A cultura<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas

Resumo

C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante.

Resumo

Neste protocolo, apresentamos os materiais necessários, bem como o procedimento para a tomada de C modificado. Legans e habituação e de reprodução da mídia (mCeHR). Além disso, as etapas para expor e aclimatação C. elegans crescidos em E. coli para axênica meios líquidos são descritos. Finalmente, experimentos a jusante que utilizam axênica C. elegans ilustrar os benefícios deste procedimento. A capacidade de analisar e determinar C. elegans exigência nutricional foi ilustrada pelo crescimento N2 tipo selvagem vermes em meio líquido axênicos com concentrações variadas de heme. Este procedimento pode ser replicado com outros nutrientes para determinar a concentração óptima para o crescimento e desenvolvimento de sem-fim ou, para determinar os efeitos toxicológicos de tratamentos com drogas. Os efeitos da concentração do heme variadas sobre o crescimento de tipo selvagem vermes foram determinados por meio de observação microscópica qualitativa e quantificando tele número de vermes que cresciam em cada concentração de heme. Além disso, o efeito de concentrações variadas de nutrientes pode ser ensaiada utilizando vermes que expressam sensores fluorescentes que respondem a alterações nos teores de nutrientes de interesse. Além disso, um grande número de vermes foram facilmente produzida para a geração de C. elegans transgénicos utilizando bombardeamento com micropartículas.

Introdução

O nematóide do solo, Caenorhabditis elegans, é um poderoso organismo modelo utilizado em inúmeros estudos da genética à toxicologia. Como resultado do seu tamanho 1 mm de tempo de geração rápida de quatro dias, a facilidade de cultivo, e um grande número da progenitura, estes nemátodos têm sido utilizados num certo número de telas genéticos e farmacológicos ^{1, 2.} Pesquisadores tirar proveito deste worm para identificar moléculas e vias conservadas em sistemas de vertebrados. Estas vias incluem sinais de morte celular, as vias de envelhecimento e metabolismo, e o sistema nervoso ^3-6. Além disso, a transparência da C. elegans permite a geração de linhas transgénicas usando repórteres de proteínas fluorescentes, que podem ser visualizadas directamente para analisar os padrões de expressão de genes e localização de proteínas.

Em muitos estudos desse nematóide é cultivado em uma superfície à base de agar sólido usando nematóide meio de crescimento placas (NGM) ou lculturas iquid semeada com Escherichia coli como uma fonte de alimento ^7,8. Estas fontes alimentares bacterianas podem confundir estudos bioquímicos e toxicológicos com a interferência de bactérias subprodutos que afetam a interpretação dos resultados. A fim de evitar estes efeitos combinados, C. elegans podem ser cultivadas num meio líquido axênicos que é desprovido de bactérias como uma fonte de alimento. Usando essa mídia, cultivadas com sucesso milhões de vermes altamente sincronizadas para muitos padrão C. protocolos elegans, incluindo a análise de microarray de genes diferencialmente regulados em C. elegans expostas a diferentes concentrações de heme e a produção de vermes transgénicas usando bombardeamento de genes. Esta mídia é quimicamente definidos e modificados a partir de uma receita original formulada pelo Dr. Eric Clegg ^9. Utilizando este suporte mCeHR, identificámos com sucesso genes envolvidos na homeostase do heme, que se refere a genes que respondem a heme (hrg s) ^10, o qual farianão ter sido possível em condições de crescimento normais que utilizam placas de agar semeadas com E. NGM coli.

Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a introdução e manutenção de C. elegans crescidos em E. coli para o mCeHR axênica e utilizar este método para obter um grande número de vermes para a produção transgénica C. linhas elegans utilizando micropartículas bombardeio. Nós também apresentamos estudos que mostram a utilidade de usar mídia axênicos para determinar a exigência nutricional de C. elegans utilizando heme como um exemplo. Estes estudos mostram que o uso de meios de comunicação mCeHR permite o crescimento rápido de um grande número de C. elegans para muitas aplicações a jusante utilizados por pesquisadores verme.

Protocolo

1. Cepas Worm

1. Obter C. elegans do tipo selvagem estirpes Bristol N2 a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e mantê-los em placas NGM semeados com E. OP50 coli ^7. Nota: verme transgênico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados foram gerados como descrito anteriormente ^11. IQ6011 pode ser solicitado ao autor correspondente.

2. Preparação de modificação C. elegans Habitação e Reprodução Médio (mCeHR)

Prepare mCeHR meios líquidos, como descrito abaixo ^{de 12.} Esta mídia líquido axênica permite que os vermes a crescer sem quaisquer fontes de alimentos adicionais. Realizar todas as manipulações dos meios líquidos axênicas e worms axênicos usando condições rigorosamente estéreis, como uma capela de fluxo laminar.

1. Obter leite livre de gordura ultra-pasteurizado de uma mercearia. Use o pró refrigeradoduto e não o produto a temperatura ambiente. Antes de ser utilizado na mCeHR meio, a sequência de leite em Brain Heart Infusion (BHI) em placas de agar e incubar durante 3 dias a 30 ° C e 37 ° C para verificar a esterilidade. Colocar o leite para tubos de 50 ml estéreis e armazenar a -80 ° C
2. Prepare a cada um dos seguintes componentes e combinar na ordem e quantidades apresentadas para preparar 1 litro de mCeHR (Tabela 1A): 10 ml de 2 mM de citrato de colina diácido, 10 ml de vitaminas e mistura de factor de crescimento (ver receita na Tabela 1B), 10 ml de 2,4 mM de mio-inositol, 10 ml de 2 mM de cloreto de hemina, 250 ml de água deionizada. Aplicar sucção e filtra-se através de uma unidade de filtro de 0,22 um.
3. Adicionar 20 ml da mistura de ácido nucleico (receita na Tabela 1C), 100 ml de mistura de minerais (receita na Tabela 1E), 20 ml de 170 mg / ml de hidrolisado de lactalbumina, 20 ml de aminoácidos essenciais, 10 ml de aminoácidos não essenciais Os ácidos, de 20 ml de 450 mM de KH ₂ PO _4,50 ml de 1,45 M de D-glucose, 10 ml de HEPES 1 M, sal de sódio, 250 ml de água desionizada.
4. Aplicar sucção para filtrar esterilizar os componentes. Retire o filtro e adicionar 1 ml de 5 mg / ml de colesterol. Certifique-se que o pH do meio é de cerca de 6-6,5. Nota: Esta solução pode ser armazenada a -80 ° C durante até um ano.
5. Adicionar 20% (v / v), ultra-pasteurizado de leite desnatado orgânico para o meio mCeHR antes da utilização. Use técnica escrupulosamente estéril (por exemplo, numa câmara de fluxo laminar), quando a abertura e alíquotas do leite. Armazene a mídia a 4 ° C.

3. Prepare C. elegans para a Cultura em Axenic mCeHR Líquido Médio

1. Crescer vermes em dez 60 milímetros placas NGM até há muitos vermes grávidas e uma quantidade mínima de OP50 E. coli nas placas.
2. Remover as minhocas de cada placa por enxaguamento com 5 ml de tampão M9 (receita na Tabela 1F), e combinar num tubo de 50 ml.
3. Permita que os vermes para settle, deixando o tubo em repouso durante 5 a 10 min, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante contendo a E. coli.
4. Repita os passos 3.2 e 3.3 2x para remover tanto as bactérias residuais quanto possível, antes de continuar o procedimento.
5. Ressuspender as minhocas em 0,1 N de NaCl num volume que é um múltiplo de três, por exemplo, 1,5 ml, 3 ml ou 6 ml, em que os vermes individuais pode ser visto no tubo.
6. Branquear os vermes por adição de NaOH 5 N e de hipoclorito de sódio a 5% solução (lixívia) numa proporção de 01:02:06 para a suspensão verme. Por exemplo, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml de hipoclorito de sódio a 5%: 6 ml de suspensão de vírus. Misture o NaOH e branqueador antes da adição à suspensão de verme.
7. Vortex se vigorosamente a solução até as minhocas grávidas são dissolvidos e apenas os ovos são visíveis dentro da suspensão (cerca de 5 a 10 min). Monitorar o processo usando um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10X.
8. Após os vermes se ter dissolvido completamente, a pelota imediatamenteovos de 800 g durante 45 segundos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com 10 ml de água estéril, por centrifugação a pelota em 800 xg durante 45 seg a 4 ° C.
9. Após o branqueamento, transferir o sedimento de ovo a um frasco de 25 de tecido cm ² de cultura contendo 10 ml de meio mCeHR suplementadas com 100 ug / ml de tetraciclina. Realizar este procedimento usando técnicas estéreis. Se for o caso, adicionar antibióticos adicionais, incluindo 250 ug / ml de ácido nalidíxico, para prevenir o crescimento bacteriano nas culturas líquidas axênicos.
10. Incubar as culturas liquidas a 20 ° C num incubador com agitação a cerca de 70 rpm.
11. Verificar os vermes diária observar a fase de desenvolvimento e a taxa de crescimento.
    Nota: Worms inicialmente crescem lentamente e exigem 7 a 10 dias para se tornar grávido. No entanto, como os vermes aclimatar ao meio líquido o tempo de geração irá diminuir a aproximadamente 4 dias para o tipo selvagem (N2) vermes.
12. Depois que os vermes têm desenvolvido para a fase grávida em meio líquido, a transferência da cultura para um tubo sem-fim cónico e sedimentar as minhocas a 800 xg por 5 min a 4 ° C utilizando um rotor de balde oscilante.
13. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de vírus num volume igual de 0,1 M de NaCl. Por exemplo, utilizar 10 ml de 0,1 M de NaCl para vermes cultivados em 10 ml de mCeHR. Permita que os vermes que se contentar com 5 min no gelo.
14. Realizar o procedimento de clareamento, como descrito acima em passos 3,5-3,8, e permitir que os vermes a crescer para uma segunda geração nos meios líquidos axênicas. Se necessário, adicionar o antibiótico de novo para inibir o crescimento bacteriano.
15. Novamente permitir que os vermes se tornar prenhe então granulada e ressuspender os vermes em 0,1 M de NaCl, tal como descrito nos passos 3.12 e 3.13, então lixívia novamente como descrito nos passos de 3,5-3,8, para produzir uma população sincronizada. Crescer os vermes larvais L1 em ​​meios líquidos sem antibióticos a partir de agora.

4. Sincronizando Worms de líquidoCultura

1. Pellet e ressuspender os vermes em NaCl 0,1 M, como descrito acima nos passos 3.12 e 3.13. Lixívia como descrito acima nos passos 3,5-3,8.
2. Ressuspender o sedimento de ovo em 10 ml de tampão M9 e permitir que as larvas eclodem O / N a 20 ° C num agitador de plataforma rotativa. Nota: Os ovos eclodem em larvas L1, mas não vai desenvolver ainda mais, sincronizando os vermes na fase L1.
3. Para manter e vermes subcultura, pelota larvas L1 a 800 xg durante 5 min, em seguida, voltar a suspender as larvas em 10 ml de mCeHR e transferência para um frasco de 25 cm ^2. Permitir que os vermes a crescer a 20 ° C numa plataforma rotativa. Manter uma densidade máxima de 3.000 vermes / ml / cm ² para garantir nutrição adequada para os vermes.
   Nota: Nesta fase, os antibióticos não são necessárias para manter as condições axénicas, quando os procedimentos são efectuados utilizando técnicas esterilizadas numa hote de fluxo laminar. Worms deve ser verificado diariamente para acompanhar o crescimento.

5. Grátiszing e descongelamento Worms para culturas Axenic Médio

1. Congelar culturas vermes assíncronos axênicos ou larvas L1 sincronizado em nitrogênio líquido. Vermes pelete a 800 x g durante 5 min e em seguida ressuspender em tampão S (6,45 mM KHPO _4, 43,55 mM KHPO _4, NaCl 146,25 mM) usando 0,5 ml para cada frasco. Adicionar um volume igual de tampão de S com 30% v / v de glicerol a cada frasco e transferir os vermes para -80 ° C, antes de armazenamento a longo prazo em N2 _líquido. Congelar a cerca de 1 x 10 ⁶ por ml vermes em cada frasco.
2. Descongelar vermes por incubação dos tubos a 37 ° C durante aproximadamente 2 minutos até quase todo o gelo é derretido. Em uma câmara de fluxo laminar, transferir os vermes para um frasco estéril contendo mCeHR e colocá-los a 20 ° C.

6. Determinar o efeito de Hemin Concentração de Crescimento e Reprodução em mCeHR

1. Use mídia mCeHR axênicos para ensaio de crescimento dependente de nutrientes de C. elegans. Para determinar o efeito of concentração hemina sobre o crescimento e desenvolvimento sem fim, use sincronizado vermes N2 axênicos ou outras cepas de interesse. Sincronizar larvas L1, como descrito acima na seção 4.
2. No dia seguinte, pelota e contar larvas L1 sincronizado e diluir a 1 verme por mL de mídia axênicas. Adicione cloreto de hemina a 10 mM em 0,3 M de NH ₄ OH e ajustar a pH 8, utilizando HCl concentrado.
3. Adicionar 800 ul de meio mCeHR para uma placa de 24 poços. Adicionar 100 vermes para cada poço em 100 ul de meio. Adicionar cloreto de hemina a cada poço em concentrações que variam de 0 uM, 1,5 uM a 1,000 uM em triplicado. Assegurar que todos os poços contêm a mesma concentração de 0,3 M de NH ₄ OH. Suavemente ressuspensas os vermes antes pipetando para assegurar que 100 larvas L1 são adicionados a cada poço.
4. Examine os vermes diariamente e observe o crescimento em cada concentração em cada poço. Contar o número de vermes após 9 dias de incubação e traçar o número de vermes / ml correspondem a cada hemeconcentração (Figura 1).

7. Efeito da Hemin Concentração em Heme Sensor Worms

1. Incubar sincronizados L1 vermes sensores heme (Phrg-1 :: GFP) em mCeHR contendo 4 pM, 8 pM, 10 uM e 20 uM de hemina.
2. Imagem os vermes usando microscopia confocal de fluorescência, 48 pós horas de incubação (Figura 2).

8. Utilizando mCeHR gerar Transgênicos C. elegans Usando Microparticle Bombardeio

Nota: O procedimento para a criação e a realização de bombardeamento com micropartículas usando vermes cultivados em mCeHR unc-119 (ed3) é mostrada na figura 3 ^13.

1. Preparação Worm
   1. Transferir cerca de 1 x 10 ⁶ assíncronas unc-119 (ed3 vermes) em 90 ml de meio mCeHR em um balão de 175 centímetros ² uma semana antes do bombardeamento. Permita que os vermes a crescer a 20 ° C ona plataforma de agitação em ~ 70 rpm (Figura 3-1).
      Nota: Uma semana mais tarde, a densidade de sem-fim deve ser significativamente maior com diversos vermes adultos grávidos. Aproximadamente 3 x 10 ⁷ vermes será necessária para bombardeamento com micropartículas.
   2. Frio JM109 E. coli semeadas 10 placas NGM cm no gelo.
   3. Transferir os vermes axênicos para dois tubos de 50 ml e centrifugar cónicas dos vermes a 800 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os vermes em cada tubo de 50 ml de tampão M9 (Figura 3-2).
   4. Permita que os vermes adultos para sedimentar por gravidade por 10 a 15 min em gelo.
      Nota: Os sedimentos de 2 ml agora deve conter> 90% vermes adultos. Este sedimento 2 ml devem ter aproximadamente 5 x 10 ^{6 de} vermes e é suficiente para um bombardeamento de micropartículas.
   5. Casaco de toda a superfície da placa de JM109 refrigerados semeadas NGM com o sedimento de 2 ml de vermes. Deixe o líquido ser absorvido completamente em seguida, deixar a placapor 30 min no gelo antes de prosseguir (Figura 3-3).
2. Preparação de partículas de ouro
   1. Pesar 30 mg de partículas de ouro para um tubo de microcentrífuga siliconizada. Adicionar 1 ml de etanol 70% e vortex do tubo durante 5 min.
   2. Permitir que o tubo em repouso durante 15 min, depois, centrifugar a 6000 xg durante 10 seg para sedimentar as partículas de ouro. Retirar o sobrenadante utilizando uma pipeta, tocando cuidadosamente a ponta para o lado oposto do tubo com as partículas de ouro.
   3. Lavar as partículas de ouro com 1 ml de água estéril, vortex durante 1 min e centrifugar brevemente o tubo a 6.000 xg durante 10 seg. Repetir o passo de lavagem, duas vezes, em seguida, voltar a suspender as partículas de ouro, em 0,5 ml de glicerol a 50% estéril.
      Nota: A concentração final das partículas de ouro será de 60 mg / ml e pode ser armazenado durante 1 a 2 meses a 4 ° C.
3. Preparar a mistura de partículas de DNA a ouro
   1. Combinar 10 ug do ADN de plasmídeo desejado com 10 &# 956; g do unc-119 plasmídeo de resgate em uma siliconizada 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Adicionar 50 mL de água DI e 100 ul de solução de partículas bem ressuspenso ouro depois vórtice durante 1 min.
   2. Adicionar 150 ul de 2,5 M _CaCl2 e vortex a solução novamente durante 1 min. A esta solução, adicionar 60 ul de espermidina 0,1 M e vortex durante 3 a 5 min.
   3. Pulso centrifugar a solução a 6.000 xg durante 10 seg, remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de etanol a 70%. Vortex bem durante 1 min, centrifugar a 6.000 xg pulso, remove-se o sobrenadante e ressuspender em 170 ul de etanol a 100%. Vortex vigorosamente a solução durante 5 a 10 minutos, em seguida centrifuga pulso e remover o sobrenadante.
4. Bombardeio (Figura 3-3)
   Nota: Este protocolo realiza-se com o sistema de entrega de partículas especificado na Tabela de Materiais / equipamento. Siga as instruções para o instrumento de entrega de partículas disponível.
   1. Coloque uma folha de papel de tecido em uma placa de 15 cm. Com uma pinça, mergulhe sete macrocarriers individualmente em etanol 100% e colocá-las sobre o tecido para secar.
   2. Limpe bem a câmara de biobalística, titular microtransportador, e placa-alvo com etanol 70%. Limpe e autoclave as telas de parada antes de cada procedimento de bombardeio.
   3. Coloque as macrocarrriers no suporte usando uma pinça e imprensa no suporte usando a ferramenta de estar.
   4. Uniformemente distribuído 20 ul do DNA de partículas de ouro revestidas, no centro de cada microtransportador e, em seguida, permitir que a solução seque completamente.
   5. Limpar as duas partes do divisor de pressão com etanol e montar com etanol limpo discos de ruptura. Aperte o divisor de pressão montado e discos de ruptura na câmara de bombardeamento.
   6. Montar uma tela de parada autoclavado com o titular da microtransportador e coloque o aparelho em cima da prateleira de metal necessárias e trava no lugar.
   7. Insira o macr montadoAparelho ocarrier na câmara biolística na ranhura colocado abaixo do divisor de tensão e alinhar com o divisor de tensão.
   8. Tape a placa NGM aberto com os vermes na prateleira placa-alvo e fechar a porta da câmara.
   9. Para bombardear vermes, ajustar a pressão para que a necessária para quebrar os discos de ruptura. Ligue o vácuo de 28 polegadas de pressão de Hg, em seguida, pressione o botão de fogo até que os discos de ruptura.
   10. Solte o vácuo e retirar a placa NGM do aparelho. Lave os vermes da placa e redistribuir em vinte placas de 10 cm NGM semeados com JM109 E. coli (Figura 3-4).
   11. Permitir que os vermes se crescer durante 10 a 14 dias a 25 ° C e as placas de fome. Worms resgatados de defeito unc-119 terá movimento normal e pode ser identificada neste momento. Escolha pelo menos 10 "tipo selvagem" vermes de pratos separados para análise uma vez que estes representam linhagens transgênicas independentes (Figure 3-5).

Resultados

Cultivar C. elegans em axênicos ajudas meio líquido na determinação de nutrientes que são necessários por vermes, sem a interferência de metabólitos secundários produzidos por E. coli. Vermes de tipo selvagem N2 aclimatar a mídia mCeHR dentro de três gerações e mostrar um crescimento comparável a vermes cultivadas em placas bacterianas NGM. Na verdade, esses vermes se tornar grávida dentro de 4 dias, em comparação com 3,5 dias para vermes cultivadas em OP50 bactérias.

Discussão

Neste protocolo, apresentamos uma mCeHR mídia modificado axênica líquido que permite a rápida C. geração elegans com a produção de um grande número de vermes. Esta mídia mostra várias vantagens como os vermes são cultivados sem contaminar E. coli ou subprodutos de bactérias e pode ser explorada em estudos nutricionais e toxicológicos. O uso de E. coli ou outras bactérias em tais estudos tem vários inconvenientes. Por exemplo, o crescimento das bactérias podem mudar, s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MgCl2•6H2O	Sigma	M-2393
Sodium citrate	Sigma	S-4641
Potassium citrate monohydrate	Sigma	P-1722
CuCl2•2H2O	Fisher	C455-500
MnCl2•4H2O	Fisher	M87-100
ZnCl2	Sigma	Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O	Sigma	F-1018
CaCl2•2H2O	Fisher	C70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt	Sigma	A-1752
Cytidine 5 -phosphate	Sigma	C-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphate	Sigma	G-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium salt	Sigma	U-6375
Thymine	Sigma	T0376
N-Acetylglucosamine	Sigma	A3286
DL-Alanine	Fisher	S25648
p-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878
Biotin	Sigma	B-4639
Cyanocobalamine (B-12)	Sigma	V-2876
Folinate (Ca)	Sigma	F-7878
Niacin	Sigma	N-0761
Niacinamide	Sigma	N-3376
Pantetheine	Sigma	P-2125
Pantothenate (Ca)	Sigma	P-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)	ACRCS	21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphate	Sigma	P-3657
Pyridoxamine 2HCl	Sigma	P-9158
Pyridoxine HCl	Sigma	P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na)	Sigma	R-7774
Thiamine HCl	Sigma	T-1270
DL-6,8-Thioctic Acid	Sigma	T-1395
KH2PO4	Sigma	P-5379
Choline di-acid citrate	Sigma	C-2004
myo-Inositol	Sigma	I-5125
D-Glucose	Sigma	G-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysate	Sigma	L-9010
Brain Heart Infusion	BD	211065
Hemin chloride	Frontier Scientific	H651-9
HEPES, sodium salt	Sigma	H-3784
Cholesterol	J.T. Baker	F676-05
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140-076
MEM Amino Acids Solution	Invitrogen	11130-051
Nalidixic acid sodium salt	Sigma	N4382
Tetracycline Hydrochloride	MP Biomedicals	2194542
Biolistic Delivery System	BioRad	165-2257
Gold particles (Au Powder)	Ferro Electronic Material Systems	6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μm	BioRad	165-2263