de análisis, y establecer puertas estrictas para eventos EtBr positivos.
2. Calcular el porcentaje de fagocitosis para cada muestra: el% de + células EtBr para la muestra, menos las células positivas% con plasma no inmune.
3. Los resultados promedio de todo por triplicado. NOTA: Las desviaciones estándar para un triplicado en exceso de 10% indican imprecisiones experimentales. Algunos eventos fondo EtBr positivos se pueden observar como resultado de merozoiTE adhesión a la superficie de las células THP-1, pero debe ser consistente a través de todas las muestras que contienen merozoitos. Ajuste de la puerta sobre la base de las "células THP-1 con merozoitos y no plasma" control, y luego restar cualquier fondo de las "células THP-1 con plasma no inmune" control dará lugar a la fagocitosis% que refleja la fluorescencia debido a internalizado / fagocitado sólo merozoitos.

Resultados

La etapa de maduración de los parásitos antes del tratamiento E64 es fundamental para la generación de merozoitos rodeados de membrana. Figura 1Ai muestra el estado de maduración adecuado de esquizontes para agregar E64. Los parásitos deben ser grandes y casi llenar el glóbulo rojo. Una apariencia moteada de la tinción de Giemsa indica merogonia ha comenzado, y E64, debe añadirse a producir merozoítos rodeados de membrana (Figura 1AII). Si E64 se añade antes de trophozoite etapa parásitos, membrana merozoitos cerrados no se generan, incluso después de 12 h de E64. En lugar parásitos toman en la morfología anormal como la ampliación de la vacuola digestivo (Figura 1Bi y 1Bii), y merozoitos no se forman. Si E64 se añade posteriormente a esquizontes, merozoitos rodeados de membrana no se generan como ruptura schizont está desinhibido (Figura 1CI y 1Cii). Se requiere un alto nivel de sincronía parásito, otrasabio una gama de los tres resultados descritos se verá después del tratamiento E64.

La eliminación de hemozoin es otro paso crítico para merozoitos purificantes. Si merozoitos no se purifican a partir hemozoína a continuación, grupos-merozoitos hemozoína forman que no puede ser desalojado por pipeteado. Estos agregados se ejecutan en el citómetro como eventos individuales, aunque con diferentes características de dispersión frontal y dispersión lateral que merozoitos individuales, lo que resulta en inexacta recuento de merozoitos por citometría de flujo (Figura 2A). Como las células THP-1 también pueden fagocitar hemozoin, estas agrupaciones merozoitos hemozoína también pueden ser fagocitados (Figura 2B). Estos agregados son fluorescentes altamente EtBr ya que contienen múltiples merozoitos. La fagocitosis de agregados resultados en una THP-1 el perfil de fluorescencia de EtBr equivalente a la observada para la fagocitosis de múltiples merozoitos individuales. Por lo tanto, si no se elimina hemozoína, la fluorescencia de EtBr de células THP-1 será un Overestimate del potencial de opsonización para el plasma se está probando. Hemozoína También se informa de alterar significativamente la función fagocítica. Merozoitos GFP positivas contador tiñeron con bromuro de etidio para aumentar la visualización de merozoitos fagocitados por las células THP-1. Usando las condiciones descritas en este protocolo, todos los merozoitos GFP positivos se counterstained con EtBr que tiene una intensidad de fluorescencia más brillante (Figura 3A). Evaluación de la fagocitosis por fluorescencia de EtBr permite una resolución superior de la fagocitosis de merozoitos de la fluorescencia de GFP (Figura 3B).

El número de merozoitos añadido al ensayo modula la cantidad de fagocitosis observado. Por esta razón, recuento preciso por citometría de flujo es crítico. El aumento de las proporciones de merozoitos: THP-1 se traducirá en un aumento de la adherencia de merozoitos a las células THP-1 en ausencia de plasma (Figura 4A). El aumento de merozoitos: THP-1 coeficientes también se traduce en un aumento de phrespuestas agocytosis cuando merozoitos se opsonizadas (Figura 4B). A 04:01 merozoíto: se recomienda THP-1 ratio para respuestas fagocíticas robustos. Usando esta relación, y la dilución de plasma indicado, este ensayo es capaz de resolver bajos, intermedios y altos niveles de anticuerpos opsonizantes. Entre 0 y 78 respuestas fagocitosis por ciento se han observado usando muestras de plasma PNG y las otras condiciones descritas. Tales respuestas se muestran recientemente asociarse con inmunidad clínica adquirida de forma natural a la malaria ^10. Figura 5 muestra ejemplos de los 4 cuartiles de las respuestas de la fagocitosis de los individuos PNG.

Figura 1. Momento de la adición E64 es crítico para la generación de merozoitos rodeados de membrana. (A) maturatio apropiada. n la etapa de parásitos i) antes del tratamiento E64, y ii) merozoitos rodeados de membrana producidos después de las 6 h de tratamiento E64 (B) de la membrana merozoitos cerrados no se generan si E64 se añade a los parásitos inmaduros; i) trofozoítos etapas tardías, y ii) después de 12 h de E64 (C) esquizontes ruptura no se inhibe si E64 se añade segmentado esquizontes tarde.; i) esquizontes etapas tardías, y ii) después de 6 horas de E64. La barra de escala representa 10 micras.

Figura 2. Eliminación hemozoína es fundamental para generar una suspensión de merozoitos de una sola célula. Áridos Merozoite-hemozoína forman después de la filtración de membrana merozoitos adjuntos, salvo hemozoin se separa magnéticamente de merozoitos. (A) de la dispersión frontal y lateral-gráficos de dispersión de merozoitos con hemozoin eliminadoy hemozoína retenido. (b) los agregados-hemozoin merozoito pueden ser fagocitados por las células THP-1. Manchados Diff-Quick diapositivas cito-centrifugado de células THP-1 se incubaron con plasma PNG opsonizadas preparativos merozoitos con o sin hemozoin. La barra de escala representa 10 micras.

Figura 3. Tinción de bromuro de etidio permite una resolución superior de la fagocitosis de merozoitos. D10-GFP merozoitos purificados se counterstained con EtBr para mejorar la intensidad de la fluorescencia. (A) La citometría de flujo histrogram de merozoitos purificados con gating en merozoitos GFP positivos, y una transferencia de puntos mostrando EtBr fluorescencia dentro de esta población positivas GFP cerrada. (B) de dispersión hacia adelante frente a las buenas prácticas agrarias y la dispersión hacia adelante frente EtBr de las células THP-1 después de la fagocitosis de merozoitos fluorescentes duales GFP y EtBr. Puertas se d Rawn basado en las células THP-1 con merozoitos y sin control de plasma.

Figura 4 El merozoito:. THP-1 relación influye en el grado de fagocitosis observado. (A) Cinco merozoíto: THP-1 cocientes se representan; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Las células sólo de control indica la fluorescencia de fondo debido a las células THP-1. THP-1 de fluorescencia de EtBr para cada relación está indicado para merozoitos opsonizadas con un pool de plasma PNG o con el plasma de Australia no inmune (B) intensidad de fluorescencia media de células THP-1 para diferente merozoito:. THP-1 proporciones, y la opsonización con una piscina de plasma PNG o plasma australiano no inmune (media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Una amplia gama de anticuerpos opsonizantes se puede medir. Los merozoitos fueron opsonizado con plasma de individuos PNG y se incubaron con células THP-1. Cuatro se muestran respuestas representativas de fagocitosis. Gates, se elaboraron sobre la base de las células THP-1 con merozoitos y sin control de plasma, y los números indican la fagocitosis% después de la sustracción de las células THP-1 con control de plasma no inmune. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Para medir la fagocitosis de merozoitos, el dominio de dos técnicas se requiere: purificación de merozoitos y THP-1 ensayo de la fagocitosis. Los pasos más importantes para la combinación de estas dos técnicas son: 1) los parásitos altamente sincronizados; 2) Adición de E64 en el momento correcto para producir la membrana merozoitos cerrados; 3) Extracción de hemozoína para evitar los agregados; 4) recuento exacto de merozoitos por citometría de flujo; 5) la dilución de plasma utilizado; y 6) el mantenimiento de baja densidad de células y el número de paso de las células THP-1. Una cuidadosa consideración de estos aspectos clave será asegurar que se observaron respuestas fagocitosis robustos.

Aunque, se describe aquí es la preparación de merozoitos para la evaluación de la fagocitosis, la técnica se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones. Independientemente de la metodología corriente abajo, preparaciones óptimas de merozoitos dependen correctamente momento de la adición E64 con el fin de generar merozoitos. El método E64 descrito aquí se ha demostrado que Yield merozoitos invasivos para su uso en microscopía de alta resolución de los acontecimientos de la invasión y los ensayos de sensibilidad a los fármacos ^15-20. Mientras que la viabilidad de merozoitos no es esencial para la fagocitosis, se requiere la integridad de la capa de superficie del merozoito. Por lo tanto, el método aquí descrito permite E64 merozoitos de alta calidad que se producen para la evaluación de las respuestas de anticuerpos a la capa superficial. Como se indica en la Figura 1, si el E64 se añade demasiado temprano o demasiado tarde membrana merozoitos cerrados no se forman. Por esta razón, se requieren cultivos de parásitos altamente sincrónicas. Aquí, el uso de tratamientos de sorbitol y heparina para sincronizar estrechamente D10-GFP cultivos de parásitos a una ventana de 2 horas se describe. La heparina puede promover gametocitogénesis en otro laboratorio aísla, y por lo tanto se debe utilizar con cuidado. Métodos de sincronización alternativos tales como alanina también pueden utilizarse, siempre que los parásitos estrechamente sincronizadas se producen ^29. Si E64 se añade a los parásitos asíncronos, un apoyo inferioraminan de merozoitos rodeados de membrana se produce y se infecta-parásito restante RBC o bien romper con normalidad o desarrollar morfología anormal. La presencia de parásitos que no han desarrollado en la membrana cerrado merozoitos dará lugar a la obstrucción del filtro y reducir significativamente el rendimiento obtenido merozoito.

Durante la filtración de merozoitos rodeados de membrana, hemozoin se libera de las vacuolas digestivas y está presente en forma de cristales libres en solución. Hemozoína es altamente proinflamatorias y se ha informado de modular de monocitos y la fagocitosis de macrófagos respuestas ^{30, 31.} Además de la modulación de la fagocitosis, tal como se muestra en la Figura 2, hemozoína puede formar agregados con merozoitos en solución. Como las células THP-1 pueden fagocitar estos agregados, esto puede ser un factor de confusión importante para la resolución de la fagocitosis mediada por anticuerpo. Por lo tanto, la eliminación de hemozoína es necesario en este ensayo a avcomplejidad adicional oid de hemozoin en la biología de los fagocitos. Además, el fracaso para eliminar hemozoína también pueden ser perjudiciales cuando se utiliza esta técnica para generar merozoitos libres para otras aplicaciones, especialmente donde se requiere la cuantificación de merozoito.

Como se indica en la Figura 4, el número de merozoitos añadió al ensayo pueden influir en el grado de fagocitosis por células THP-1. Aunque la citometría de flujo permite la enumeración de concentración merozoito, cuidadoso pipeteado y replicar cargos de merozoitos son necesarias para mejorar la precisión. Esto es especialmente importante si hay múltiples líneas de parásitos que puedan ser comprobadas de lado a lado. Previamente se ha demostrado que el plasma de los niños semi-inmunes de PNG puede ser diluido antes de respuestas significativamente disminuyen ^23. Se describe aquí es la dilución óptima del plasma (1/120, 000 dilución final del plasma) para una cohorte de 5 - 12 años de edad los niños PNG que produjo la gran gama de phagocyt. respuestas OSIS descritos en la Figura 5 Este rango permitido para la estratificación de las respuestas en cuatro grupos (0 - 19%, 20 - 39%, 40 - 59% y 60-79% de la fagocitosis), y un modelo de regresión revelaron que las respuestas se asociaron con opsonizantes la protección de la enfermedad clínica y la parasitemia de alta densidad ¹⁰ Para diferentes estudios de cohortes, puede ser necesario ajustar la dilución de plasma para asegurar la fagocitosis por células THP-1 no está saturada o por debajo del nivel de detección.

Citometría de flujo permite que la fagocitosis rápido y cuantificable con precisión mejorada durante la microscopía. Este protocolo es un alto rendimiento, la placa basada y adquisición de placas de 96 pocillos para el estudio de la inmunidad humoral adquirida naturalmente automatizado. El método requiere la tinción de merozoitos con bromuro de etidio, las manchas de ADN sin embargo alternativos tales como SYBRgreen, DAPI y yoduro de propidio, manchas de membrana o las manchas de proteínas se podrían utilizar. Este ensayo sería susceptible de PrimarY o monocitos neutrófilos y podrían adaptarse si los fagocitos o la biología FCR fue de interés. Las células primarias o células THP-1 diferenciados in vitro con PMA se pueden utilizar para estudiar la fagocitosis en la malaria y otros patógenos ^{12, 32-34.} Sin embargo el uso de células primarias puede ser un reto ya que estas células son adherentes y también muestran no fagocitosis mediada por anticuerpos ^35. Además, la variabilidad en la pureza, la viabilidad y funcionalidad son algunas limitaciones clave para el uso de las células fagocíticas primarios. Los receptores Fc involucrados en la fagocitosis merozoito permanecen sin caracterizar, y por lo tanto el uso de anticuerpos bloqueantes a receptores específicos Fc podría dilucidar la contribución de cada receptor Fc a merozoite fagocitosis. Como THP-1 fagocitosis es FcR dependiente, esto permite que la interpretación directa de la fagocitosis observado. Este ensayo también se presta a abordar la especificidad de antígeno de anticuerpos opsonizantes que podría lograrse por utilizing parásitos knock-out para los antígenos de superficie de merozoitos, o el uso de afinidad anticuerpos humanos purificados a merozoite proteínas de superficie. Además, en estudios a fondo de las respuestas de citocinas siguientes fagocitosis merozoito faltan, y podría lograrse utilizando este ensayo.

Estas dos técnicas constituyen importantes avances en el estudio de anticuerpos antimerozoite funcionales. La purificación de merozoitos de alta calidad es ventajoso el uso de merozoitos criopreservados, o microesferas fluorescentes recubiertos con antígenos de merozoitos. Aunque este ensayo se ha utilizado como una herramienta para evaluar la inmunidad adquirida de forma natural, puede resultar una herramienta importante para hacer frente a la adquisición de inmunidad en respuesta a la vacunación. Si bien se ha demostrado recientemente que la fagocitosis o merozoitos opsonised se asocia con la protección contra la malaria clínica, no es posible sacar conclusiones directas de in vitro de THP-1 a la fagocitosis in vivo fagocitosisSIS de merozoitos como la fagocitosis en este ensayo se produce bajo condiciones estáticas y en ausencia de competir células rojas de la sangre. Las adaptaciones posibles de este ensayo pueden por lo tanto proporcionar una herramienta versátil para una mayor comprensión de la malaria y la fagocitosis de merozoito.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1 cell line	American Type Culture Collection	TIB-202
RPMI-1640	Gibco	31800-089
Fetal Calf Serum (FCS)	Invitrogen	10099-141
2-mercapthoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML	Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x)	Sigma	P0781
HEPES	SAFC	90909C	Cell culture grade
hypoxanthine	Calbiochem	4010
Human Serum	Donation from Autralian Red Cross		Available commercially (i.e. Invitrogen)
sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	1.06329.0500
gentamycin	Pfizer	61022027	Injection Quality
heparin Sodium BP (5000IU/mL)	Pfizer		procine origin
Blasticidin S-hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	50-70-4
E64 Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	E3132-10MG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	98281-100G	Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20	Merck	10383.4G	Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck	1.09204.0500	1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm	Pall Life Sciences	4656
QuadroMACS Separator (for small column)	MACS Miltenyi BioTec	130-091-051	Interchangeable with MidiMACS
VarioMACS Separator (for large columns)	MACS Miltenyi BioTec	130-090-282
MACS MultiStand	MACS Miltenyi BioTec	130-042-303
LS Column (small magnetic column)	MACS Miltenyi BioTec	130-042-401
large magnetic column	MACS Miltenyi BioTec	130-041-305
Ethidium Bromide	Bio-Rad	1510433	Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads	Invitogen	C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader	BD Biopsciences
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software	Tree Star