Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Resumen

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Resumen

La mayoría de los procesos morfogenéticos en el intestino fetal se han deducido a partir de secciones finas de tejidos fijados, proporcionando instantáneas de los cambios más etapas de desarrollo. Información tridimensional a partir de secciones delgadas de serie puede ser difícil de interpretar debido a la dificultad de la reconstrucción de las secciones de serie perfectamente y mantener la orientación adecuada de los tejidos en las secciones de serie. Las investigaciones recientes de Grosse et al., 2011 ponen de manifiesto la importancia de la información dimensional tres en la comprensión de la morfogénesis de las vellosidades del intestino en desarrollo ^1. Reconstrucción tridimensional de las células intestinales individualmente etiquetados demostró que la mayoría de las células epiteliales intestinales en contacto con ambas superficies apicales y basales. Además, la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto de actina en la superficie apical del epitelio demostró que el lumen intestinal es continua y que los lúmenes secundarios son un artefacto de sectioning. Esos dos puntos, junto con la demostración de la migración nuclear interkinetic en el epitelio intestinal, definen el epitelio intestinal como el desarrollo de un epitelio pseudoestratificado y no estratificados como se pensaba anteriormente ^1. La capacidad de observar el epitelio tridimensionalmente era seminal a demostrar este punto y la redefinición de la morfogénesis epitelial en el intestino fetal. Con la evolución de la tecnología de imágenes multi-fotón y software de reconstrucción en tres dimensiones, la capacidad de visualizar intacta, el desarrollo de órganos está mejorando rápidamente. Excitación de dos fotones permite la penetración más profunda menos perjudiciales en los tejidos con alta resolución. Dos fotones de imágenes y reconstrucción 3D de todo el intestino del feto de ratón en Walton et al., 2012 ayudaron a definir el patrón de vellosidades consecuencia ^2. Aquí se describe un sistema de cultivo de órgano entero que permite ex vivo el desarrollo de las vellosidades y las extensiones de ese sistema de cultivo para permitirlos intestinos sean tridimensionalmente fotografiado durante su desarrollo.

Introducción

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protocolo

NOTA: Todos los ratones fueron manejados con humanidad utilizando los protocolos aprobados por la Universidad de Michigan Medical School Unidad de Laboratorio de Medicina Animal y de acuerdo con las directrices del Comité de la Universidad sobre el uso y cuidado de los animales.

1. System Organ Culture Whole

1. Preparación de medios de comunicación y placas de cultivo
   1. En una campana de cultivo de tejidos, eliminar 5 ml de medio BGJb de la botella stock y añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina. Prepare una solución de trabajo de los medios de comunicación en un tubo cónico de 50 ml, mediante la adición de 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de medio BGJb (con Pen / Strep).
   2. Preparar una placa de cultivo de 6 pocillos mediante la adición de 1 ml por debajo de cada uno de los cultivos polarizados.
      NOTA: Si no se utilizan los 6 transwells, mover transwells adicionales en una placa de 6 pocillos estéril fresco para su uso posterior. Añadir 3 ml de los medios de trabajo BGJb a cada una de tres placas de Petri de 10 cm estériles.
2. Preparación para la disección
   1. Remoje las herramientas de disección en el 70% ethanol y asegúrese de mantener las herramientas limpias durante el trabajo.
   2. Configurar la zona de disección con un gran cubo de hielo y colocar la placa de cultivo de 6 pocillos y 10 cm placas de Petri con medios BGJb sobre hielo. Trabajar en el hielo tanto como sea posible mientras que la disección y preparación de los intestinos para la cultura.
   3. Anestesiar a los ratones hembra adulta en una cámara con isofluorano (100 l) antes de la eutanasia por dislocación cervical para la recolección de los intestinos fetales.
   4. Después de cosechar los fetos de su madre, etapa cada feto cuidadosamente según la Theiler puesta en escena gráfica ^13. No confíe en los días post-coito para determinar la edad de cada feto como variaciones de hasta 24 horas en la etapa de desarrollo se observan habitualmente en una sola camada.
3. La disección de los intestinos fetales
   1. La eutanasia a los fetos por decapitación antes de la extracción de los intestinos.
   2. Diseccionar cada intestino en 1x de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) y luego place en una placa de Petri de 10 cm con el trabajo de medios BGJb.
   3. Retire cuidadosamente el bazo desde el estómago y el páncreas desde el estómago y el duodeno superior.
   4. Separar suavemente el epiplón teniendo cuidado de dejar el epiplón adjunta tanto como sea posible y la separación de las conexiones sólo lo suficiente para permitir que el intestino para ser enderezada.
      NOTA: Para intestinos mayores de E14.5 o los que están siendo cultivados más de 24 horas, separar suavemente el intestino en 3 segmentos iguales para permitir el contenido luminal fluyan a través del intestino y ser expulsados ​​de los extremos cortados. Sin embargo, para que las culturas se inició antes de E13.5, espere hasta después de 24 horas de cultivo antes de la separación de los 3 segmentos del intestino para permitir la serosa crezca adecuadamente en toda la longitud del intestino.
   5. Usar una pipeta de boca para transferir las piezas intestinales en los cultivos polarizados de la placa de cultivo (1.1.2).
   6. Reposicionar suavemente los intestinos a medida que sea necesario para que estén en línea recta la Transwell.
      NOTA: Una vez que los intestinos comienzan a moverse contenido luminal a través del tubo, cualquier torcedura en el intestino provocarán una copia de seguridad y daños en el intestino.
4. Cultura y tratamiento
   1. Retire el papel de debajo de la transwell, añadir 700 l de medio de tratamiento (los medios de comunicación que trabajan con proteínas recombinantes añadidos o inhibidores farmacológicos) bajo la transwell.
   2. Añadir 300 l de medio de tratamiento gota a gota en la parte superior de los intestinos y deje que penetre a través de la transwell. Vuelva a colocar el intestino en caso necesario.
   3. Cambie medio de tratamiento por lo menos una vez al día o más a menudo, dependiendo de la vida media del reactivo de tratamiento.
5. Preparación de proteínas empapado perlas de agarosa para una fuente localizada de reactivo de tratamiento
   1. Resuspender las perlas de agarosa en su recipiente de almacenamiento y la transferencia de 100 l de perlas de agarosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Llenar el volumen restante del tubo con 1x estéril Phosphate-Buffered Saline (PBS) y mezclar las perlas para lavarlos. Colocar el tubo de microcentrífuga en un bastidor por unos pocos minutos para permitir que las perlas se depositan en el fondo y luego pipetee de la PBS en la parte superior de la de las perlas. Vuelva a llenar el tubo de microcentrífuga con 1x PBS estéril y repetir el proceso de lavado dos veces más.
   3. Preparar la proteína de interés a dos veces la concentración deseada para el tratamiento.
   4. Mezclar 5 l de perlas de agarosa lavadas con 5 l de la proteína de stock 2x y agite suavemente las perlas en la proteína. Se coloca el tubo en hielo durante 1 hora, mezclando suavemente cada 10-15 min.
   5. Enjuague las perlas brevemente en PBS 1x estéril antes de colocar las perlas en los intestinos.
6. La colocación de perlas de agarosa
   1. Con suavidad, coloque las bolas de agarosa en la parte superior de los intestinos usando una pipeta de boca con agujas capilares tirados. Coloca las bolitas con extremo cuidado ya que el manejo brusco puede dañar el intestino y prevenir el desarrollo de vellosidades en el área lesionada.
   2. Coloque el doble de cuentas que sean necesarios para el análisis, ya que los intestinos se someterán a los movimientos peristálticos y aproximadamente la mitad de los granos colocados rodará fuera de los intestinos durante el tiempo de cultivo.
7. La fijación de los intestinos cultivadas
   1. Retire con cuidado los medios de tratamiento de debajo de la transwell y permitir que los intestinos se sequen al aire durante 3 min.
   2. Añadir 1 ml de fijador bajo el transwell durante 2 min, luego cubrir la parte superior del intestino con 2 ml de fijador para el resto del tiempo de fijación. Fijar con paraformaldehído al 4% O / N a 4 ° C o durante 2 horas a temperatura ambiente.

2. Imaging de intestinos fijos

1. Imágenes Wholemount
   1. Coloque el conjunto de los intestinos (con fluorescencia endógena) en un portaobjetos con 100 l de 1x DPBS. El uso de fórceps para arreglar suavemente los intestinos.
   2. Utilice un pañuelo de papel de laboratorio para retirar cuidadosamente los DPBS y añadir inmediatamente 100 l de 70% de glicerol para hacer el mo tejidovolver transparente y aumentar la posible profundidad de formación de imágenes.
      NOTA: Si se desea una mayor penetración del intestino, en lugar de montar el intestino en un 70% de glicerol, empape el intestino en unas gotas de Focus Claro solución para 10-30 min. Pipeta de fuera de la solución de enfoque claro y montar el intestino con el Monte Claro.
   3. Sumerja cada una de las cuatro esquinas de un cubreobjetos en plastilina y recoger una pequeña cantidad de arcilla para usar como separadores entre el portaobjetos y cubreobjetos para mantener el cubreobjetos de aplanamiento del intestino.
   4. Sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con valap derretida aplicada con un bastoncillo de algodón.
   5. Imagen de los intestinos a ambos un microscopio confocal en posición vertical o invertida. Por favor refiérase a la discusión para más detalles.
2. Seccionamiento Vibratome de intestinos fijos (para vista en sección transversal de las estructuras intestinales)
   1. Intestinos Insertar en el 7% de agarosa en pequeños moldes de plástico (10 x 10 x 15 mm) y permitir que los bloques de agarosa aenfriar y solidificar.
   2. Retire los bloques de agarosa de los moldes de plástico y pegamento bloques de agarosa a la etapa de recolección vibratome con pegamento instantáneo.
   3. Llenar la etapa de recolección de frío hielo 1x DPBS.
   4. Cortar secciones con un espesor de entre 100-150 micras. Por secciones más gruesas utilizan las soluciones de compensación (que se describen en la sección 2.1.2) para visualizar más en la sección transversal.
   5. Vierta vibratome secciones de la etapa de recolección en un pocillo de una placa de 6 pocillos para el almacenamiento a 4 ° C.
3. La tinción de inmunofluorescencia de tejidos, vibratome seccionadas fijos
   1. Coloque 5-12 secciones vibratome por pocillo en una placa de 24 pocillos con 1x DPBS.
   2. Retire 1x DPBS y añadir 500 l de solución de permeabilización por pocillo. Agite suavemente las muestras durante 25 minutos a temperatura ambiente.
   3. Después de permeabilización, lavar las muestras 3 veces con 1 × PBS.
   4. Bloquee las muestras durante al menos 30 min en 500 l de disolución de bloqueo.
   5. Después del bloqueo, eXchange la solución de bloqueo con 500 l de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo y mantener las muestras a 4 ° CO / N.
      NOTA: Las diluciones de anticuerpos primarios que funcionan bien en las secciones congeladas y parafina generalmente funcionan bien en vibratome secciones también, sin embargo, los anticuerpos que requiere la recuperación de antígeno nuclear generalmente no funcionan bien con este protocolo (por ejemplo, BrdU).
   6. El día siguiente, se lavan las muestras 3 veces durante 15 min cada vez con solución de bloqueo.
   7. Después del lavado, se aplican 500 l del anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo. Envolver la placa de 24 pocillos en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz y el rock las muestras durante 45 min a 2 horas a RT.
   8. Lávese las muestras 3 veces con 1 × PBS durante 15 minutos cada uno y montar las secciones vibratome en las diapositivas como se describe en la Sección 2.4.
4. Montaje vibratome secciones
   1. Preparar en otro portaobjetos para vibratome montaje cortando lonchas finas de doble stick y la colocación de la cinta a lo largo de los lados largos de las diapositivas.
   2. Coloque cuidadosamente 5-10 secciones vibratome entre la cinta de doble cara en las diapositivas en una gota de 100 l de PBS 1x.
   3. Desplegar todas las secciones y se extendió a cabo en una sola capa en toda la diapositiva.
   4. Elimine cualquier exceso de agarosa o trozos irregulares que impida un cubreobjetos de sentarse plana.
   5. Con cuidado, usar un pañuelo desechable de laboratorio para absorber el exceso de 1x PBS desde alrededor de las secciones vibratome.
   6. Añadir una gota de medio de montaje acuoso en la parte superior de las secciones de vibratome y luego cubreobjetos.
   7. Sellar el cubreobjetos sobre los portaobjetos con derretida valap aplica con un algodón.
   8. Imagen secciones vibratome a ambos un microscopio confocal vertical o invertida. Por favor refiérase a la discusión para más detalles sobre la selección de un sistema de imágenes.

3. imágenes en vivo de los intestinos enteros

Intestinos cosechado de fetuses después de E12.5, con el epiplón conectado deja intacto, desarrollar con éxito las vellosidades en la cultura con el sistema anterior. Por lo tanto, este sistema ex vivo permite la captura de imágenes de sección z vivo de los intestinos en desarrollo que pueden ser reconstruidas para una vista tridimensional de la morfogénesis en el tiempo.

1. La creación de imágenes en directo
   1. Utilice pegamento instantáneo para adherir una membrana de policarbonato individuo a una pantalla de malla fina. Esto proporciona un andamio de apoyo para mantener el intestino en su lugar debajo de la lente de inmersión de microscopio confocal vertical. Por favor refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la selección de los microscopios de imágenes en directo.
   2. Coloque la pantalla de malla en el centro de los pocillos de una placa de cultivo.
   3. Coloque el intestino diseccionado sobre la membrana de policarbonato y añadir una gota de pegamento instantáneo en cada extremo. Utilice sólo el pegamento suficiente para colocar el intestino, pero no abrigo!
   4. Añadir cultura libre medios de rojo fenol por debajo del policarbonatomembrana en el centro pocillo de la placa de cultivo.
   5. Añadir agua hasta el borde exterior de la placa de cultivo para proporcionar humedad.
   6. Desde el intestino fetal se somete a ondas peristálticas-como de contracción en cultivo, añadir 100 ml de una solución 1: 5 de xilazina en 1x PBS a 3 ml de medio para controlar el movimiento del intestino mientras que las imágenes. Esta dosis será controlar los movimientos intestinales por alrededor de 8-10 horas sin comprometer el desarrollo de las vellosidades.
   7. Para una vista transversal del intestino, incrustar los intestinos vivos en una solución de agarosa al 3-4% y cortar secciones gruesas (150-500 M) en un vibratome. Coincidir con la rigidez de la agarosa con la rigidez del intestino de ser cortado y determinado empíricamente la etapa de desarrollo. Por lo general, una solución de agarosa al 3% funciona bien para los intestinos menores de E14.5 y una solución al 4% funciona bien para los intestinos E15-E16.
   8. Pega las secciones vibratome a una membrana de policarbonato colocada en un tamiz de malla (como en la Sección 3.1.1) yla cultura como se describe en la Sección 3.1.2-3.1.6.
   9. Llevar a cabo la formación de imágenes en vivo usando un microscopio confocal de fluorescencia de dos fotones (láser de excitación entre 690-1,040 nm) en un soporte vertical con una tabla ajustable.
   10. Láser de dos fotones sintonizado a 900 nm proporciona una penetración profunda con la mejor resolución para las señales de las buenas prácticas agrarias. Reduce el daño a los tejidos, mientras que la formación de imágenes. Además, el establecimiento de la potencia del láser para la emisión más bajo posible reduce el daño del tejido. Típicamente para obtener una buena excitación de GFP, utilizar la energía 12% en el láser de dos fotones.

Resultados

Cultura de explantes enteros de intestinos fetales permite el análisis de la ubicación, la distribución, y la duración de las moléculas de señalización que coordinan el desarrollo intestinal, ya que este sistema permite la manipulación de la señalización con reactivos farmacológicos o proteínas recombinantes. El sistema de cultivo transwell (Figura 1A, reproducida de Walton et al., 2012) ² proporciona una interfaz aire-líquido, lo que hace posible colocar de drogas o de ...

Discusión

La naturaleza dinámica e interacciones de tejidos complejos del intestino en desarrollo requiere la visualización en 3D para tener una apreciación más completa de estos eventos morfogenéticos. Con la evolución de la tecnología de imagen, la capacidad de examinar las vellosidades morfogénesis en detalle está desarrollando / mejora y con ello, la comprensión de la comunicación espacial y la interacción durante la organogénesis es mucho mayor.

Los métodos alternativos para el cult...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416