Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Özet

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Özet

Plasmodium falciparum merozoit antijenler potansiyel sıtma aşıları gibi geliştirilme aşamasındadır. Sıtmaya karşı bağışıklık bir özelliği, fagositik hücreler tarafından kandan serbest merozoit kaldırılmasıdır. Bununla birlikte, belirli merozoit opsonizing antikorlarının fonksiyonel etkinliğini değerlendirmek nedeniyle merozoit kısa yarılanma ömrü ve primer fagositik hücrelerin değişkenliği nedeniyle zordur. Ayrıntılı olarak açıklanmıştır, burada E64 proteaz inhibitörü kullanılarak uygulanabilir merozoitler üretilmesi için bir yöntem ve pro-monositik hücre hattı THP-1 kullanılarak merozoit bir deney opsonin bağımlı olduğunu fagositoz. Tedavi schizontsun süzülerek yayımlanan merozoit gelişimini sağlarken E64 şizont rüptürü önler. Etidyum bromür etiketli merozoites insan plazma numuneleri ile opsonize ve THP-1 hücrelerine ilave edildi. Fagositoz standart bir yüksek verimli protokolü ile değerlendirilir. Canlı merozoites numer değerlendirmek için değerli bir kaynaktırP. lı yönleri Bağışıklık fonksiyonunun değerlendirilmesi dahil falciparum biyoloji,. Bu deneyi ile ölçülen antikor seviyeleri doğal maruz kalmış bireylerdeki sıtma klinik bağışıklık ile ilişkilidir. Tahlil, aynı zamanda aşının neden olduğu antikorları değerlendirmek için yararlı olabilir.

Giriş

Plasmodium falciparum sıtma karşı bağışıklık için antikorların önemi 40 yıl önce, hiper-yetişkinlerden immünoglobulin zaman pasif hafifletilen hastalık ^{1 'de} elde edilen ciddi sıtma hastası çocukların aktarılmıştır gösterildi. Sonuç olarak, önemli çaba çoğunlukla ELISA ile peptitler veya bakteriyel proteinlere antikor titreleri ölçme yoluyla, koruyucu sıtma bağışıklığın hedefler belirlemeye çalışmıştır. ELISA tabanlı seroloji de çalışmalar arasında oldukça değişken olduğunu kanıtlamıştır, ve antikor işlevselliği ² gidermez. Birçok sıtma antijenleri, cytophilic IgG1 ve IgG3 antikor profili, özellikle de merozoit yüzey antijenlerini ³ neden olur. Bu alt sınıf, bias fagositlerle antikor-Fc-reseptörü (FcR) etkileşimleri antimerozoite antikorların ⁴ opsonizing efektör fonksiyonlar için önemli olduğunu göstermektedir. Geliştirilmekte olan çeşitli merozoit antijen aşıları için tasarlanmıştırfagosit efektör fonksiyonları ^{5, 6} ve ortaya kemirgen sıtma modellerinde antikor FcR etkileşimlerinin önemi için önemli kanıtlar mevcut ^7-9 ve birkaç son çalışmalar insanlarda sıtmaya karşı bağışıklık için, fonksiyonel antikor ve fagosit efektör fonksiyonlarının önemini destek rağmen ^{10, 11,} bu alanda kötü okudu kalır. Merozoit özel opsonizing antikorların içine Çalışması iki faktör ile sınırlı kalmıştır; kaliteli merozoites tecrit içinde zorluk; primer hücrelerden ve değişken fagositoz yanıtları.

Yakın zamana kadar, yüksek hızlı santrifüjleme ya da Percoll yoğunluk gradyanları şizont kültürleri yırtılma kültür süpernatanlarından merozoitler izole etmek için kullanılmıştır. Bu merozoites nadiren uygun olan ve genellikle daha fazla yoğunluk santrifüj ile manipüle ve birden çok yıkama tahlillerinde kullanımdan önce ¹² veya kriyo-korunmasının ¹¹ adımları tekrarlayın. Bu processes potansiyel merozoit yüzeyinden birçok periferik ilişkili proteinleri, sıtma dokunulmazlık ¹³ antijenik hedefler olarak bilinen proteinleri ayırmak. Son zamanlarda, sistein proteaz inhibitörü trans-epoksisukini-L-ösi (4-guanidino) bütan (E64) uygun bir merozoitler oluşturmak için kullanılmıştır. E64 uygun merozoitler ^{15, 16} serbest bırakmak için süzme ile bozulabilmektedir zar kapalı merozoitler ^14, üreten, şizont kopma önler. Bu teknik eritrosit işgali ^{15, 17-19} sırasında çok sayıda proteinlerin mekansal çözünürlükte yol açtı ve birkaç antimalarialların ^{16, 20} sahne özgü etkisini netleştirdi. Ancak, canlı merozoit nesil teknik açıdan zorlayıcı kalır. Bağışıklık ile ilgili işlevsel deneyler, bir viyabl merozoit saflaştırma ve bunların kullanımı için ayrıntılı bir protokol için bu tekniğin ve uygulamanın yayılması yardımcı olmak içinantikor standart fonksiyonel deneyi: opsonitasyonunu ve fagositozu hücresel işbirliği burada tarif edilmektedir.

Bu teknik, nötrofil solunum patlamasının, antikor bağımlı hücresel İnhibisyonu (ADCI) ve alternatif merozoit fagositoz tahlilleri gibi merozoit opsonitasyonunu önceki in vitro deneylerde, üzerinde önemli bir gelişmeyi gösterir. Bu analizler parazit girişler varyasyonun ve primer fagositik hücreler ^{11, 21} aktivitesine kötü tekrarlanabilir. Kirlenmesine hemozoin da derinden phagocyte fonksiyonunu ^22. etkileyebilir. Bir son bildirilen sağlam ve tekrarlanabilir merozoit fagositoz deney ²³ promonositik hücre hattı THP-1 ²⁴ kullanır. Bu yapışkan olmayan ve spesifik olarak Fc-reseptörü aracılığıyla olan fagositozla ^{25, 26} yerine olarak bu yüksek işleme kapasiteli bir akış sitometri analizleri için ideal bir hücre türüdür. Ek bir karmaşıklık araş ikenfagositoz tigating fagositoz derecesi THP-1 hücreleri ve plazma konsantrasyonu göre merozoit sayısına bağlı olmasıdır. Deneyler arasında yeniden üretilebilirlik sağlamak için, merozoites numaralandırılmış olmalıdır ve belli bir konsantrasyonu kullanılır. Nedeniyle küçük boyutu, sıtometrık ölçümü gereklidir akış.

Burada tarif edilen prosedür hemozoin kaldırır ve uygulanabilir merozoitler oluşturur ve opsonitasyonunu ve fagositozu ve ardından merozoit akış sitometrik sayımı için, bu merozoit bir uygulamasını tarif etmektedir. Teknik olarak zor olmasına rağmen, açıklanan teknikler doğal olarak elde edilen ve aşı bağışıklık kaynaklı için merozoit yüzey özgü antikor yanıtlarının katkı açıklık de yararlı olabilir.

Protokol

Not: Bütün safhalar, santrifüjleme ve akış sitometrisi yanı sıra, sterilliği korumak için, bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır. Uygun önlemler insan örneklerinin kullanımı ile ilgili alınmış olduğundan emin olun. Deney Plazma küçük miktarlarda için çok hassastır. % 78 Papua Yeni Gine (PNG) yarı-immün çocukların plazma - Resim seyreltileri 5 arasında değişen tepkileri çözmek için en uygunudur. En uygun seyreltme plazma setleri, test edilen bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, plazma, her uygulama için deneysel koşullar elde etmek için titre edilmesi önerilir. Plazma yokluğunda merozoit 2 negatif kontrol THP-1 hücreleri, ilave edilmesini temin etmek; ve merozoit ile THP-1 hücreleri, sıtma naif bireylerden plazma bir havuzu ile opsonize. Bu THP-1 hücreleri merozoit bağlılık için kontrolü sağlayacak ve fagositoz olayların titiz akım sitometri yolluk etkinleştirmek için.

PNG plazma örneklerinin kullanımı olduTıbbi Araştırmalar Danışma Kurulu, Sağlık Papua Yeni Gine Bakanlığı, Walter ve Eliza Hall Institute Etik Kurulu (proje numarası 04/04) tarafından onaylanmıştır. Yazılı izin tüm katılımcıların anne / veliler elde edilmiştir.

1.. THP-1 Kültür

1. % 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1 ortamı) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortam maddesi içinde ve 37 ° C 'de, insan monositik hücre hattı THP-1 koruyun.
2. 5 x 10 ⁵ hücre / ml 'nin altındaki bir yoğunlukta hücreler koruyun. Not: Fazla büyüme yapışık hücreler içine aşağı-regülasyonu Fc reseptörleri farklılaşması ile sonuçlanır. Hücreler, yaklaşık 10 kez daha pasajlama edildikten sonra, hücre fenotipi korumak için yeni bir şişe eritin.

2.. Antikor Numune Hazırlama ve seyreltme

1. Isı etkisizleştirilmiş plazma 56 ° C'de inkübe tarafından test edilmiş ve sıtma görmemiş kontrol plazma edilecek, 30 dakika boyunca C
2. Seri olarak THP-1 ortamı içinde 1/2, 000 plazma örnekleri seyreltin.
3. -20 ° C'de saklayın seyreltilmiş plazma

Yüksek Senkronize P. 3. Kültür falciparum

Not: GFP-ifade parazit hattı ^D10-27 PfPHG nedeniyle parazitlerin senkronizasyon ve E64 Eklemenin zamanlaması kontrol edilen yardımcı olarak 48 saat yaşam döngüsü için kullanılmıştır. Bu hat sitosolde GFP ifade çünkü Dahası, bu hat GFP akış sitometri tespiti tarafından parasitaemia ve ücretsiz merozoit algılanmasını sağlar. Bununla birlikte, GFP floresan yoğunluğu THP-1 hücreleri içinde görüntülenmesini sağlamak için yeterli değildir ve bu nedenle, merozoites Etidyum bromür (EtBr) ile karşı edilir. Diğer suşlar parazit sıkı senkron başarılabilir koşuluyla kullanılabilir. Invazyon ¹⁵ inhibe etmek için olgun formları ²⁸ ve heparin parçalamak için sorbitol tedavinin bir kombinasyonu kullanılarak parazitler senkronize .

1. P ismi koruyun falciparum RPMI-1640 ortamı içinde% 3 hematokrit 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin,% 10 toplanmış insan serumu, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ile desteklenmiş (pH 7.4), O + insan eritrositleri (RBC) olarak parazitleri ve 20 ug / ml gentamisin (Parazit ortamı). GFP + parazitler için seçmek üzere kültür ortamına 5 mg / ml Blasticidin-S hidroklorid ekleyin.
2. % 1 O _2,% 4 _CO2 ve% 95 _N2 atmosferinde 37 ° C 'de hava geçirmez kutu veya alternatif olarak çift kapalı kültür şişelerinde kültürleri inkübe edin.
3. , Ince bir tabaka slaytlar Hazırlama 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 6.7 mM (pH 7.1) paraziteminin izlemek için 10 dakika boyunca fosfat tamponu (Giemsa çözeltisi) içinde% 10 Giemsa çözeltisi ile lekesi. Boyama sonra, su ve hava-kuru olarak slayt durulayın. Bir 100X immersiyon yağı lens kullanarak paraziteminin değerlendirin.
4. Kültürleri bölme ve bulaşmamış ekleyerek% 5 enfekte RBC altında bir parazitemya az parazit kültürleri korumakRBC gerektiği gibi.
5. Heparin ile senkronize etmek için, kültürleri aşamalı halka tıbbi dereceli heparin 20 IU / ml ekleyin.
6. Parazitlerin çoğunluğu şizont aşamasında olduğunda, 5 dakika boyunca 300 x g'de topak hücreleri şizont yırtılması ve merozoit işgali izin vermek için bir parazit ortamında heparin içeren ortam ve tekrar süspansiyon çıkarın.
7. 4 saat sonra, başka merozoit istilasını engelleyerek, geri kültürlere 20 IU / ml heparin ekleyin. Not: parazitler yeterince senkronize önce sorbitol ve heparin tedavi birkaç devir gerekli olabilir. % 5 parasitaemia - merozoit uygun numaraları oluşturmak için, 3 de parazit kültürünün 150 ml hazırlamak.

Geç Sahne P. 4. İzolasyonu falciparum trophozoit

1. Otuz altı saat kültürlere heparin döndükten sonra, 5 dakika boyunca 300 xg'de kültürlenmiş hücreler pelet, ve% 25 hematokrit parazit ortam içinde tekrar süspansiyon pelet.
2. Geniş bir manyetik kolonu (6.3 matris hacmi takınmi) bir mıknatıs, ve tüm hava kabarcıkları bertaraf edilmiştir emin, parazit ortamı ile sütun dengeye getirin.
3. Yeniden süspansiyon haline P. ekleme falciparum kültürü, kolona ve saniyede bir damlasına akış hızını ayarlayın.
4. Kültür kolonundan geçtikten sonra akış ile net bitene kadar, parazit ortamı ile sütun yıkayın.
5. 37 ° C parazit ortamında 30 ml kolondan parazitleri Zehir.
6. , Parazitler bir ince bir tabaka hazırlanması 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 3 dakika boyunca Giemsa çözeltisi ile leke. Mikroskop altında slayt inceleyin ve parazitler neredeyse kırmızı kan hücresi, dolgu ve erken şizont dönemlerinde olduğu görünmesini sağlamak. Parazitler, uygun olgunlaşma aşamaya varsa uygun geliştirilmiş kadar,% 1 O _2,% 4 _CO2 ve% 95 _N2 atmosferinde 37 ° C inkübatör saflaştırılmış parazitler döndürür. Not:% 90 daha enfekte kırmızı kan hücrelerinin saflığı R sağlamak için gerekli olanBCs merozoit hazırlıklarını kontamine yok.
7. . 10. mcM E64 6 (epoksisukini-L-ösi (4-ganidino) bütan (E64) ile izole schizontsun davranın - 10 saat NOT: E64 ile uzun inkübasyon süreleri mümkündür, ancak üretilen merozoites artık invaziv olacaktır.

P. 5. Izolasyonu falciparum merozoites

1. E64 ile inkübasyondan sonra,% 100 metanol hücreleri düzeltmek ve zar-kapalı merozoit oluşumunu değerlendirmek için Giemsa çözeltisi ile leke, parazitler smear. NOT: parazitlerin% 50'den daha fazla zar içine merozoitler meydana varsa merozoit iyi bir verim elde edilir.
2. Pellet 8 dakika boyunca 1900 x g'de schizontsun E64-işlemden geçirildi. Kalan insan serumu çıkarmak için RT RPMI-1640 ortamında, 50 ml 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ve 20 ug / ml gentamisin (yıkama ortamının) ile takviye edilmiş (pH 7.4) ile yıkayın .
3. Yıkama ortamının 2 ml pelletini. NOT: THP-1 ortam FCS içeren kullanma filtrasyon sırasında frothing üretecek.
4. 1.2 μm/32 mm şırınga filtresi üzerinden yeniden süspansiyon haline getirilmiş E64-schizontsun 2 ml filtre. Bir 10 ml tüp içinde süzüntüyü toplayın. Not: Süzülen filtresinde un-rüptüre schizontsun ve moloz, merozoitler ve hemozoin kristalleri içerir.
5. Bir mıknatıs, küçük bir manyetik sütun takın ve 500 ul THP-1 ortam ile dengelenmesi.
6. Manyetik sütunu üzerinde filtrat geçirin. Flow-through toplayın. Not: merozoites geçecek ise Hemozoin, kolona bağlanacaktır.
7. Her bir zaman içinde akışı toplamak, hemozoin kaldırmak için sütun iki kez daha fazla akım geçer.
8. Kalan merozoitler toplamak için RT THP-1 ortam 2 ml ile sütun durulayın.
9. 10 ug / ml (son konsantrasyon) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lekesine EtBr ekleyin. Photobleaching önlemek için ışıktan korumak. Not: emin olun hepsi EtBr kirlenmiş sıvı ve pLastic atık sitotoksik kimyasalların uygun bir şekilde bertaraf edilir. Bu merozoitler, inkübasyonu takiben artık invaziv vardır.
10. 10 dakika boyunca 4.000 xg'de merozoites aşağı spin.
11. Uygun bir atık kabı içine süpernatant atın.
12. 4 ml THP-1 ortamında merozoit pelletini ve 10 dakika boyunca 4.000 xg'de aşağı doğru döndürün.
13. 15 ml'lik bir hacme kadar THP-1 orta toplayın ve ışıktan koruyunuz.

Sitometrisi 6. Nicel Merozoit Konsantrasyon

1. Oda sıcaklığına kadar boncuk sayma getirin.
2. Merozoitler seyreltmek için% 0.5 BSA ile PBS hazırlayın.
3. 3 seyreltilerde merozoitler Toplamı; 100'de 1; 1, 50 ve 25 1., Sırasıyla, PBS +% 0.5 BSA içinde 940, 930 ve 910 ul 3 FACS tüpü hazırlayın. Sırasıyla, tüp başına saflaştırılmış merozoit 10, 20 ve 40 ul ekle.
4. 30 saniye vorteksleyin sayma boncuklar, ve sulandırılmış merozoitler içeren FACS tüp başına, boncuk tanelerin 50 ul ekle.
5. Üç sey çalıştırınBir akış usulünde merozoit örnekleri sitometresiyle 488 nm lazer ile donatılmış. Ayrı bir kanal floresan tarafından EtBr ve GFP floresan çift floresan dayalı merozoit ve kapı sayma boncuk için sıkı bir kapı ayarlayın. 2000 boncuk toplanana kadar olayları edinin. Not: Bu talimatlar EtBr ile karşı lekelenmiş olan GFP + merozoites sayma bakın. Sonra yan dağılım ve EtBr floresan dayalı merozoit kapıları ayarlamak parazitleri ifade GFP kullanan değilse.
6. Merozoit oranını belirleyin: 2.000 sayma boncuk olaylar merozoit olayların sayısına bölünmesiyle boncuk, her seyreltme için bir oranını hesaplamak. Tüp başına eklenmiş boncukların 50 ul boncuk sayısını belirlemek için sayma boncuk yığın özelliklerini kullanarak.
7. Seyreltme faktörü ile ve merozoit 50 ul boncuk sayısını çarpın: bu seyreltme faktörü boncuk oranına sahiptir. Bu sayı, ml başına merozoit konsantrasyonuna eşittir. Inci gerçekleştirinHer seyreltme için adımlar ese.
8. Üç eriyiğinin boyunca ölçülen merozoit konsantrasyonları ortalama. 50 yılında 100, 1 1 için belirlenen konsantrasyonları için% 10 aşan standart sapmaları ve 1 25 sulandırmalar sayım numune hazırlamada teknik yanlışlıklar gösterir: NOT.
9. THP-1 hücre başına dört merozoit nihai bir oran sağlamak için, THP-1 ortamı içinde 8 x 10 ⁶ merozoites / ml 'de yeniden süspanse merozoitler. THP-1 oranlarına diğer merozoit kullanılabilir ve buna göre konsantrasyonları modifiye edilmelidir: NOT.

7. Fagositoz Assay

1. 96 U-alt plakaların kuyu başına ısı inaktif FCS 200 ul ekleyin ve plakaları engellemek için RT O / N bırakın. İnkübasyondan sonra, FCS çıkarın ve 200 ul steril PBS ile iki kez kuyu yıkayın. Kullanılana kadar 4 ° C de PBS ve mağaza plakaları çıkarın.
2. 1 x 10 ° numune için triplikat kuyu sağlayan, plazma örnekleri ve kontrol test etmek için gerekli olan THP-1 hücre sayısını hesaplayın ^{5 THP-1 hücreleri, oyuk başına.}
3. Bir hemositometre slayta kültürün 10 ul yükleyerek THP-1 kültür konsantrasyonunu belirleyin. Mikroskop altında haemocytometer 16 köşe kareler 4 set mevcut hücrelerin sayısını sayar ve ardından ortalama sayımları. Ml başına hücre sayısını hesaplamak için 10,000 ile ortalama sayısını çarpın.
4. 5 dakika boyunca 500 xg'de THP-1 hücrelerinin gerekli sayıda Spin ve THP-1 ortamı içinde 6.7 x 10 ⁵ hücre / ml 'de tekrar süspansiyon haline getirin.
5. 10 ⁵ hücre / göz ile sonuçlanan bir FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka için oyuk başına THP-1 ortamı içinde THP-1 hücrelerinin 150 ul ekle. Test edilecek numune başına 3 kuyu hazırlayın. Merozoites eklemek için hazır olana kadar inkübatör için plaka dönüş.
6. De ayrı FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka 8 x 10 ⁶ / ml başına en merozoit hazırlanması 150 ul ekle. Test numune başına bir kuyu hazırlayın
7. T, oyuk başına hazırlanmış seyreltilmiş plazma örnekleri 10 ul ekleo merozoites içeren plaka ve homojen bir çözüm sağlamak için iyice karıştırın.
8. Inkübatör THP-1 plaka çıkarın ve plazma, numune başına üç kopya halindeki gözlerin, iyi THP-1 hücreleri içeren her merozoit / plazma çözeltisi 50 ul ekle.
9. İyice karıştırın ve% 5 _CO2, 40 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Işıktan korumak için folyo ile örtün.
10. 40 dak, 4 ° C'de 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri fagositoz durdurmak için santrifüj önceden soğutulmuş sonra.
11. Süpernatantı, ve buz gibi soğuk PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS tamponu) ile iki kez yıkama hücreleri. Not: EDTA akış sitometri analizi için tek bir hücre süspansiyonu korunmasında kolaylaştıracaktır.
12. PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS sabitleyici) içinde% 2 paraformaldehit (PFA) 90 ul, hücreler. Işıktan korunmalıdır edinimi, kadar buz üzerinde bırakın.

8. Sitometrisi

1. Donanımlı wi akış sitometresiyle örnekleri Edinme488 nm lazer ve yüksek kapasiteli plaka okuyucu eki inci. NOT: Bu bir merozoit hazırlanmasından test edilecek 400 plazma örneklerinde kadar sağlayacaktır. Hücreler, aynı zamanda el ile örnek yükleme için tüplere transfer edilebilir.
2. Ileri ve yan dağılım tarafından Kapısı canlı THP-1 hücreleri.
3. Kontrol 'merozoit ve hiçbir plazma ile THP-1 hücrelerinde' dayalı EtBr olumlu kapıyı ayarlayın.
4. Örnek başına 10.000 olayların en az edinin.

9. Veri Analizi

1. Analiz yazılımı akım sitometri ve EtBr olumlu olaylar için sıkı kapıları ayarlamak kullanarak verileri analiz.
2. Immün olmayan bir plazmadan ile örnek eksi% pozitif hücreler için EtBr + hücrelerin%: Her numune için yüzde fagositoz hesaplayın.
3. Kopyalardaki genelinde ortalama sonuçları. NOT:% 10 aşan bir üçlü için standart sapmalar deneysel yanlışlıklar göstermektedir. Bazı arka EtBr pozitif olaylar merozoi bir sonucu olarak gözlenebilirte THP-1 hücrelerinin yüzeyine yapışma fakat merozoitler içeren tüm numuneler arasında tutarlı olmalıdır. Daha sonra denetim 'THP-1 merozoit ve herhangi bir plazma ile hücreler', ve kontrol 'non-immün plazma ile THP-1 hücre' içinde herhangi bir arka plan çıkarılması göre kapı ayarlama nedeniyle içsel için floresan yansıtan% fagositoz neden olur / Sadece merozoites fagosite.

Sonuçlar

E64 önce tedaviye parazitlerin olgunlaşma aşaması zarla kapalı merozoitler üretilmesi için çok önemlidir. Şekil 1Ai E64 ekleme schizontsun uygun olgunlaşma safhasını göstermektedir. Parazitler büyük olması ve hemen hemen kırmızı kan hücresi doldurmalıdır. Giemsa lekesi bir benekli görünüm merogoni başlamıştır gösterir ve E64 membran kapalı merozoitler (Şekil 1Aii) elde etmek için ilave edilmelidir. E64 aşama parazitleri trophozoite için daha önce ilave edilirse, zar içine merozoites da E64 12 saat sonra oluşturulmaz. Bunun yerine parazitler gibi sindirim vakuol (Şekil 1Bi ve 1Bii) büyümesi gibi anormal morfoloji almak ve merozoites oluşmuş değildir. E64 schizontsun için daha sonra ilave edilirse şizont kopma (Şekil 1CI ve 1Cii) sınır tanımayan olduğu gibi, membran-kapalı merozoites oluşturulmaz. Parazit senkroninin yüksek düzeyde gereklidir, diğeraçıklanan tüm üç sonuçların bilge bir dizi E64 tedaviden sonra görülecektir.

Hemozoin çıkarılması arındırıcı merozoit için başka önemli bir adımdır. Merozoites hemozoin saflaştırılan değildir sonra merozoit-hemozoin kümeleri pipetleme yerinden edilemeyen oluşturur. Bu agrega akış sitometrisi (Şekil 2A) ile eksik merozoit sayımı ile sonuçlanan tek merozoit farklı ileri saçılma ve yan saçılma özellikleri ile de olsa, tek bir olay olarak sitometre üzerinde çalışır. THP-1 hücreleri de hemozoin fagosite gibi, bu merozoit-hemozoin kümeleri de (Şekil 2B) fagosite edilebilir. Birden çok merozoitler içeren olarak bu son derece EtBr floresan gruplar bulunmaktadır. Tek tek merozoit fagositozu için gözlenene bir THP-1 EtBr floresan profil eşdeğer agrega sonuç fagositoz. Hemozoin kaldırılmaz Bu yüzden, eğer, THP-1 hücrelerinin EtBr floresan bir o olacaktest edilen plazma opsonizing potansiyeli verestimate. Hemozoin da önemli ölçüde fagosit işlevi değiştirmek için bildirilmektedir. GFP pozitif merozoites karşı THP-1 hücreleri tarafından fagosite merozoit görselleştirme geliştirmek için EtBr ile boyanır. Bu protokolde tarif edilen koşulları kullanarak, tüm GFP pozitif merozoites parlak bir floresans yoğunluğunu (Şekil 3A) sahiptir EtBr ile karşı edilir. EtBr floresan tarafından fagosite değerlendirme GFP floresan (Şekil 3B) daha merozoit fagositozun üstün çözünürlük sağlar.

Tayin sırasında ilave edilen merozoit sayısı gözlenen fagositoz miktarını modüle edecektir. Bu nedenle, akış sitometrisi ile, doğru sayım kritiktir. Merozoit oranlarını arttırmak: THP-1 plazma yokluğunda THP-1 hücrelerine merozoit artan yapışması (Şekil 4A) neden olur. Merozoit Artan: THP-1 oranları da artan pH ile sonuçlanıragocytosis tepkiler merozoites (Şekil 4B) opsonize olduğunda. 04:01 A merozoit: THP-1 oranı sağlam fagositik yanıtları için tavsiye edilir. Bu oran ve gösterilen plazma dilüsyonu kullanarak, bu deney opsonizing antikor, düşük, orta ve yüksek düzeyde açıklığa kavuşturmaktadır. 0 ila 78 oranında fagositoz tepkileri PNG plazma örnekleri ve tarif edilen diğer koşullar kullanılarak gözlenmiştir. Bu tür tepkilere; son. Şekil 5, PNG bireylerden fagositoz yanıtların 4 kuvartilleri örneklerini gösterir sıtma ¹⁰ için doğal olarak elde edilen klinik bağışıklık ile ilişkilendirmek için gösterilmiştir.

E64 Ayrıca Şekil 1. Zamanlama zara kapalı merozoitler üretilmesi için çok önemlidir. (A) uygun maturatio. E64 olgunlaşmamış parazit eklendiğinde ise n i) E64 önce tedaviye parazitlerin aşaması ve ii) E64 tedavi 6 saat sonra üretilen membran kapalı merozoites (B) zar içine merozoites oluşturulan değildir; i) geç evre trofozoitleri ve E64 geç schizontsun parçalı eklenir ise ii) E64 12 saat sonra, (C) şizont yırtılma inhibe değildir.; i) geç evre schizontsun, ve ii) E64 6 saat sonra. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder.

Şekil 2,. Hemozoin çıkarma hemozoin manyetik merozoit ayrılır edilmiştir. Merozoit-hemozoin agrega membran kapalı merozoit filtrasyonu aşağıdaki biçimde tek hücreli merozoit süspansiyonu oluşturmak için çok önemlidir. (A) merozoit arasında ileri saçılma ve yan saçılma grafikleri ile hemozoin kaldırıldıve hemozoin korudu. (B) Hemozoin-merozoit agrega THP-1 hücreleri tarafından fagosite edilebilir. PNG plazma ile kuluçkaya THP-1 hücrelerinin Diff-Quick lekelenmiş sito-spin slaytlar hemozoin olan veya olmayan merozoit preparatlar opsonize. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder.

Şekil 3,. Etidyum Bromür boyama (A) GFP pozitif merozoit üzerinde gating ile saflaştırılmış merozoit arasında histrogram akış sitometri. D10-GFP saflaştırılmış merozoites floresan yoğunluğunu artırmak için EtBr ile karşıt edilir. Merozoit fagositoz üstün çözünürlük sağlar ve EtBr gösteren bir dot blot Bu kapı GFP pozitif nüfus içinde floresan. (B) GFP karşı İleri dağılma ve GFP ve EtBr ikili floresan merozoit fagositozuyla aşağıdaki THP-1 hücrelerinin EtBr karşı ileri dağılım. Gates, d edildi Rawn merozoit ve herhangi bir plazma kontrolü ile THP-1 hücrelerine göre.

Şekil 4 merozoit:. THP-1 oranı gözlenen fagositoz derecesini etkiler. (A) Beş merozoit: THP-1 oranları tasvir edilmektedir; 50:1, 20:1, 10:01, 04:01, 01:01. Hücreler tek kontrol nedeniyle THP-1 hücreleri arka plan floresan gösterir. . Her bir oranı için, THP-1 EtBr floresan (B) Farklı merozoit için THP-1 hücrelerinin ortalama florasan yoğunluğu PNG plazmanın bir havuzu ile ya da immün olmayan Avustralya plazma ile opsonize merozoit endikedir: THP-1 oranı ve bir havuz ile opsonizasyon PNG plazma veya nonimmun Avustralya plazmanın (ortalama ± SEM) arasında. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 5,. Opsonizing bir antikor büyük bir aralık ölçülebilir. Merozoitler PNG bireylerden plazma ile opsonize ve THP-1 hücreleri ile inkübe edildi. Dört temsilcisi fagositoz tepkileri gösterilmektedir. Gates, merozoit ve hiçbir plazma kontrolü ile THP-1 hücreleri dayalı çizilmiş ve sayılar non-immun plazma kontrolü ile THP-1 hücrelerinin çıkarıldıktan sonra% fagositozunu işaret edildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Merozoit fagositoz ölçmek için, iki teknik uzmanlık gereklidir: merozoit ve THP-1 deneyinde fagositoz saflaştırılması. Bu iki tekniklerini birleştirerek için en kritik adımlar şunlardır: 1) Yüksek senkronize parazitler; 2) zar içine merozoitler vermek üzere, doğru zamanda E64 eklenmesi; 3) agrega önlemek için hemozoin Çıkarma; Akım sitometri 4) Doğru merozoit sayma; 5) kullanılan plazma seyreltme; ve 6) düşük hücre yoğunluğu ve THP-1 hücrelerinin geçiş sayısı elde. Bu önemli yönlerinden dikkatli dikkate sağlam fagositoz tepkileri gözlenir sağlayacaktır.

Burada açıklanan rağmen, fagositoz değerlendirmek için merozoit hazırlanmasıdır, bu teknik geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir. Bağımsız olarak alt akış metodoloji, uygun merozoit preparasyonlar doğru merozoitler üretmek amacıyla E64 ilave zamanlama bağlıdır. Burada açıklanan yöntem E64 y gösterilmiştirişgali olayları ve ilaç duyarlılık deneyleri ^15-20 yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanım için invaziv merozoites ield. Merozoit canlılığı fagositoz için gerekli olmasa da, merozoit yüzey kaplamanın bütünlüğü gereklidir. Bu nedenle, burada açıklanan yöntem E64, yüksek kaliteli merozoites yüzey kaplamak için antikor tepkileri değerlendirilmesi için üretilecek sağlar. E64 çok erken ilave edilir ya da çok geç zar içine merozoites oluşmadığı takdirde, Şekil 1 'de belirtildiği gibi. Bu nedenle, yüksek derecede uyumlu parazit kültürlerinin gerekmektedir. Burada, sıkı için sorbitol ve heparin tedavilerin kullanımı 2 saatlik bir pencerede D10-GFP parazit senkronize kültürleri tarif edilmektedir. Heparin diğer laboratuvar izolatının gametocytogenesis teşvik edebilir ve bu nedenle dikkatle kullanılmalıdır. Örneğin alanin gibi alternatif yöntemler de sıkı bir senkronizasyon senkronize parazitler ²⁹ üretilir kaydıyla, kullanılabilir. E64 uyumsuz parazit ilave edilirse, bir alt pervanezar-kapalı merozoit bir ortion üretilen ve kalan RBC normal kopma veya anormal morfoloji gelişecektir ya parazit bulaşmış olacaktır. Membran kapalı merozoit haline olmayan parazitlerin varlığı filtrenin tıkanması ile sonuçlanabilir ve önemli ölçüde elde merozoit randımanını azaltacaktır.

Zara-kapalı merozoit filtrasyonu sırasında, hemozoin sindirim vakuoller gelen serbest kalır ve çözelti içinde serbest kristaller olarak bulunur. Hemozoin yüksek proenflamatuar ve monosit ve makrofaj fagositoz yanıtları ^{30, 31,} modüle etmek için rapor edilmiştir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, fagositoz modüle ek olarak, çözelti içinde hemozoin merozoit ile agregalar oluşturabilirler. THP-1 hücreleri, bu agrega fagosite gibi, bu antikor aracılı fagositoz çözünürlüğü için önemli bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu nedenle, hemozoin çıkarılması av için bu tahlilde gereklidirphagocyte biyoloji hemozoin arasında oid ek karmaşıklık. Merozoit miktar gerekli olduğu durumda, diğer uygulamalar için serbest merozoitler oluşturmak için bu tekniği kullanarak Buna ek olarak, hemozoin kaldırmak yetmezliği de zararlı olabilir.

Şekil 4 'de belirtildiği gibi, merozoit sayısı, THP-1 hücreleri tarafından fagositoz derecesini etkileyebilir tahlile eklenir. Akım sitometri merozoit konsantrasyon, dikkatli pipetleme ve merozoit sayımlarını çoğaltmak sayımı için izin verse doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Birden çok parazit satır yan yana test edilecek olan, bu özellikle önemlidir. Daha önce yanıtları ²³ çevirmeden önce PNG yarı bağışıklık çocuklardan plazma önemli ölçüde seyreltilebilir olduğu gösterilmiştir. Phagocyt en geniş bir ürün yelpazesi üretilir 12 yaşındaki çocuklar PNG - 5 in bir grup için plazmanın optimum seyreltme (1/120, plazmanın 000 nihai seyreltme) burada tarif. (-% 19, 20 -% 39, 40-59 ve% 60 - 0% 79 fagositoz) Şekil 5'te açıklanan osis tepkiler Bu dizi dört gruba tepkilerin tabakalaşma için izin ve regresyon modelleme opsonizing tepkiler ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur Farklı kohort için klinik hastalığı ve yüksek yoğunluklu bir parazitemya ¹⁰ korunma veya saptama seviyesinin altında doymuş değildir bu THP-1 hücreleri ile fagositozu sağlamak için plazma dilüsyonu ayarlamak gerekli olabilir çalışmaları.

Akım sitometri mikroskobu üzerinde geliştirilmiş doğrulukta hızlı ve ölçülebilir fagositozisi sağlar. Bu protokol, yüksek verimlilik, plaka temelli ve doğal olarak elde edilen humoral bağışıklığı incelemek için, 96 gözlü levhalar yakalanmasını otomatiktir. Yöntem, SYBR @ Green, DAPI ve propidyum iyodin, zar ya da protein lekeleri gibi lekeler bununla birlikte alternatif bir DNA lekeleri yararlanılabilir, etidyum bromür ile merozoit boyanmasını gerektirir. Bu tahlil PRIMAR mükellef olacaktırphagocyte veya FcR biyoloji ilgi ise y monositler ya da nötrofiller ve adapte edilebilir. PMA ile in vitro farklılaşan Birincil hücreler ya da THP-1 hücreleri, sıtma ve diğer patojenlerin ^{12, 32-34} fagositoz incelemek için kullanılabilir. Bu hücrelerin yapışık ve aynı zamanda non-antikor aracılı fagositoz ³⁵ ekran gibi ancak primer hücreler kullanılarak zor olabilir. Buna ek olarak, saflık, canlılığı ve fonksiyonelliği değişkenlik primer fagositik hücrelerin kullanımı için bazı temel sınırlamalar vardır. Merozoit fagositoz dahil Fc reseptörleri uncharacterized kalır ve bu nedenle belirli bir Fc reseptörleri bloke edici antikor fagositoz merozoit için her bir Fc reseptörünün katkısını aydınlatmak olabilir kullanılmıştır. THP-1 fagositoz FcR bağlı olduğu için, bu gözlenen fagositoz basit yorumu sağlar. Bu deney aynı zamanda util ile elde edilebilir opsonizing antikorların antijen özgüllüğü ele için oldukça rahatmerozoit yüzey antijenleri için knock-out parazitleri izing veya yüzey proteinleri merozoit için afinite saflaştırılmış insan antikorları kullanılmıştır. Ayrıca, derinlik merozoit fagositoz aşağıdaki sitokin tepkilerinin çalışmalar yoktur ve bu deneyi kullanılarak elde edilebilir.

Bu iki teknik fonksiyon antimerozoite antikorların çalışma önemli gelişmeler oluşturmaktadır. Yüksek kaliteli merozoit saflaştırılması dondurularak saklanmış merozoitler veya merozoit antijeni ile kaplanmıştır flüoresan mikro küreleri kullanarak avantajlıdır. Bu deney, doğal olarak kazanılmış bağışıklık değerlendirmek için bir araç olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu aşılamaya yanıt olarak bağışıklık kazanılmasını adresleme için önemli bir araç olduğu kanıtlanabilir. Son zamanlarda fagositoz veya opsonised merozoites klinik sıtmadan korunma ile ilişkili olduğu gösterilmiş olsa da, in vivo phagocyto için in vitro THP-1 fagositoz doğrudan bir sonuç çıkarmak mümkün değildirBu analizde fagositoz gibi merozoit arasında sis statik koşullar altında ve kırmızı kan hücrelerinin rekabet yokluğunda meydana gelir. Bu tahlilin potansiyel uyarlamalar, böylece sıtma ve merozoit fagositoz daha iyi anlaşılması için bir çok yönlü bir araç sağlayabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1 cell line	American Type Culture Collection	TIB-202
RPMI-1640	Gibco	31800-089
Fetal Calf Serum (FCS)	Invitrogen	10099-141
2-mercapthoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML	Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x)	Sigma	P0781
HEPES	SAFC	90909C	Cell culture grade
hypoxanthine	Calbiochem	4010
Human Serum	Donation from Autralian Red Cross		Available commercially (i.e. Invitrogen)
sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	1.06329.0500
gentamycin	Pfizer	61022027	Injection Quality
heparin Sodium BP (5000IU/mL)	Pfizer		procine origin
Blasticidin S-hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	50-70-4
E64 Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	E3132-10MG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	98281-100G	Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20	Merck	10383.4G	Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck	1.09204.0500	1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm	Pall Life Sciences	4656
QuadroMACS Separator (for small column)	MACS Miltenyi BioTec	130-091-051	Interchangeable with MidiMACS
VarioMACS Separator (for large columns)	MACS Miltenyi BioTec	130-090-282
MACS MultiStand	MACS Miltenyi BioTec	130-042-303
LS Column (small magnetic column)	MACS Miltenyi BioTec	130-042-401
large magnetic column	MACS Miltenyi BioTec	130-041-305
Ethidium Bromide	Bio-Rad	1510433	Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads	Invitogen	C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader	BD Biopsciences
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software	Tree Star