El cultivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

Resumen

C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.

Resumen

En este protocolo, se presentan los materiales necesarios y el procedimiento para las C modificado. Correos Legans habituación y reproducción de medios (mCeHR). Además, los pasos para exponer y aclimatación C. elegans cultivadas en E. coli para axénicos medios líquidos se describen. Finalmente, los experimentos posteriores que utilizan axénicos C. elegans ilustran los beneficios de este procedimiento. La capacidad de analizar y determinar C. requerimiento de nutrientes elegans fue ilustrado por la creciente N2 gusanos de tipo salvaje en medios líquidos axénicos con concentraciones variables hemo. Este procedimiento puede ser replicado con otros nutrientes para determinar la concentración óptima para el crecimiento y el desarrollo gusano o, para determinar los efectos toxicológicos de los tratamientos farmacológicos. Los efectos de las concentraciones de hemo variadas en el crecimiento de los gusanos de tipo salvaje se determinaron a través de la observación microscópica cualitativa y cuantificando tl número de gusanos que crecieron en cada concentración de hemo. Además, el efecto de las concentraciones de nutrientes variadas puede ensayarse mediante la utilización de gusanos que expresan sensores fluorescentes que responden a los cambios en el nutriente de interés. Además, un gran número de gusanos fueron producidos fácilmente para la generación de transgénicos C. elegans utilizando bombardeo con micropartículas.

Introducción

El nematodo del suelo, el Caenorhabditis elegans, un organismo modelo de gran alcance usada en numerosos estudios de la genética a la toxicología. Como resultado de su tamaño de 1 mm, tiempo de generación rápida de cuatro días facilidad de cultivo, y un gran número de progenie, estos nematodos se han utilizado en un número de genéticos y farmacológicos pantallas ^{1, 2.} Los investigadores se aprovechan de este gusano para identificar moléculas y vías conservadas en sistemas de vertebrados. Estas vías incluyen señales de muerte celular, vías de envejecimiento y el metabolismo, y el sistema nervioso ^3-6. Además, la transparencia de C. elegans permite la generación de líneas transgénicas utilizando los reporteros de proteínas fluorescentes, que se pueden visualizar directamente para analizar los patrones de expresión de genes y localización de la proteína.

En muchos estudios de este nematodo se cultiva en una superficie a base de agar sólido utilizando un medio de crecimiento de nematodos (NGM) placas o en lculturas iquid sembraron con Escherichia coli como una fuente de alimento ^7,8. Estas fuentes alimenticias bacterianas pueden confundir a los estudios bioquímicos y toxicológicos con la interferencia de subproductos bacterianos que afectan a la interpretación de los resultados. Con el fin de evitar estos efectos combinados, C. elegans pueden ser cultivadas en un axénicos medios líquidos que está desprovisto de bacterias como una fuente de alimento. El uso de este medio de comunicación, cultivadas con éxito a millones de gusanos altamente sincronizados para muchos estándar C. protocolos elegans, incluyendo el análisis de microarrays de genes regulados diferencialmente en C. elegans expuesto a diferentes concentraciones de hemo, y la producción de gusanos transgénicos utilizando bombardeo de genes. Este medio se define y se modifica a partir de una receta original formulado por el Dr. Eric Clegg ⁹ químicamente. El uso de este medio de comunicación mCeHR, hemos logrado identificar genes implicados en la homeostasis del heme, referido a los genes como hemo sensibles (hrg s) ^10, lo que haríano habría sido posible en condiciones de crecimiento normales que utilizan placas de agar NGM sembradas con E. coli.

En este protocolo se describe el procedimiento para la introducción y el mantenimiento de C. elegans cultivadas en E. coli para la axénicos mCeHR y utilizar este método para obtener un gran número de gusanos para la producción de transgénicos C. líneas elegans utilizando bombardeo con micropartículas. Nosotros también presentan estudios que muestran la utilidad de usar medios axénicos para determinar las necesidades nutricionales de C. elegans usando hemo como un ejemplo. Estos estudios muestran que el uso de los medios de comunicación mCeHR permite para el crecimiento rápido de un gran número de C. elegans para muchas aplicaciones posteriores utilizados por los investigadores del gusano.

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Protocolo

1. Las cepas de gusano

1. Obtener C. elegans de tipo salvaje cepas Bristol N2 desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) y mantenerlos en NGM placas sembradas con E. coli cepa OP50 ^7. Nota: gusano transgénico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados fueron generados a lo descrito previamente ^11. IQ6011 puede ser solicitado al autor correspondiente.

2. Preparación de modificación C. elegans Habitation y Reproducción Medio (mCeHR)

Preparar medios líquidos mCeHR como se describe a continuación ^12. Este medio líquido axénico permite que los gusanos crecen sin fuentes de alimentos adicionales. Llevar a cabo todas las manipulaciones de los medios líquidos axénicos y axénicos gusanos utilizando condiciones estrictamente estériles tales como una campana de flujo laminar.

1. Obtener la leche ultra-pasteurizada descremada en una tienda de comestibles. Utilice el pro refrigeradaconducto y no el producto temperatura ambiente. Antes del uso en mCeHR medio, veta la leche en infusión cerebro corazón (BHI) placas de agar y se incuban durante 3 días a 30 ° C y 37 ° C para comprobar la esterilidad. Transferir la leche a 50 ml tubos estériles y se almacena a -80 ° C
2. Preparar cada uno de los siguientes componentes y se combinan en el orden y cantidades dadas para preparar 1 l de mCeHR (Tabla 1A): 10 ml de 2 mM de colina, citrato diácido 10 ml de vitamina y mezcla del factor de crecimiento (véase la receta en la Tabla 1B), 10 ml de 2,4 mM de myo-inositol, 10 ml de cloruro de hemina 2 mM, 250 ml de agua desionizada. Aplicar y filtro de succión a través de una unidad de filtro de 0,22 micras.
3. Añadir 20 ml de la mezcla de ácido nucleico (receta en la Tabla 1C), 100 ml de mezcla de minerales (receta en la Tabla 1D), 20 ml de 170 mg / ml de hidrolizado de lactoalbúmina, 20 ml de aminoácidos esenciales, 10 ml de aminoácidos no esenciales ácidos, 20 ml de 450 mM KH ₂ PO _4,50 ml de 1,45 M de D-glucosa, 10 ml de 1 M de HEPES, sal de sodio, 250 ml de agua desionizada.
4. Aplicar el vacío para filtrar esterilizar los componentes. Quite el filtro y añadir 1 ml de 5 mg / ml de colesterol. Asegúrese de que el pH de los medios de comunicación es de aproximadamente 6-6,5. Nota: Esta solución puede ser almacenada a -80 ° C durante hasta un año.
5. Añadir 20% (v / v) de ultra pasteurizada leche descremada orgánica al medio de mCeHR antes de su uso. Utilice una técnica escrupulosamente estéril (por ejemplo en una campana de flujo laminar) al abrir y alícuotas de la leche. Almacene el papel a 4 ° C.

3. Preparar C. elegans para la Cultura en axénico mCeHR Liquid Media

1. Crecer gusanos en diez de 60 mm NGM placas hasta que no haya muchos gusanos grávidas y una cantidad mínima de OP50 E. coli en las placas.
2. Eliminar los gusanos de cada placa por lavado con 5 ml de tampón M9 (receta en la Tabla 1F), y combinar en un tubo cónico de 50 ml.
3. Permitir a los gusanos a settle dejando el tubo en reposo durante 5 a 10 minutos y luego retirar con cuidado el sobrenadante que contiene la E. coli.
4. Repita los pasos 3.2 y 3.3 2x para eliminar la mayor cantidad de las bacterias residuales como sea posible antes de continuar el procedimiento.
5. Resuspender los gusanos en 0,1 N de NaCl en un volumen que es un múltiplo de tres, por ejemplo en el que los gusanos individuales pueden verse 1,5 ml, 3 ml o 6 ml en el tubo.
6. Lejía los gusanos mediante la adición de NaOH 5 N y 5% de hipoclorito de sodio solución (lejía) en una relación de 01:02:06 a la suspensión gusano. Por ejemplo, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml de 5% de hipoclorito de sodio: 6 ml de la suspensión gusano. Mezclar el NaOH y lejía antes de añadir a la suspensión gusano.
7. Vortex la solución vigorosamente hasta que los gusanos grávidas se disuelven y sólo los huevos son visibles dentro de la suspensión (aproximadamente 5 a 10 minutos). Supervisar el proceso utilizando un microscopio de contraste de fases con un objetivo de 10X.
8. Después de que los gusanos se han disuelto completamente, pellets de inmediato lahuevos a 800 xg durante 45 segundos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con 10 ml de agua estéril centrifugando el pellet a 800 xg durante 45 segundos a 4 ° C.
9. Después del blanqueo, transferir el sedimento de huevo a un matraz de cultivo de tejido de 25 cm ² que contiene 10 ml de medio mCeHR suplementadas con 100 g / ml de tetraciclina. Estas operaciones se realizarán utilizando técnicas estériles. Si lo desea, agregue los antibióticos adicionales, incluyendo 250 ácido nalidíxico mg / ml, para prevenir el crecimiento bacteriano en los cultivos líquidos axénicos.
10. Incubar los cultivos líquidos a 20 ° C en una incubadora de agitación a aproximadamente 70 rpm.
11. Compruebe los gusanos todos los días para observar el grado de desarrollo y la tasa de crecimiento.
    Nota: Worms inicialmente crecen lentamente y requieren de 7 a 10 días en estar grávido. Sin embargo, como los gusanos aclimatan al medio líquido el tiempo de generación se reducirá a aproximadamente 4 días de tipo salvaje (N2) gusanos.
12. Después de que los gusanos tienen devellado a la etapa grávido en medios líquidos, transferir la cultura gusano a un tubo cónico y sedimentar los gusanos a 800 xg durante 5 min a 4 ° C usando un rotor de cubeta oscilante.
13. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente gusano en un volumen igual de 0,1 M de NaCl. Por ejemplo, utilizar 10 ml de NaCl 0,1 M para los gusanos cultivadas en 10 ml de mCeHR. Permita que los gusanos se asienten durante 5 minutos en hielo.
14. Llevar a cabo el procedimiento de blanqueamiento como se describió anteriormente en los pasos 3.5 a 3.8, y permitir que los gusanos crezcan para una segunda generación en los medios líquidos axénicos. Si es necesario, añadir el antibiótico de nuevo para inhibir el crecimiento bacteriano.
15. Una vez más permiten a los gusanos a continuación, se convierten en grávido sedimentar y resuspender los gusanos en NaCl 0,1 M como se describe en los pasos 3,12 y 3,13, a continuación, blanquear de nuevo como se describe en los pasos 3.5 a 3.8, para producir una población sincronizada. Crecer a los gusanos de larva L1 en medios líquidos sin antibióticos a partir de ahora.

4. Sincronización de Worms de líquidoCultura

1. Pellets y resuspender los gusanos en NaCl 0,1 M como se describe anteriormente en las etapas 3.12 y 3.13. Bleach como se describe anteriormente en las etapas 3.5 a 3.8.
2. Resuspender el precipitado huevo en 10 ml de tampón M9 y permitir que las larvas eclosionan O / N a 20 ° C en un agitador de plataforma giratoria. Nota: Los huevos eclosionan en larvas L1, pero no van a desarrollar aún más, la sincronización de los gusanos en la fase L1.
3. Mantener y gusanos subcultura, pellet L1 larvas a 800 xg durante 5 min, y luego volver a suspender las larvas en 10 ml de mCeHR y la transferencia a un matraz de 25 cm ^2. Permita que los gusanos crecer a 20 ° C en una plataforma giratoria. Mantener una densidad máxima de 3.000 gusanos / ml / cm ² para asegurar una nutrición adecuada para los gusanos.
   Nota: En esta etapa, los antibióticos no son necesarios para mantener las condiciones axénicas cuando los procedimientos se llevaron a cabo utilizando técnicas estériles en una campana de flujo laminar. Worms se inspeccionarán diariamente para controlar el crecimiento.

5. Gratuitozing y descongelación Worms para cultivos axénicos mediano

1. Congele culturas gusano asíncronos axénicos o larvas L1 sincronizada en nitrógeno líquido. Gusanos de pellets a 800 xg durante 5 min y después se resuspenden en tampón de S (6,45 mM KHPO _4, 43,55 mM KHPO _4, NaCl 146,25 mM) utilizando 0,5 ml para cada vial. Añadir un volumen igual de tampón de S con 30% v / v de glicerol a cada vial y transferir los gusanos a -80 ° C antes del almacenamiento a largo plazo en N2 _líquido. Congele aproximadamente 1 x 10 ⁶ gusanos por ml en cada vial.
2. Descongele gusanos incubando los viales a 37 º C durante aproximadamente 2 minutos hasta que casi todo el hielo se derrita. En una campana de flujo laminar, la transferencia de los gusanos a un frasco estéril que contiene mCeHR y colocarlos a 20 ° C.

6. Determinar el efecto de Hemin La concentración en el crecimiento y la reproducción mCeHR

1. Utilice los medios mCeHR axénicos para ensayar crecimiento dependiente de nutrientes de C. elegans. Para determinar el efecto Oconcentración hemina f en el crecimiento y el desarrollo del gusano, utilice sincronizado gusanos N2 axénicos u otras cepas de interés. Sincronizar larvas L1 como se describió anteriormente en la sección 4.
2. Al día siguiente, pellet y contar las larvas L1 sincronizada y diluir a 1 lombriz al l de medios axénicos. Hacer cloruro de hemina 10 mM en 0,3 M de NH ₄ OH y ajustar el pH a 8 usando HCl concentrado.
3. Añadir 800 l de los medios de comunicación mCeHR a una placa de 24 pocillos. Añadir 100 gusanos a cada pocillo en 100 l de medios de comunicación. Añadir cloruro de hemina a cada pocillo en concentraciones que van desde 0 M, 1,5 M a 1,000 M en triplicado. Asegúrese de que todos los pozos contienen la misma concentración de 0,3 M NH ₄ OH. Resuspendió suavemente los gusanos antes de pipetear para asegurar que 100 larvas L1 se añaden a cada pocillo.
4. Examine los gusanos diario y anote el crecimiento de cada concentración en cada pocillo. Cuente el número de gusanos después de 9 días de incubación y trazar el número de gusanos / ml correspondientes a cada grupo hemoconcentración (Figura 1).

7. Efecto de la Concentración La hemina en hemo gusanos de sensores

1. Incubar gusanos sensor heme L1 sincronizados (Phrg-1 :: GFP) en mCeHR contienen 4 M, 8 M, 10 M y 20 M hemina.
2. Imagen de los gusanos mediante microscopía confocal de fluorescencia, 48 h después de la incubación (Figura 2).

8. Utilizando mCeHR para generar transgénico C. elegans Uso de bombardeo de micropartículas

Nota: El procedimiento para la generación y ejecución de bombardeo con micropartículas utilizando gusanos crecen en mCeHR UNC-119 (ed3) se indica en la figura 3 ^13.

1. Preparación Worm
   1. Transferir aproximadamente 1 x 10 ⁶ UNC-119 (ed3) gusanos asíncronos en 90 ml de medio mCeHR en un 175 cm ² frasco de una semana antes de los bombardeos. Permita que los gusanos crecer a 20 ° C ona plataforma de agitación a ~ 70 rpm (Figura 3-1).
      Nota: Una semana más tarde, la densidad gusano debe ser significativamente mayor con muchos gusanos adultos grávidas. Se requerirán aproximadamente 3 x 10 ⁷ gusanos de bombardeo con micropartículas.
   2. Chill JM109 E. coli sembró 10 cm NGM placas de hielo.
   3. Transfiera los gusanos axénicos de dos tubos de 50 ml cónicos y centrifugar los gusanos a 800 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender los gusanos en cada tubo en 50 ml de tampón M9 (Figura 3-2).
   4. Permita que los gusanos adultos para sedimentar por gravedad durante 10 a 15 min en hielo.
      Nota: El pellet 2 ml debe contener ahora> 90% gusanos adultos. Este pellet 2 ml debe tener aproximadamente 5 x 10 ⁶ gusanos y es suficiente para un bombardeo de micropartículas.
   5. Escudo toda la superficie de la placa refrigerada JM109 sembró NGM con el sedimento de 2 ml de gusanos. Deje que el líquido se absorba completamente a continuación, dejar la placadurante 30 min en hielo antes de proceder (Figura 3-3).
2. Preparación de partículas de oro
   1. Pesar 30 mg de partículas de oro en un tubo de microcentrífuga siliconado. Añadir 1 ml de 70% de etanol y agitar el tubo durante 5 min.
   2. Deje que el tubo repose durante 15 min y centrifugar a 6000 xg durante 10 segundos para que sedimenten las partículas de oro. Eliminar el sobrenadante usando una punta de pipeta tocando cuidadosamente la punta al lado del tubo opuesta a las partículas de oro.
   3. Se lavan las partículas de oro con 1 ml de agua estéril, de vórtice durante 1 min y centrifugar brevemente el tubo a 6000 xg durante 10 seg. Repetir la etapa de lavado dos veces, a continuación, volver a suspender las partículas de oro en 0,5 ml de 50% de glicerol estéril.
      Nota: La concentración final de las partículas de oro será de 60 mg / ml y se puede almacenar durante 1 a 2 meses a 4 ° C.
3. Preparar la mezcla de partículas de ADN-oro
   1. Combinar 10 g del ADN del plásmido deseado con 10 y# 956; g del plásmido de rescate unc-119 en un tubo de silicona de 1.5 ml. Añadir 50 l de agua DI y 100 l de solución de partículas de oro bien resuspendido a continuación vórtice durante 1 min.
   2. Añadir 150 l de _CaCl2 2,5 M y agitar de nuevo la solución durante 1 min. A esta solución, añadir 60 l de espermidina 0,1 M y agitar durante 3 a 5 min.
   3. Pulso centrifugar la solución a 6.000 xg durante 10 segundos, retire el sobrenadante y añadir 300 l de etanol al 70%. Así Vortex durante 1 min, centrifugar pulso a 6.000 xg, eliminar el sobrenadante y resuspender en 170 l de etanol al 100%. Vigorosamente agite la solución durante 5 a 10 min y después se pulso de centrífuga y separar el sobrenadante.
4. Bombardeo (Figura 3-3)
   Nota: Este protocolo se realiza con el sistema de suministro de partícula especificado en la Tabla de Materiales / Equipos. Siga las instrucciones para el instrumento de administración de partículas disponible.
   1. Coloque una hoja de papel de seda en una placa de 15 cm. Usando las pinzas, sumerja siete macrotransportadores individualmente en etanol al 100% y las ponen sobre el tejido se seque.
   2. Limpiar a fondo la cámara biolistic, titular macroportador y placa objetivo con etanol al 70%. Limpie y esterilice en autoclave las pantallas de parada antes de cada procedimiento de bombardeo.
   3. Cargue los macrocarrriers en el soporte utilizando pinzas y pulse en el soporte con la función de estar.
   4. Esparza de forma uniforme 20 l de las partículas de oro recubiertas de ADN en el centro de cada macroportador y luego dejar que la solución se seque por completo.
   5. Limpiar las dos partes del divisor de presión con etanol y montar con discos de ruptura de etanol limpiado. Atornille el divisor de presión montado y discos de ruptura en la cámara de bombardeo.
   6. Montar una pantalla de detención en autoclave con el titular macroportador y colocar el aparato en el estante de metal requerida y de bloqueo en su lugar.
   7. Inserte la macr ensambladoocarrier aparato en la cámara de biolística en la ranura asignada por debajo del divisor de presión y alinearse con el divisor de presión.
   8. Pegue la placa de NGM abierto con los gusanos en el estante de placa de puntería y cierre la puerta de la cámara.
   9. Para bombardear gusanos, ajustar la presión a la que se necesita para romper los discos de ruptura. Encienda el vacío a 28 pulgadas de Hg de presión, a continuación, pulse el botón de disparo hasta que los discos de ruptura.
   10. Cortar el vacío y retire la placa de NGM del aparato. Lavar los gusanos de la placa y redistribuir en veinte placas de 10 cm NGM sembradas con E. JM109 coli (Figura 3-4).
   11. Permita que los gusanos crezcan durante 10 a 14 días a 25 ° C y se mueren de hambre los platos. Worms rescatadas del defecto unc-119 tendrán un movimiento normal y pueden ser identificados en este momento. Elija al menos 10 gusanos "de tipo salvaje" de platos separados para su posterior análisis ya que representan las líneas transgénicas independientes (Figure 3-5).

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Resultados

El cultivo de C. elegans en axénicos ayudas medio líquido en la determinación de los nutrientes que son requeridos por los gusanos, sin la interferencia de los metabolitos secundarios producidos por E. coli. Gusanos Wildtype N2 aclimatarse a los medios mCeHR plazo de tres generaciones y muestran un crecimiento similar a los gusanos que crecen en placas bacterianas NGM. De hecho, estos gusanos se convierten en hembras grávidas dentro de 4 días, en comparación con 3,5 días para los gusanos crecen ...

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Discusión

En este protocolo se presenta un mCeHR modificado axénico medios líquidos que permite un rápido C. generación elegans con la producción de un gran número de gusanos. Este medio presenta diversas ventajas como los gusanos se cultivan sin contaminar E. coli o subproductos bacterianos y pueden ser explotados en los estudios nutricionales y toxicológicos. El uso de E. coli u otras bacterias en estos estudios tiene varios inconvenientes. Por ejemplo, el crecimiento de las bacterias ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MgCl2•6H2O	Sigma	M-2393
Sodium citrate	Sigma	S-4641
Potassium citrate monohydrate	Sigma	P-1722
CuCl2•2H2O	Fisher	C455-500
MnCl2•4H2O	Fisher	M87-100
ZnCl2	Sigma	Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O	Sigma	F-1018
CaCl2•2H2O	Fisher	C70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt	Sigma	A-1752
Cytidine 5 -phosphate	Sigma	C-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphate	Sigma	G-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium salt	Sigma	U-6375
Thymine	Sigma	T0376
N-Acetylglucosamine	Sigma	A3286
DL-Alanine	Fisher	S25648
p-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878
Biotin	Sigma	B-4639
Cyanocobalamine (B-12)	Sigma	V-2876
Folinate (Ca)	Sigma	F-7878
Niacin	Sigma	N-0761
Niacinamide	Sigma	N-3376
Pantetheine	Sigma	P-2125
Pantothenate (Ca)	Sigma	P-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)	ACRCS	21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphate	Sigma	P-3657
Pyridoxamine 2HCl	Sigma	P-9158
Pyridoxine HCl	Sigma	P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na)	Sigma	R-7774
Thiamine HCl	Sigma	T-1270
DL-6,8-Thioctic Acid	Sigma	T-1395
KH2PO4	Sigma	P-5379
Choline di-acid citrate	Sigma	C-2004
myo-Inositol	Sigma	I-5125
D-Glucose	Sigma	G-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysate	Sigma	L-9010
Brain Heart Infusion	BD	211065
Hemin chloride	Frontier Scientific	H651-9
HEPES, sodium salt	Sigma	H-3784
Cholesterol	J.T. Baker	F676-05
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140-076
MEM Amino Acids Solution	Invitrogen	11130-051
Nalidixic acid sodium salt	Sigma	N4382
Tetracycline Hydrochloride	MP Biomedicals	2194542
Biolistic Delivery System	BioRad	165-2257
Gold particles (Au Powder)	Ferro Electronic Material Systems	6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μm	BioRad	165-2263