Культивирование<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em &gt; В аксенными жидких сред и создания трансгенных червей бомбардировки микрочастицами

Резюме

C. Элеганс обычно выращивают на твердых пластин агара или в жидких культурах затравку Е. палочка. Для предотвращения бактериальных побочных продуктов от оправдав токсикологические и пищевые исследования, мы использовали в аксенными жидкую среду, CeHR, расти и синхронизировать большое количество червей для целого ряда последующих применений.

Аннотация

В этом протоколе, мы представляем необходимые материалы, а также порядок внесения модифицированный C. Электронные legans Привыкание и репродукции СМИ (mCeHR). Кроме того, шаги для выявления и акклиматизации C. Элеганс, выращенные на Е. палочка для аксенными жидких сред описаны. Наконец, ниже по течению эксперименты, которые используют аксенными C. Элеганс иллюстрации преимуществ этой процедуры. Умение анализировать и определять C. потребность организма Элеганс было проиллюстрировано растет N2 червей дикого типа в аксенными жидких сред с различными концентрациями гема. Эта процедура может быть воспроизведена с другими питательными веществами для определения оптимальной концентрации для роста и развития червячной или, для определения токсикологических эффектов лекарственной терапии. Эффекты различных концентраций гема на рост червей дикого типа были определены посредством качественного микроскопического наблюдения и путем количественного тон количество червей, которые росли в каждой концентрации гема. Кроме того, эффект от различных концентраций питательных веществ могут быть проанализированы с использованием червей, которые выражают флуоресцентные датчики, которые реагируют на изменения в питательных интересов. Кроме того, большое количество червей были легко получены для получения трансгенных C. Элеганс с использованием бомбардировки микрочастицами.

Введение

Нематода почвы, Caenorhabditis Элеганс, является мощным модельным организмом используется в многочисленных исследованиях от генетики к токсикологии. В результате такого размера 1 мм, время быстрой генерации четырех дней, легкости культивирования, и большое количество потомства, эти нематоды были использованы в ряде генетических и фармакологических экранов ^{1, 2.} Исследователи воспользоваться этим червем для идентификации молекул и пути консервативные позвоночных систем. Эти пути включают клеточной гибели сигналы, пути старения и метаболизма и нервную систему ^3-6. Кроме того, прозрачность C. Элеганс позволяет для генерации трансгенных линиях с использованием флуоресцентного белка журналистам, которые могут быть непосредственно визуализировать проанализировать паттерны экспрессии генов и локализации белков.

Во многих исследованиях это нематода культивируют на твердой основе агара поверхности с помощью нематод роста среды (NGM) пластины или в лiquid культуры засевают кишечной палочки в качестве источника пищи ^7,8. Эти бактериальные источники питания может поставить в тупик биохимические и токсикологических исследований с помехами от бактериальной побочных продуктов, влияющих на интерпретацию результатов. Для того чтобы избежать этих рецептуры эффекты, С. Элеганс можно культивировать в аксенными жидких, лишена бактерий как источника пищи. Использование этого носителя, мы успешно культивировали миллионы высоко синхронизированных червей для многих стандартных С. протоколы Элеганс включая микрочипов анализа дифференциально регулируемых генов в С. Элеганс воздействию различных концентраций гема, и производство трансгенных червей, использующих генную бомбардировку. Это СМИ химического состава и редактировался оригинальной рецептуре, сформулированной доктора Эрика Клегг ^9. С помощью этого mCeHR носители, мы успешно идентифицированы гены, участвующие в гема гомеостаза, называют гем реагирующих генов (HRG ы) ^10, который будетне удалось в обычных условиях роста, которые используют NGM агаром высевают с Е. палочка.

В этом протоколе описываются порядок введения и поддержания C. Элеганс, выращенные на Е. палочка с аксенными mCeHR и использовать этот метод, чтобы получить большое количество червей для получения трансгенного организма C. Элеганс линий с использованием бомбардировки микрочастицами. Мы также представляем исследования, которые показывают целесообразность использования аксенными СМИ для определения питательную требование С. Элеганс используя гем в качестве примера. Эти исследования показали, что использование mCeHR носитель позволяет для быстрого роста большого количества С. Элеганс для многих последующих применений, используемых червячных исследователей.

протокол

1. Worm Штаммы

1. Получить C. Элеганс дикого типа штаммов Бристоль N2 от генетики Центра Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) и поддерживать их на NGM пластин затравку Е. Штамм OP50 ^7. Примечание: Трансгенные червь штаммы IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) используется получали, как описано ранее ^11. IQ6011 можно запросить из соответствующего автора.

2. Подготовка модифицированной С. Элеганс жилья и воспроизводство Средний (mCeHR)

Подготовка жидких сред mCeHR, как описано ниже ^12. Это стерильный жидкие среды позволяет черви расти без каких-либо дополнительных источников питания. Выполняйте все манипуляции аксенными жидких сред и аксенными червей, использующих строго стерильных условиях, таких как капот ламинарного потока.

1. Получить ультра пастеризованное обезжиренное молоко от продуктового магазина. Используйте охлажденный профиканал, а не в комнате температура продукта. Перед использованием в mCeHR среды, полоса молоко на Brain Heart Infusion (BHI) агар пластин и выдержать в течение 3-х дней при температуре 30 ° С и 37 ° С, чтобы проверить на стерильность. Перенести молоко до 50 мл в стерильные пробирки и хранят при температуре -80 ° C
2. Подготовка каждого из следующих компонентов и объединить в порядке и размерах, приведенных подготовить 1 л mCeHR (Таблица 1A): 10 мл 2 мМ холина дикислотного цитрата, 10 мл витамина и фактора роста смеси (см. рецепт в таблице 1В), 10 мл 2,4 мМ мио-инозита, 10 мл 2 мМ хлорида гемин, 250 мл деионизированной воды. Применение всасывание и фильтруют через блок фильтра 0,22 мкм.
3. Добавить 20 мл смеси нуклеиновых кислот (рецепт в таблице 1С), 100 мл минеральной смеси (рецепт в таблице 1D), 20 мл 170 мг / мл лактальбумин гидролизат, 20 мл незаменимых аминокислот, 10 мл неэссенциальных кислоты, 20 мл 450 мм KH ₂ PO _4,50 мл 1,45 М D-глюкозы, 10 мл 1 М HEPES, соль натрия, 250 мл деионизированной воды.
4. Применение всасывания для фильтрации стерилизации компонентов. Снимите фильтр и добавить 1 мл 5 мг / мл холестерина. Убедитесь, что рН СМИ составляет около 6-6,5. Примечание: Это решение может храниться при температуре -80 ° С в течение до одного года.
5. Добавить 20% (объем / объем) ультра пастеризованное органический обезжиренного молока к среде mCeHR перед использованием. Используйте скрупулезно стерильной техники (например в ламинаре) при открытии и аликвоты молоко. Храните носители при 4 ° С.

3. Подготовьте C. Элеганс по культуре в аксенными mCeHR жидкой среде

1. Расти червей на десять 60 мм NGM пластин, пока не много беременные червей и минимальное количество OP50 Е. палочка на пластинах.
2. Удалить червей от каждой пластины промывкой 5 мл M9 буфера (рецепт в таблице 1F), и объединить в 50 мл коническую трубку.
3. Разрешить червей в сЭттле, оставив трубку стоять в течение от 5 до 10 мин, затем тщательно удалите супернатант, содержащий E. палочка.
4. Повторите шаги 3.2 и 3.3 2x, чтобы удалить как можно больше остаточных бактерий, насколько это возможно, прежде чем продолжить процедуру.
5. Ресуспендируют червей в 0,1 N NaCl в объеме, который является кратным трем, например 1,5 мл, 3 мл или 6 мл, в которой отдельные червей можно увидеть в трубке.
6. Bleach червей добавлением 5 N NaOH и 5% гипохлорита натрия (отбеливатель) решение в соотношении 1:02:06 на червя подвески. Например, 1 мл 5 N NaOH: 2 мл 5% гипохлорита натрия: 6 мл червячного суспензии. Перед добавлением в червя подвески Смешайте NaOH и отбеливатель.
7. Vortex раствор энергично, пока беременной червей не растворяются и только яйца могут видеть в суспензии (приблизительно от 5 до 10 мин). Контролировать процесс использования контрастного микроскопа фаз с целью 10X.
8. После того, как черви полностью растворяется, сразу осажденияяйца при 800 мкг в течение 45 секунд при 4 ° С. Удалить супернатант и промыть осадок дважды с 10 мл стерильной воды путем центрифугирования осадок при 800 х г в течение 45 сек при 4 ° С.
9. После отбеливания, передавать яйцо осадок в колбу с тканевой культурой 25 см ^2, содержащую 10 мл mCeHR среде с 100 мкг / мл тетрациклина. Выполните эту процедуру, используя стерильные методы. При желании добавить дополнительные антибиотики, в том числе 250 мкг / мл налидиксовой кислоты, чтобы предотвратить бактериальный рост в стерильный жидких культур.
10. Инкубируйте суспензионных культур при 20 ° С на качалке инкубаторе при примерно 70 оборотов в минуту.
11. Проверьте червей ежедневно отметить стадию развития и темпы роста.
    Примечание: черви первоначально растут медленно и требуют от 7 до 10 дней, чтобы стать беременной. Однако, как черви акклиматизироваться к жидкой среде время генерации снизится до приблизительно 4 дней для дикого типа (N2) червей.
12. После того, как черви развивприпрыжку к беременной стадии в жидких средах, передача червь культуры в коническую пробирку и осаждения червей при 800 х г в течение 5 мин при 4 ° С с использованием ротора Бакет.
13. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют осадок в червь равным объемом 0,1 М NaCl. Например, можно использовать 10 мл 0,1 М NaCl червей культивировали в 10 мл mCeHR. Разрешить черви урегулировать в течение 5 мин на льду.
14. Выполните процедуру отбеливания, как описано выше с шагом 3.5-3.8, и позволяют черви расти в течение второго поколения в аксенными жидких средах. При необходимости добавить антибиотик снова подавлять рост бактерий.
15. Опять позволяют черви стать беременной затем осаждения и ресуспендируйте червей в 0,1 М NaCl как описано в шагах 3,12 и 3,13, то отбелить снова, как описано в шагах 3.5-3.8, для получения синхронизированного населения. Расти L1 личинок червей в жидких средах без антибиотиков с этого момента.

4. Синхронизация Черви от жидкостиКультура

1. Гранулы и ресуспендируют червей в 0,1 М NaCl, как описано выше с шагом 3,12 и 3,13. Отбеливатель, как описано выше в пунктах 3.5-3.8.
2. Ресуспендируют яйцо осадок в 10 мл M9 буфера и позволяют личинки вылупляются O / N при 20 ° С на вращающейся платформе шейкере. Примечание: Яйца вылупляются L1 личинок, но не будет развиваться дальше, синхронизации червей на стадии L1.
3. Для поддержания и субкультура черви, осадок L1 личинки при 800 мкг в течение 5 мин, затем ресуспендируют личинок в 10 мл mCeHR и перевода к 25 см ² колбы. Разрешить черви расти при 20 ° С на вращающейся платформе. Поддерживайте максимальную плотность 3000 червей / мл / см ^2, чтобы обеспечить адекватное питание для червей.
   Примечание: На данном этапе, антибиотики не требуются для поддержания аксенными условия, когда процедуры проводятся с использованием стерильных методов в ламинаре. Черви нужно проверять ежедневно контролировать рост.

5. БесплатныйЗин и оттаивания Черви для аксенными среднего культур

1. Замораживание аксенными асинхронных культур червь или синхронизированного L1 личинок в жидком азоте. Гранул червей при 800 х г в течение 5 мин, затем ресуспендируют в буфере S (6,45 мМ KHPO _4, 43,55 мМ KHPO _4, 146,25 мМ NaCl) с использованием 0,5 мл в каждую пробирку. Добавить равный объем S буфере с 30% об / об глицерине в каждый флакон и передавать червей до -80 ° C до длительного хранения в жидком N _2. Заморозить примерно 1 х 10 ⁶ червей на мл в каждом флаконе.
2. Разморозить червей путем инкубации пробирки при 37 ° С в течение примерно 2 мин, пока почти весь лед не растает. В ламинаре, передать червей в стерильную колбу, содержащую mCeHR и разместить их при 20 ° С.

6. Определения действия гемина концентрация на рост и размножение в mCeHR

1. Используйте аксенными СМИ mCeHR для анализа питательных веществ в зависимости рост C. Элеганс. Чтобы определить эффект п.Концентрация гемин е на рост червя и развитие, использование синхронизированы аксенными червей N2 или другие штаммы интерес. Синхронизация L1 личинок, как описано выше в разделе 4.
2. На следующий день, гранул и рассчитывать синхронизированный L1 личинок и разбавляют до 1 червя за мкл аксенными СМИ. Сделать 10 мМ хлорида гемина в 0,3 М NH ₄ OH и доведения рН до 8, используя концентрированную HCl.
3. Добавить 800 мкл mCeHR массовой информации в 24-луночный планшет. Добавить 100 червей в каждую лунку в 100 мкл среды. Добавл ют Hemin в каждую лунку в концентрации от 0 мкМ, 1,5 мкМ до 1000 мкМ в трех экземплярах. Убедитесь, что все скважины содержат ту же концентрацию 0,3 М NH ₄ OH. Осторожно ресуспендировали червей перед отбором, чтобы гарантировать, что 100 L1 личинки добавляли в каждую лунку.
4. Ежедневно Изучите червей и обратите внимание на рост в каждой концентрации в каждую лунку. Подсчитайте количество червей после 9 дней инкубации и построить ряд червей / мл, соответствующих каждому гемаконцентрация (рис. 1).

7. Влияние гемина Концентрация на гем-зонд Worms

1. Выдержите синхронизированные L1 червей датчиков гема (Phrg-1 :: GFP) в mCeHR содержащие 4 мкм, 8 мкм, 10 мкм и 20 мкм гемин.
2. Image черви, использующие флуоресценции конфокальной микроскопии, 48 ч после инкубации (рис. 2).

8. Используя mCeHR для создания трансгенных C. Элеганс Использование бомбардировки микрочастицами

Примечание: порядок формирования и проведения бомбардировки микрочастицами с использованием UNC-119 (ED3) червей, выращенных в mCeHR изложена на рисунке 3 ^13.

1. Червь Подготовка
   1. Трансфер приблизительно 1 х 10 ⁶ асинхронные UNC-119 (ed3) червей в 90 мл mCeHR СМИ в 175 см ² колбу за неделю до бомбардировки. Разрешить черви расти при 20 ° С опа встряхивая платформы на ~ 70 оборотов в минуту (рис. 3-1).
      Примечание: Через неделю, плотность червь должен быть значительно больше, со многими взрослыми беременных червей. Примерно 3 х 10 ⁷ черви будут необходимы для бомбардировки микрочастицами.
   2. Холод JM-109 Е. палочка высевают 10 см NGM пластины на льду.
   3. Перенесите аксенными червей к двум 50 мл конические пробирки и центрифуги червей при 800 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют червей в каждую пробирку в 50 мл M9 буфера (рис. 3-2).
   4. Разрешить взрослых червей для осаждения под действием силы тяжести от 10 до 15 мин на льду.
      Примечание: Сейчас 2 мл гранул должен содержать> 90% взрослых червей. Это 2 мл осадок должен иметь примерно 5 х 10 ⁶ червей и достаточно для одной бомбардировки микрочастицами.
   5. Покройте всю поверхность охлажденной JM109 высевают NGM пластины с 2 мл гранул червей. Дайте жидкости полностью поглощены затем оставить пластинув течение 30 мин на льду, прежде чем приступить (рис. 3-3).
2. Получение частиц золота
   1. Взвесить 30 мг частиц золота в силиконом трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 70% этанола и вихревые трубки в течение 5 мин.
   2. Разрешить трубка сидеть в течение 15 мин, затем центрифуге при 6000 мкг в течение 10 сек для осаждения частиц золота. Удалить супернатант с помощью пипетки осторожно касаясь кончиком на стороне, противоположной трубки с частицами золота.
   3. Вымойте частицы золота с 1 мл стерильной воды, вихря в течение 1 мин и кратко центрифуги трубки при 6000 мкг в течение 10 сек. Повторите стадии промывки дважды, затем ресуспендируют частицы золота в 0,5 мл стерильного 50% глицерина.
      Примечание: Конечная концентрация частиц золота будет 60 мг / мл и его можно хранить в течение от 1 до 2 месяцев при 4 ° С.
3. Подготовьте смесь ДНК-частиц золота
   1. Смешайте 10 мкг целевого плазмидной ДНК с 10 &# 956; г UNC-119 спасательных плазмиды в силиконизированную 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 50 мкл дистиллированной воды и 100 мкл хорошо ресуспендированного решения частиц золота, то вихревой в течение 1 мин.
   2. Добавить 150 мкл 2,5 М CaCl ₂ и вихрь решение снова в течение 1 мин. К этому раствору добавить 60 мкл 0,1 М спермидин и вихря от 3 до 5 мин.
   3. Импульсный центрифугировать раствор при 6000 х г в течение 10 сек, удалить супернатант и добавить 300 мкл 70% этанола. Vortex хорошо в течение 1 мин, пульс центрифуге при 6000 мкг в, удалите супернатант и ресуспендируют в 170 мкл 100% этанола. Энергично вихрь решение для 5 до 10 минут, затем импульс центрифуги и удалите супернатант.
4. Бомбардировка (рис. 3-3)
   Примечание: Этот протокол осуществляется с системой доставки частиц, указанных в таблице материаловедения / Оборудование. Следуйте инструкциям для доставки частиц инструмента доступны.
   <литий> Поместите лист папиросной бумаги в 15 см пластины. С помощью пинцета, опустите семь macrocarriers индивидуально в 100%-ном этаноле и положите их на ткани для просушки.
   1. Тщательно очистите Biolistic камеру, macrocarrier держатель и мишень с 70% этанола. Чистый и автоклав моменты остановки экраны перед каждой процедурой бомбардировки.
   2. Загрузите macrocarrriers в держатель с помощью пинцета и нажмите в держатель с помощью инструмента уголок.
   3. Равномерно 20 мкл частиц золота ДНК покрытием в центре каждого macrocarrier а затем дайте раствору высохнуть.
   4. Очистка две части делителя давления с этанолом и собирают с этанолом очищены разрыва дисков. Винт делитель собранный давления и разрывных мембран в бомбардировке камеры.
   5. Соберите автоклавного экран остановки с держателем macrocarrier и поместите аппарат на металлической полкой необходимой и зафиксировать.
   6. Вставьте собранный МВУОocarrier аппарат в биолистической камеры в отведенное слот ниже делителя давления и согласовать с делителя давления.
   7. Лента открытый NGM пластины с червями на мишень пластины полке и закройте дверцу камеры.
   8. Для бомбардировать червей, отрегулировать давление в том, что необходимо сломать разрывных мембран. Включите вакуума до 28 дюймов ртутного столба, а затем нажмите кнопку огня, пока диски не разрыв.
   9. Отпустите вакуум и снимите NGM пластины из аппарата. Вымойте червей от пластины и распространять через двадцать 10 см NGM пластин посеянных с JM109 Е. палочка (рис. 3-4).
   10. Разрешить черви расти в течение 10 до 14 дней при 25 ° С и голодать тарелки. Черви спасенные от дефекта UNC-119 будет иметь нормальное движение и может быть идентифицирован в это время. Выберите по крайней мере 10 "дикого типа" червей из отдельных пластин для дальнейшего анализа, поскольку они представляют собой независимые трансгенных линий (Figurэ 3-5).

Результаты

Культивирование C. Элеганс в аксенными жидкой среды помогает в определении питательных веществ, которые необходимы червями, без вмешательства со стороны вторичных метаболитов, продуцируемых Е. палочка. Дикого типа N2 червей акклиматизироваться к mCeHR информации в течение трех ...

Обсуждение

В этом протоколе мы представляем модифицированную аксенными жидких сред mCeHR, который позволяет для быстрого C. поколение Элеганс с производством большого количества червей. Этот носитель показывает ряд преимуществ, как черви выращиваются без загрязнения E. палочка или б?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MgCl2•6H2O	Sigma	M-2393
Sodium citrate	Sigma	S-4641
Potassium citrate monohydrate	Sigma	P-1722
CuCl2•2H2O	Fisher	C455-500
MnCl2•4H2O	Fisher	M87-100
ZnCl2	Sigma	Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O	Sigma	F-1018
CaCl2•2H2O	Fisher	C70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt	Sigma	A-1752
Cytidine 5 -phosphate	Sigma	C-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphate	Sigma	G-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium salt	Sigma	U-6375
Thymine	Sigma	T0376
N-Acetylglucosamine	Sigma	A3286
DL-Alanine	Fisher	S25648
p-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878
Biotin	Sigma	B-4639
Cyanocobalamine (B-12)	Sigma	V-2876
Folinate (Ca)	Sigma	F-7878
Niacin	Sigma	N-0761
Niacinamide	Sigma	N-3376
Pantetheine	Sigma	P-2125
Pantothenate (Ca)	Sigma	P-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)	ACRCS	21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphate	Sigma	P-3657
Pyridoxamine 2HCl	Sigma	P-9158
Pyridoxine HCl	Sigma	P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na)	Sigma	R-7774
Thiamine HCl	Sigma	T-1270
DL-6,8-Thioctic Acid	Sigma	T-1395
KH2PO4	Sigma	P-5379
Choline di-acid citrate	Sigma	C-2004
myo-Inositol	Sigma	I-5125
D-Glucose	Sigma	G-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysate	Sigma	L-9010
Brain Heart Infusion	BD	211065
Hemin chloride	Frontier Scientific	H651-9
HEPES, sodium salt	Sigma	H-3784
Cholesterol	J.T. Baker	F676-05
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140-076
MEM Amino Acids Solution	Invitrogen	11130-051
Nalidixic acid sodium salt	Sigma	N4382
Tetracycline Hydrochloride	MP Biomedicals	2194542
Biolistic Delivery System	BioRad	165-2257
Gold particles (Au Powder)	Ferro Electronic Material Systems	6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μm	BioRad	165-2263