Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Özet

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Özet

Fetal bağırsakta en morfogenetik süreçler gelişim aşamaları üzerinde değişikliklerin anlık sağlayarak, sabit dokuların ince kesitlerinin olayla edilmiştir. İnce Seri kesitlerde üç boyutlu bilgiler, çünkü mükemmel seri kesitler yeniden ve seri kesitler üzerinde dokusunun uygun yönünü sürdürmenin zorluğu yorumlamak zor olabilir. Tarafından Grosse ve ark. Son bulgular, 2011 bağırsak ¹ gelişmekte villuslarda morfogenetiğine anlamada üç boyutlu bilgilerin önemini vurgulamak. Tek başına etiketli bağırsak hücreleri üç boyutlu yeniden yapılandırma bağırsak epitel hücrelerinin çoğunluğu her iki en üst ve taban yüzeylerine temas gösterdi. Ayrıca, epitel apikal yüzeyinde aktin hücre iskeletinin üç boyutlu rekonstrüksiyon bağırsak lümen sürekli olduğunu ve ikincil lümen s bir eserdir olduğunu gösterdiectioning. Bu iki nokta, bağırsak epitelinde interkinetic nükleer göç gösteri ile birlikte, bir yalancı epiteli olarak gelişen bağırsak epiteli tanımlanmış ve önceden ¹ düşünce olarak tabakalı değil. Epitel üç boyutlu görebilme bu noktayı gösteren ve fetal bağırsakta epitel morfogenetiğine yeniden tanımlıyor ufuk açıcı oldu. Çoklu foton görüntüleme teknolojisi ve üç boyutlu rekonstrüksiyon yazılım evrimi ile, yeteneği hızla iyileştirilmesi organ geliştirmeyi, sağlam görselleştirmek için. İki foton uyarma yüksek çözünürlüklü dokulara daha az zarar penetrasyon derin verir. İki foton görüntüleme ve Walton vd. Tüm fetal fare bağırsak 3D rekonstrüksiyon 2012 villus akıbet ² deseni tanımlamak için yardımcı oldu. Burada izin vermek için bu kültür sisteminin villus ve uzantıları ex vivo gelişimi sağlayan bir bütün organ kültür sistemi açıklanmaktadırbağırsaklar üç boyutlu gelişim sırasında görüntülenmiş olması.

Giriş

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protokol

NOT: Tüm farenin Laboratuar Hayvan Hastalıkları Michigan Tıp Fakültesi Birimi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Üniversite Komitesi kurallarına göre protokollerini kullanarak insanca ele alındı.

1. Tüm Organ Kültür Sistemi

1. Medya ve kültür plakalarının hazırlanması
   1. Bir doku kültürü kaputu, stok şişe edilebilen BGJb ortamdan 5 ml kaldırmak ve Kalem / Strep 5 ml ekleyin. 5 mg / (Pen / Strep) ile edilebilen BGJb ortam 49 ml ml askorbik asit 1 ml ilave etmek suretiyle, 50 ml'lik konik bir tüp içinde bir ortam çalışma stok hazırlayın.
   2. Transwells her altında 1 ml ilave etmek suretiyle, bir 6 yuvalı kültür plakası hazırlayın.
      NOT: Tüm 6 transwells kullanılan değilseniz, daha sonra kullanmak üzere yeni bir steril 6 plaka ekstra transwells taşıyın. Üç adet 10 cm steril petri kutularının her birine edilebilen BGJb ortam çalışma 3 ml ilave edilir.
2. Diseksiyon için Hazırlık
   1. 70% Etal içinde diseksiyon araçları batırınve metanol çalışırken temiz araçları tutmak için emin olun.
   2. Büyük bir buz kovası ile diseksiyon alanı ayarlayın ve 6 kuyu kültür plaka ve buz üzerinde edilebilen BGJb medya ile 10 cm petri kapları yerleştirin. Diseksiyon ve kültür için bağırsakları hazırlarken mümkün olduğunca buz üzerinde çalışın.
   3. Fetal bağırsakların toplama için servikal dislokasyon izofluoran (100 ul) önce euthanization için olan bir oda içinde erişkin dişi fareler anestezi.
   4. Onların anneden fetusa hasat ettikten sonra, her fetusun dikkatli grafiği ¹³ evreleme Theiler göre düzenlerler. Rutin bir tek çöp içinde gözlenen gelişimsel aşamada kadar 24 saat varyasyonları olarak her fetusun yaşını belirlemek için post-koitus günlerde güvenmeyin.
3. Fetal bağırsak diseksiyonu
   1. Bağırsakların kaldırılması için önce, başı kesilerek fetüsleri Euthanize.
   2. Pla sonra 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) her bağırsak inceleyin veedilebilen BGJb ortamı çalışan bir 10 cm'lik bir petri kabı içine ce.
   3. Dikkatlice mide, dalak, mide ve oniki parmak bağırsağı üst elde edilen pankreasa, kaldırın.
   4. Yavaşça doğruldu bağırsak izin mümkün ve yalnızca yeterli bağlantılarını ayıran olduğunca bağlı omentum bırakmak için özen omentum ayırın.
      Not: yavaşça lümen içeriği bağırsak yoluyla akması ve kesik uçlarından çıkarılmasına imkan vermek için 3 eşit bölümlere ayırmak bağırsak bağırsak E14.5 daha büyük veya daha fazla olanlar, 24 saat daha kültive edilir için. Bununla birlikte, kültürlerin E13.5 önce, serozayı uygun bağırsak uzunluğu boyunca büyümeye izin bağırsak 3 kısımları ayıran önce kültürlenmesi kadar 24 saat sonra başladı bekleyin.
   5. Kültür plakası (1.1.2) transwells üzerine bağırsak parçaları aktarmak için bir ağız pipeti kullanılır.
   6. Onlar transwel genelinde düz böylece gerektiği gibi yavaşça bağırsakları yeniden konumlandırmakl.
      NOT: bağırsaklar tüp yoluyla lümen içeriğini hareket başladıktan sonra, bağırsakta herhangi bir karışıklığı bağırsağa bir yedekleme ve hasara neden olur.
4. Kültür ve tedavi
   1. , Transwell altından medyayı çıkarın transwell altında (ilave rekombinant proteinlerin veya farmakolojik inhibitörleri ile medya çalışma) tedavi medya 700 ul ekleyin.
   2. Bağırsakların üstüne tedavi medya damla damla 300 ul ekleyin ve transwell yoluyla bekletin. Gerekirse bağırsakları yerleştirin.
   3. Tedavi reaktif yarı ömrüne bağlı olarak en az günde bir kere ya da daha çok muamele ortam değiştirin.
5. Tedavi reaktif lokalize bir protein kaynağı batırılmış agaroz taneleri hazırlanması
   1. Kendi depolama kabı agaroz boncuklar tekrar ve 1.5 ml mikrofüj tüpüne agaroz boncuklarının 100 ul transfer.
   2. Steril 1x Ph borunun geri kalan hacim dolumunaosphate-tamponlu salin (PBS) ile yıkamak üzere, taneler üzerine karıştırın. Birkaç dakika boncuklar dibe ve daha sonra tanelerin üzerine PBS kapalı Pipeti izin vermek üzere askıya mikrofüj tüpü yerleştirin. Steril 1x PBS ile mikrofuge'ye tüp dolum ve iki kez daha yıkama işlemini tekrarlayın.
   3. Iki kez tedavi için istenen konsantrasyona ve ilgi konusu proteini hazırlayın.
   4. 2x Protein stoklar 5 ul ile yıkanmış agaroz boncuk 5 ul karıştırın ve yavaşça protein boncuk çalkalayın. Yavaşça, 10-15 dakika daha karıştırıldı, 1 saat boyunca buz üzerinde tüp yerleştirin.
   5. Bağırsakların boncuk yerleştirmeden önce steril 1x PBS kısaca boncuk durulayın.
6. Agaroz boncukları Yerleştirme
   1. Yavaşça çekilmiş kılcal iğneli bir ağız pipeti kullanılarak bağırsakların üst agaroz boncuklar yerleştirin. Kaba işleme bağırsaklara zarar ve yaralı bölgede villus gelişimini önleyecek şekilde aşırı ihtiyatla boncuk yerleştirin.
   2. Bağırsak peristaltik hareketleri ve kültür zamanla bağırsakların inecektir yerleştirilen boncuklar yaklaşık yarısını geçirecek beri analiz için gerekli iki katı kadar boncuk yerleştirin.
7. Kültürlü bağırsakların Fixation
   1. Dikkatle transwell alttan tedavi ortamı çıkarın ve 3 dakika boyunca havada kurumaya bağırsakları izin verir.
   2. Daha sonra tespit süresinin geri kalan kısmı için sabitleyici 2 ml bağırsağın üst kapağı, 2 dakika boyunca transwell altında fiksatif 1 ml ilave edilir. 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 2 saat süresince% 4 paraformaldehit O / N sabitleyin.

Sabit Bağırsaklar 2. Görüntüleme

1. Wholemount görüntüleme
   1. DPBS 1x 100 ul, bir lam üzerine (iç floresan ile) bütün bağırsak yerleştirin. Yavaşça bağırsaklara düzenlemek için forseps kullanın.
   2. Mo doku yapmak için dikkatli bir şekilde% 70 gliserol, 100 ul DPBS çıkarın ve hemen eklemek için bir laboratuar doku kullanınşeffaf yeniden ve görüntüleme olası derinliğini artırır.
      Not: bağırsağın başka penetrasyon isteniyorsa yerine% 70 gliserol içinde bağırsak Sabitleme, 10-30 dakika boyunca Odak sonuçları çözeltisinin bir kaç damla bağırsak ıslatın. Odak Temizle çözümü kapalı pipetlemeyin Mount Clear bağırsak monte edin.
   3. Modelleme kil içine lamel dört köşesinden her batırın ve bağırsak düzleştirme lamel tutmak için slayt ve kapak arasında ayırıcı olarak kullanmak için kil küçük bir miktar pick up.
   4. Bir pamuklu çubukla uygulanan erimiş valap ile slayt üzerine lamel mühür.
   5. Görüntü ya bir dik veya ters konfokal mikroskop bağırsaklar. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakınız.
2. (Bağırsak yapıların enine kesit görünümü için) sabit bağırsak vibratome kesit
   1. Küçük plastik kalıplar% 7 agaroz katıştırmak için bağırsak (10 x 10 x 15 mm), izin agaroz bloklarsoğumaya ve katılaşmaya.
   2. Anlık yapıştırıcı ile Vibratome toplama aşamasına plastik kalıp ve tutkal agaroz bloklardan agaroz blokları çıkarın.
   3. Buz gibi soğuk 1x DPBS toplama sahne doldurun.
   4. 100-150 um arasında bir kalınlıkta kesitler halinde kesilmiştir. Kalın kesitler kesiti içine derin görselleştirmek için (bölüm 2.1.2 açıklanan) takas çözümleri kullanın.
   5. 4 ° C de depolama için, bir 6-yuvalı plaka içinde bir kuyu içine toplama aşamasından vibratome bölümleri dökün.
3. Sabit, Vibratome kesitli dokuların İmmünofloresan boyanması
   1. 1x DPBS ile bir 24-yuvalı plaka içine, göz başına 5-12 vibratome bölümleri yerleştirin.
   2. 1x DPBS çıkarın ve oyuk başına geçirgenleştirme çözeltisi 500 ul ilave edin. Yavaşça oda sıcaklığında 25 dakika boyunca sallayın örnekleri.
   3. Geçirgenleştirmeden sonra, 1x PBS ile numuneleri 3 kere yıkayın.
   4. Bloke etme çözeltisi 500 ul içinde en az 30 dakika boyunca numune bloke eder.
   5. Engelleme, e sonraçözümü engelleme seyreltilmiş primer antikor 500 ul engelleme çözüm Xchange ve 4 ° CO / N de örnekleri tutmak.
      NOT: Dondurulmuş ve parafin bölümlerde işe birincil antikor dilüsyonları genellikle Ancak genellikle bu protokolü (örneğin, BrdU) ile iyi çalışmaz nükleer antijen alımı gerektiren antikorlar, çok Vibratome bölümlerde iyi çalışır.
   6. Ertesi gün, bloke etme çözeltisi ile 15 dakika boyunca numuneleri her 3 kez yıkayın.
   7. Yıkamadan sonra, bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş sekonder antikor, 500 ul de geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 saat 45 dakika boyunca örnekleri ışıktan korumak ve kaya florofor için alüminyum folyo ile 24 oyuklu plaka sarın.
   8. 15 dakika her biri için 1x PBS ile numuneleri 3 kez yıkayın ve Bölüm 2.4 'de açıklandığı gibi slaytlar üzerinde vibratome bölümleri monte edin.
4. Vibratome bölümleri Montaj
   1. Vibratome çift sti ince dilim keserek montaj için slaytlar hazırlayınck bant ve slaytlar uzun kenarları boyunca onları yerleştirerek.
   2. Dikkatle 1x PBS 100 ul bir damla slaytlar üzerinde çift kaset sopa arası 5-10 vibratome bölümleri yerleştirin.
   3. Tüm bölümlerini açın ve slaytta tek bir tabaka içine yayıldı.
   4. Düz oturan bir coverslip engelleyecek herhangi bir aşırı agarozun veya düzensiz parçalarını çıkarın.
   5. Dikkatle Vibratome bölümler etrafında aşırı 1x PBS kadar emmek için bir laboratuar doku kullanın.
   6. Vibratome bölümlerin üstüne monte sulu ortam bir damla ekleme ve sonra da lamel.
   7. Valap bir pamuklu çubukla uygulanan eritilmiş slaytlar üzerine lamelleri Seal.
   8. Görüntü ya bir dik veya ters konfokal mikroskop vibratome bölümleri. Bir görüntüleme sisteminin seçimi konusunda ayrıntılı bilgi için tartışmaya bakınız.

Tüm Bağırsaklar 3. Canlı Görüntüleme

Bağırsaklar fetuse hasatBağlı omentum sağlam sol s ile E12.5 sonra, başarıyla yukarıdaki sistemini kullanarak kültür içinde villus gelişir. Bu nedenle, bu ex vivo sistem zamanla morfolojilerinden bir üç boyutlu görünüm için yeniden olabilir gelişen bağırsak canlı z-bölüm görüntüler yakalama izin verir.

1. Canlı görüntüleme ayarlama
   1. Ince örgülü elek için tek bir polikarbonat membran bağlı anında tutkal. Bu dik konfokal mikroskop daldırma lens aşağıda yerinde bağırsak tutmak için bir destek iskele sağlar. Canlı görüntüleme mikroskoplar seçimi hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakınız.
   2. Merkezinde iyi bir kültür tepsisi içine elek yerleştirin.
   3. Polikarbonat membran üzerine disseke bağırsak yerleştirin ve her iki ucunda anlık tutkal bir damla ekleyin. Bağırsak tutturmak için yalnızca yeterli tutkal kullanın, ama ceket o!
   4. Polikarbonat altında fenol kırmızısının kültür ortamı ücretsiz eklentiMerkezi de kültür plakasında membran.
   5. Nem temin etmek üzere kültür plakasının dış kenarı için su ilave edilir.
   6. Görüntüleme sırasında bağırsak hareketini kontrol etmek için ortam 3 ml 1 x PBS'de ksilazin 5 çözeltisi: fetal barsak kültürde peristaltik kasılma benzeri dalgalar maruz kaldığından, 1 100 ul ilave edin. Bu dozaj villus gelişimini ödün vermeden yaklaşık 8-10 saat bağırsak hareketlerini kontrol edecek.
   7. Bağırsağın bir enine görünüm için, 3-4% agaroz çözeltisi içinde canlı bağırsakları gömmek ve bir vibratom kalın kesitler (150-500 mikron) kesilir. Kesilmiş olarak, bağırsak sertliğe sahip agaroz sertliğini maç ve ampirik olarak bir gelişme aşamasındaki belirlenir. Genellikle,% 3 agaroz çözüm E14.5 daha genç bağırsaklar için iyi çalışır ve% 4 çözelti bağırsaklar E15-E16 için iyi çalışır.
   8. (Kısım 3.1.1 gibi) gözenekli bir elek tutturulmuş bir polikarbonat membran vibratome bölümleri ve TutkalKültür olarak Bölüm 3.1.2-3.1.6 tarif edilmiştir.
   9. Ayarlanabilir bir tablo ile dik bir stand üzerine bir iki-foton konfokal floresan mikroskop (690-1,040 nm arasında uyarma lazer) kullanılarak canlı görüntüleme Davranış.
   10. İki foton lazer GFP sinyalleri için en iyi çözünürlük ile derin penetrasyon sağlar nm 900 ayarlı. Görüntülenir iken bu dokulara zarar azaltır. Buna ek olarak, mümkün olan en düşük emisyon için lazerin gücünü ayarlayıcı, doku hasarı azaltır. Tipik olarak, GFP iyi bir uyarma elde iki foton lazer% 12 güç kullanmak.

Sonuçlar

Bu sistem farmakolojik reaktifler veya rekombinant proteinleri ile sinyalizasyon manipülasyon sağlayan fetal Bağırsakların tüm eksplantlarının Kültür, bağırsak gelişimini koordine sinyal moleküllerinin konumu, dağılımı ve süresi analizler için izin verir. (Walton ve ark yeniden Şekil 1A., 2012) Transwell kültür sistemi ² mümkün doku üzerine ilaç veya proteini batırılmış agaroz boncuklar yerleştirmek ve böylece lokal sinyal kaynaklarının bir...

Tartışmalar

Dinamik yapısı ve gelişen bağırsak karmaşık doku etkileşimleri bu morfogenetik olayların tam bir takdir 3D görselleştirme gerektirir. Görüntüleme Gelişen teknolojiye, yetenek / gelişmekte iyileştirilmesi ve onunla, organogenezis sırasında mekansal iletişim ve etkileşim anlayışı oldukça gelişmiş edilir detaylı olarak villus morfogenetiğine incelemek.

Bütün bağırsakları kültürü için alternatif yöntemleri de test edilmiştir, ancak Transwell sistem uzun k?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416