에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

요약

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

초록

태아 소장에서 대부분의 형태 형성 과정은 발달 단계를 통해 변화의 스냅 샷을 제공하는 고정 된 조직의 얇은 섹션에서 유추되고있다. 얇은 시리얼 섹션에서 세 가지 차원 정보로 인해 완벽하게 시리얼 섹션을 재구성 시리얼 섹션을 통해 조직의 올바른 방향을 유지의 어려움의 해석에 도전 할 수 있습니다. 그로 의해 외. 최근 연구 결과, 2011은 ^한 부위의 현상 융모의 형태 형성을 이해 삼차원 정보의 중요성을 강조. 단독 표지 장 세포의 3 차원 재구성은 장 상피 세포의 대부분은 모두 혀끝과 기저 표면에 문의하는 것이 보여 주었다. 더욱이, 상피의 선 단면에서 액틴 세포 골격의 삼차원 재구성 장내 루멘 연속이며 그 보조 루멘 (S)의 이슈임을 입증ectioning. 그 두 점은, 장 상피 세포에서 interkinetic 핵 마이그레이션 시연과 함께 pseudostratified 상피 세포로 개발하는 장 상피 세포를 정의하고 이전에 ^{한 생각으로} 계층화 없습니다. 상피 세 차원을 관찰 할 수있는 능력은이 점을 증명하고 태아 소장에서 상피 형태 형성을 재정에 정액이었다. 다중 광자 이미징 기술 및 3 차원 재구성 소프트웨어의 발전으로, 능력은 급속히 향상되고 장기 개발, 그대로 시각화. 이광자 여기는 고해상도 조직에 덜 파괴적인 침투를 깊게한다. 두 광자 이미징 및 월튼 등.에 전체 태아 마우스 내장의 3 ​​차원 복원은 2012 융모 ^{파생물이의} 패턴을 정의하는 데 도움을 주었다. 여기에서는 허용하도록 그 배양 시스템의 융모와 확장 생체 개발을 허용 전체 기관 배양 시스템을 설명창자는 세 가지 차원으로 자신의 개발 기간 동안 이미지를 만들 수 있습니다.

서문

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

프로토콜

참고 : 모든 쥐가 실험 동물 의학 미시간 의과 대학 단위의 대학의 승인을 동물의 사용 및 관리에 대학위원회의 지침에 따라 프로토콜을 사용하여 인도적으로 처리 하였다.

1 전체 장기 문화 시스템

1. 미디어 및 문화 판의 제조
   1. 조직 배양 후드에서 스톡 병 BGJb 매체 5 mL를 제거하고, 펜 / 스트렙토 5 mL를 추가한다. 5 밀리그램 / (PEN / 스트렙토)와 BGJb 매체의 49 ml의 아스코르브 산 1 ㎖를 첨가하여, 50 ㎖의 원뿔형 튜브에 미디어 콘텐츠의 작업을 준비한다.
   2. 트랜스 웰 아래의 각각 1 ㎖에 첨가하여 6 웰 배양 플레이트를 준비한다.
      참고 : 모든 6 트랜스 웰을 사용하지 않을 경우, 나중에 사용하기 위해 신선한 무균 6 웰 플레이트에 추가 트랜스 웰을 이동합니다. 세 10cm 무균 배양 접시에 각각 BGJb 미디어를 작업의 3 ML을 추가합니다.
2. 해부를위한 준비
   1. 70 % etha에서 해부 도구를 적시와 NOL 작업하는 동안 청소 도구를 보관하십시오.
   2. 큰 얼음 양동이 해부 영역을 설정하고 6 웰 배양 판과 얼음에 BGJb 미디어와 10cm 배양 접시를 놓습니다. 해부와 문화에 대한 장을 준비하는 동안 가능한 한 많은 얼음에 작업 할 수 있습니다.
   3. 태아 창자 수확 용 자궁 전위에 의해 이소 플루오 란 (100 μL) 이전 euthanization에 함께 실에서 성인 여성 생쥐를 마취.
   4. 자신의 어머니로부터 태아를 수확 한 후, 각각의 태아가 신중하게 차트 ^13을 준비 Theiler에 따라 무대. 정기적으로 하나의 쓰레기 내에서 관찰되는 발달 단계에서 최대 24 시간의 변화에​​ 각 태아의 나이를 결정하는 포스트 성교 일에 의존하지 마십시오.
3. 태아 내장의 해부
   1. 창자를 제거하기 전에 잘린 태아를 안락사.
   2. 괞 찮아 후 1 배 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 각 장을 해부BGJb 미디어 작업과 10cm 페트리 접시로 CE.
   3. 조심스럽게 배에서 비장과 위장과 상부 십이지장에서 췌장을 제거합니다.
   4. 부드럽게 소장은 곧게 할 수 있도록 가능한 한만큼의 연결을 분리 한 많이 붙어있는 대망을 떠나 돌보는 대망 구분합니다.
      참고 : 부드럽게 내강 내용이 소장을 통과하고 절단 끝에서 추방 할 수 있도록 세 동일한 세그먼트로 장을 분리 장 E14.5보다 나이 또는 사람들은 더 이상 24 시간 이상 배양하고 들어. 그러나, 배양을 위해 E13.5에 앞서, 장막 제대로 소장의 길이에 걸쳐 확장 할 수 있도록 부위의 3 세그먼트를 분리하기 전에 배양 한 후 24 시간까지 기다린 시작했다.
   5. 문화 판 (1.1.2)의 트랜스 웰에 장 조각을 전송하기 위해 입 피펫을 사용합니다.
   6. 그들은 transwel에 걸쳐 직선이되도록 필요에 따라 조심스럽게 내장의 위치를리터.
      주 : 창자가 튜브를 통해 내강 내용을 이동 시작하면 장에있는 꼬임 장에 백업 및 손상의 원인이됩니다.
4. 문화 및 치료
   1. , 트랜스 웰 아래에서 용지를 제거 트랜스 웰에서 (추가 재조합 단백질이나 약물 억제제와 미디어 작업) 치료 미디어 700 μl를 추가합니다.
   2. 내장의 상단에 치료 미디어 적가의 300 μl를 추가하고 트랜스 웰을 흡수 할 수 있습니다. 필요에 따라 내장 위치를​​ 조정합니다.
   3. 치료 시약의 반감기에 따라 적어도 하루에 한 번 또는 더 자주 치료 미디어를 변경합니다.
5. 치료 시약의 지역화 된 소스 단백질 젖 아가 로스 비드의 제조
   1. 스토리지 컨테이너에 아가로 오스 비즈를 재현 탁하고, 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 아가 로스 비드의 100 μl를 전송합니다.
   2. 멸균 1X pH가 튜브의 남은 볼륨을 채우기osphate 완충 식염수 (PBS)와 그들을 씻어 구슬을 섞는다. 몇 분 구슬이 바닥에 정착 한 후 구슬의 상단에에서 PBS를 피펫 할 수 있도록하는 랙에 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다. 멸균 1X PBS와 미세 원심 분리 튜브를 채우고 두 번 더 세척 과정을 반복합니다.
   3. 두 번 치료를 원하는 농도로 관심의 단백질을 준비합니다.
   4. 배 단백질 주식의 5 μL로 세척 아가로 오스 비드 5 μl를 혼합하고 부드럽게 단백질 구슬을 선동. 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 혼합, 1 시간 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
   5. 장내에 구슬을 배치하기 전에 멸균 1X PBS에 잠시 구슬을 씻어.
6. 아가로 오스 구슬의 배치
   1. 부드럽게 당겨 모세관 바늘 입 피펫을 사용하여 내장의 상단에있는 아가로 오스 비드를 배치합니다. 거친 취급 장에 손상을 부상당한 지역에 융모 발달을 차단하므로 매우주의 구슬을 놓습니다.
   2. 창자의 연동 운동과 배양 시간이 지남에 따라 내장의 롤 오프한다 배치 된 구슬의 절반 정도를 받아야하기 때문에 분석에 필요한 두 배나 많은 구슬을 놓습니다.
7. 배양 내장의 고정
   1. 조심스럽게 트랜스 웰 아래에서 치료 용지를 제거하고 3 분 동안 건조한 공기에 내장 할 수 있습니다.
   2. 다음, 정착 시간의 나머지 정착액 2 ㎖와 소장의 상부 커버, 2 분 동안 트랜스 웰 아래 정착액 1 ㎖를 추가한다. 4 ° C 또는 실온에서 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 O / N으로 수정합니다.

고정 창자의 2 이미징

1. Wholemount 영상
   1. 1X DPBS 100 ㎕와 슬라이드 (내생​​ 형광 포함) 전체 창자를 놓습니다. 부드럽게 장을 마련하기 위해 집게를 사용합니다.
   2. 조직 개월을주의 깊게 70 % 글리세롤 100 μl를 DPBS를 제거하고 즉시 추가 실험실 조직을 사용하여투명 재 및 이미징의 가능한 깊이를 증가시킨다.
      NOTE : 소장의 상기 관통 원하는 경우, 대신에 70 % 글리세롤에 실장 부위에, 10 ~ 30 분 동안 초점 클리어 용액 몇 방울의 소장 소크. 초점 클리어 솔루션을 피펫 및 마운트 클리어와 장을 마운트합니다.
   3. 모델링 점토로 커버 슬립의 네 모서리를 각각 담궈 부위를 평탄화로부터 커버 슬립을 유지하는 슬라이드 및 커버 슬립 사이에 스페이서로서 사용하는 점토를 소량 픽업.
   4. 면봉으로 적용 녹은 VALAP와 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉합니다.
   5. 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 내장. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
2. (장 구조의 단면도에 대한) 고정 장의 Vibratome의 절편
   1. 작은 플라스틱 금형 7 % 아가로 오스에 포함 된 장에 (10 × 10 × 15mm) 허용 아가로 오스 블록냉각 및 응고.
   2. 순간 접착제와 vibratome 수집 단계에 플라스틱 금형 및 접착제 아가로 오스 블록에서 아가로 오스 블록을 제거합니다.
   3. 얼음 차가운 1X DPBS와 컬렉션 무대를 채 웁니다.
   4. 100 ~ 150 μm의 사이에 두께 부분을 잘라. 두꺼운 부분은 단면에 깊은 시각화 (2.1.2 참조) 청산 솔루션을 사용하십시오.
   5. 4 ° C에서 저장을위한 6 웰 플레이트의 우물에 수집 단계부터 vibratome 섹션을 붓는다.
3. 고정 vibratome 단면 조직의 면역 형광 염색
   1. 1X DPBS와 함께 24 웰 플레이트에 잘 당 5-12 vibratome 섹션을 배치합니다.
   2. 1X DPBS를 제거하고 잘 당 permeabilization 용액 500 μl를 추가합니다. 부드럽게 실온에서 25 분 동안 샘플을 바위.
   3. permeabilization 후 1X PBS로 샘플을 3 회 씻는다.
   4. 차단 솔루션의 500 μL에 적어도 30 분 동안 샘플을 차단합니다.
   5. 차단, 전자 후차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μL와 차단 솔루션을 체인지와 4 ° CO / N에서 샘플을 유지합니다.
      참고 : 냉동 식품 및 파라핀 섹션에서 잘 작동 차 항체 희석은 일반적으로 그러나 일반적으로 프로토콜 (예를 들어, BrdU의) 잘 작동하지 않는 핵 항원 검색을 필요로하는 항체도 vibratome 섹션에서 잘 작동합니다.
   6. 다음 일, 차단 솔루션으로 15 분 동안 샘플 때마다 세 번 씻는다.
   7. 세안 후, 차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μl를 적용합니다. 실온에서 2 시간 45 분 동안 샘플을 빛으로부터 형광을 보호하고 바위에 알루미늄 호일에 24 웰 플레이트를 감싸.
   8. 15 분마다 1X PBS로 샘플을 3 회 세척하고 2.4 절에 설명 된대로 슬라이드 vibratome 섹션을 탑재합니다.
4. vibratome 섹션을 장착
   1. vibratome 두 번 STI의 얇은 조각을 절단하여 장착 슬라이드를 준비CK 테이프와 슬라이드의 긴 측면을 따라 그들을 배치.
   2. 조심스럽게 1X PBS 100 ㎕의 드롭 슬라이드에 두 번 스틱 테이프 사이에 5 ~ 10 vibratome 섹션을 배치합니다.
   3. 모든 섹션을 펼치고 슬라이드에 걸쳐 단일 층으로 그들을 밖으로 확산.
   4. 평면 앉아에서 커버 슬립을 방지 할 수 초과 아가로 오스 또는 고르지 않은 비트를 제거합니다.
   5. 조심스럽게 vibratome 섹션 주위에서 초과 1X PBS를 흡수하기 위해 연구소 조직을 사용합니다.
   6. vibratome 부 위에 장착 수성 매질의 드롭을 추가 한 후 커버 슬립.
   7. VALAP가 면봉으로 적용 용융와 슬라이드로 된 커버를 밀봉.
   8. 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 vibratome 섹션. 영상 시스템의 선택에 대한 더 자세한 설명을 참조하십시오.

전체 창자의 3 라이브 영상

창자 fetuse에서 수확연결된 대망가 그대로 유지와의 E12.5 후, 성공적으로 위의 시스템을 사용하는 문화에 융모을 개발한다. 따라서이 시스템은 생체 시간 경과 형태 형성의 3 차원 뷰를 위해 재구성 될 수있는 현상 장의 라이브 Z 단면 영상의 캡쳐를 허용한다.

1. 라이브 영상 설정
   1. 좋은 메쉬 화면으로 개별 폴리 카보네이트 막을 부착 순간 접착제를 사용합니다. 이 수직으로 공 초점 현미경의 침지 렌즈 아래 장소에 소장을 보유하는 지원 발판을 제공합니다. 라이브 영상 현미경의 선택에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
   2. 중앙 잘 문화 판에 메쉬 스크린을 놓습니다.
   3. 폴리 카보네이트 막에 해부 장을 놓고 양쪽 끝에 순간 접착제 한 방울을 추가 할 수 있습니다. 장을 부착시킬만큼의 접착제를 사용하지만 코트 그것!
   4. 폴리 카보네이트 아래 페놀 레드의 문화 미디어 무료 추가중심도의 문화 판에서 막.
   5. 습도를 제공하도록 배양 플레이트의 외연에 물을 첨가.
   6. 이미징 동안 대장의 움직임을 제어하는​​ 미디어 3 ㎖에 1X PBS에서 자일 라진 (xylazine)의 다섯 솔루션 : 태아 소장은 문화 수축의 연동과 같은 파도를 겪는 때문에, 하나의 100 μl를 추가합니다. 이 투여 량은 융모 발달을 손상시키지 않고 약 8 ~ 10 시간 동안 장 움직임을 제어합니다.
   7. 소장의 가로보기의 경우, 3 ~ 4 % 아가로 오스 솔루션의 라이브 창자를 포함하고 vibratome에 두꺼운 부분 (150 ~ 500 μm의) 잘라. 절단되는 소장의 강성 아가로 오스의 강성을 일치하고 경험적으로 발달 단계를 결정했다. 일반적으로, 3 % 아가로 오스 솔루션은 E14.5 미만의 창자에서 잘 작동하고 4 % 용액은 창자 E15-E16에 적합합니다.
   8. (섹션 3.1.1에서와 같이) 메시 스크린에 부착 된 폴리 카보네이트 멤브레인 vibratome 섹션을 붙인문화는 제 3.1.2-3.1.6에서 설명.
   9. 동조 테이블 직립 스탠드 이광자 형광 공 초점 현미경 (690-1,040 nm의 사이 여기 레이저)를 이용하여 실시간 이미징을 수행.
   10. 이광자 레이저 GFP 신호 최상의 해상도 깊은 용입을 제공 내지 900에 동조. 이미징 동안은 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또한, 가능한 최저로 발광 레이저의 파워를 설정하는 조직 손상을 줄여 준다. 통상적으로, GFP의 좋은 자극을 구하는 이광자 레이저에 12 % 전력을 사용한다.

결과

이 시스템은 약리학 적 시약 또는 재조합 단백질과 시그널링의 조작을 가능으로 태아 내장의 전체 이식편의 배양은, 장 개발 좌표 시그널링 분자의 위치, 분포, 및 지속 시간의 분석을 허용한다. (월튼 외로부터 재생도 1a., 2012) 트랜스 웰 배양 시스템 ^(2)은 가능한 조직에 약물이나 단백질 침지 아가 로스 비드를 배치함으로써, 로컬 신호 원을 확립하게 공기 - 액?...

토론

동적 특성 및 개발 소장의 복잡한 조직 상호 작용은 이러한 형태 발생 이벤트의 전체 감사의 마음을 가지고 3D 시각화가 필요합니다. 이미징 기술 진화로, 능력 개발 / 개선과 함께, 기관 형성기 동안 공간 의사 소통과 상호 작용의 이해가 크게 향상되어 자세히 융모 형태 형성을 검사합니다.

전체 창자 배양 방법에 대해서도 테스트되었지만, 트랜스 웰 시스템은 긴 배양 시간?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416