Un nuevo modelo de leve lesión cerebral traumática para ratas jóvenes

Resumen

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Resumen

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introducción

Aunque hay muchos métodos ampliamente utilizados para la generación de moderada a severa lesión cerebral traumática (TBI), muy pocos se han desarrollado técnicas para inducir leve, cerrado heridas en la cabeza en los roedores. Debido al hecho de que la lesión cerebral traumática leve (LCTL) es tres veces más común que la lesión cerebral moderada y severa combinada ^1, se necesita un modelo fiable de LCTL para facilitar la investigación en relación con la fisiopatología, los resultados neurobiológicos y de comportamiento, y estrategias terapéuticas. Por ejemplo, debido en parte a las limitaciones de los modelos animales actuales ^2, en la última década ha habido más de 200 fallidos ensayos clínicos con medicamentos para el tratamiento de TBI ^3. Cuando los sistemas de modelado se generan para los estudios de investigación traslacional, la aplicabilidad de los resultados dependen de la validez del modelo implementado. Para el estudio de LCTL / conmoción cerebral, un modelo animal fiable no sólo imitar la fuerzas biomecánicas responsable de etiología lesión, sino que también inducen síntomas consistentes con los reportados por la población clínicamente relevante. Además, dado que los niños están en riesgo particularmente alto de LCTL, sistemas de modelado óptimo sería aplicable a los roedores jóvenes y menores de edad, además de sus equivalentes adultos.

Análisis biomecánicos de circunstancias en las que los atletas han sufrido mTBIs o lesiones cerebrales concussive indican que los factores predictivos más críticos para la lesión son la aceleración rápida y cabeza impactos de alta energía ^4. La mayoría de los modelos de roedores actualmente empleados para la inducción de TBI permite poco o ningún movimiento de la cabeza ⁵ (para revisión ver ^2). El modelo descrito aquí, entrega un impacto de alta velocidad a la cabeza de una rata juvenil físicamente desenfrenada que se acompaña de una rotación de 180 ° y la caída libre que aplica fuerzas de aceleración / deceleración a la cabeza y el cuerpo del sujeto. Taquí son dos ventajas principales asociados a esta técnica de caída de peso modificado para la inducción de LCTL. En primer lugar, el modelo produce conmoción clínicamente relevante como sintomatología sin causar un daño claro al cerebro (para una descripción completa de los resultados conductuales ver ^6). También en consonancia con los informes clínicos de síndrome post-conmoción, esta técnica peso soltar modificado produce resultados heterogéneos. Aunque los efectos de la LCTL son significativas, existe una variación considerable entre los roedores que experimentaron una LCTL cuando se examina en múltiples medidas de resultado. En segundo lugar, el método permite el estudio de LCTL repetitivo ^7. Como la mayoría de los modelos de TCE existentes infligir tales lesiones graves, a menudo es difícil para inducir una segunda lesión, y casi imposible estudiar TBI repetitiva sin grandes daños a toda la corteza.

Por lo tanto, la razón principal para el uso de la técnica de caída de peso modificado para la inducción de LCTL es producir una lesión que representa más de cerca la patofisiología y sintomatología de la conmoción cerebral y repetitivo TBI en poblaciones juveniles. Con la creciente incidencia de LCTL relacionado con los deportes, caídas, y accidentes automovilísticos, especialmente durante la infancia, este modelo roedor única de LCTL proporciona a los investigadores una herramienta valiosa para el estudio de la lesión cerebral conmoción similar que se puede aplicar fácilmente a múltiples hit paradigmas.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por la Universidad de Calgary, Comité de Ética de los Animales.

1. Cría y Preparación de los animales

1. Ordene ratas embarazadas de proveedores de animales de laboratorio estándar o cachorros de razas en la casa de acuerdo con los protocolos de reproducción estándar.
2. Casa todos los animales con acceso ad libitum a la comida y el agua, en una rata habitación vivienda temperatura controlada (21 ° C), que se mantiene en una luz 12:12 h: oscuridad ciclo.
3. Cuando las crías alcanzan postnatal día 21 (P21), destetar las crías de sus madres y casa en grupos del mismo sexo de 3 o 4.

2. Establecimiento de leve lesión cerebral traumática (LCTL) Aparato

1. Antes de iniciarse el procedimiento, los pesos de molino a la masa deseado (por ejemplo, 150 g). Fije seguramente un asa de metal en el extremo superior del peso permitiendo a la línea de pesca a ser fijo al peso.
2. Puntuación papel de aluminio con una cuchilla afilada. Asegúrese de que el papel de aluminio marcado soporta el peso corporal de la rata, pero no va a interferir con la aceleración de la rata después de impacto de la cabeza con el peso.
3. Tape la lámina de estaño marcado a la etapa en forma de U hecho de plástico transparente (38 x 27 x 27 cm ³⁾ que contiene una esponja de recogida (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (Figura 1), de modo que es tensa.
4. Coloque la etapa de plástico en forma de U en la posición correcta debajo del tubo de guía hecha de plástico transparente.
5. Mantenga el tubo de guía de plástico (2,2 cm de diámetro x 1,5 m) en su lugar con un soporte de abrazadera y posicionar el tubo de guía de manera que es 3,5 cm por encima de la lámina de estaño marcado.
6. Fije la línea de pesca a través del bucle de metal para el peso asegurando que la parte inferior de el peso cuelgue libremente 2,5 cm por encima de la lámina de estaño marcado.
7. Sujete con firmeza la línea de pesca en el soporte de sujeción.
   NOTA: Anclaje a red el peso de la almejap soporte a una altura de 2,5 cm por encima del papel de aluminio impide re-hits, mientras que la rata está cayendo por el impacto de la esponja colección).
8. Tire el peso hacia arriba a través del tubo guía de plástico con la línea de pesca y mantenerlo en su lugar con un pin de llave allen de 1,0 m.

3. Inducción de LCTL

1. Cuando las ratas llegan P30 jaulas Colócate en la sala de procedimiento.
2. Coloque ratas en una cámara de isoflurano y ligeramente anestesiar la rata hasta que no responde a una pata o la cola pellizco.
3. Coloque rápidamente la rata pecho abajo en el papel de aluminio anotado con su cabeza directamente en la trayectoria de la caída de peso. Véase la Figura 2. Si la rata comienza a moverse o despertar antes de que pueda ser colocado en la hoja de la lata marcado, volver a la cámara de isoflurano hasta que no responden a una pata o la cola pellizco y comenzar de nuevo.
4. Tire del pasador de llave Allen, permitiendo que el peso caiga verticalmente a través del tubo de guía de plástico y golpear la rata en la cabeza. The rata se someterá a una rápida rotación y tierra 180 ° en la posición supina.
5. Retirar inmediatamente la rata de la esponja recogida y aplicar lidocaína tópica a la cabeza de la rata con un aplicador de punta de algodón.
6. Coloque la rata en la posición supina en una jaula limpia que se calienta mediante el establecimiento de que sobre una almohadilla de calefacción disponible comercialmente.
7. Con un cronómetro o temporizador digital adquirir el "time-to-derecha". Tiempo a derecha es el tiempo empleado por la rata de despertar de la anestesia y la vuelta de la posición supina a la posición prona o comience a caminar.
8. Volver a la rata a su casa-jaula después de que se ha recuperado el comportamiento normal (asearse, caminar, explorar, etc.).
9. Repita los pasos 3.2 a 3.8 para cada rata adicional que requiere una LCTL.
10. Repita el procedimiento en la misma rata en múltiples puntos de tiempo para experimentos repetitivos LCTL.

4. Inducción de la Lesión Sham

1. Ligeramente anesthetize la rata con isoflurano hasta que no responde a una pata o la cola pellizco.
2. Coloque rápidamente la rata pecho abajo en el papel de aluminio anotado con su cabeza directamente en la trayectoria de la caída de peso.
3. Retire la rata de la hoja de la lata sin tira de la pata llave allen del tubo guía de plástico y aplicar lidocaína tópica a la cabeza de la rata con un aplicador con punta de algodón.
4. Coloque la rata en la posición supina en una jaula limpia que se calienta mediante el establecimiento de que sobre una almohadilla de calefacción disponible comercialmente.
5. Use un cronómetro o temporizador digital para adquirir el "time-to-derecha".
6. Volver a la rata a su casa-jaula después de que se ha recuperado el comportamiento normal (asearse, caminar, explorar, etc.).

5. Verificación de LCTL con la prueba de marcha de la viga ⁸

1. 24 horas después de la inducción de la LCTL o animales retorno lesión simulada a la sala de procedimiento.
2. Transferir las ratas a una explotación jaula limpiay colocar el hogar de jaula de la rata en el extremo más estrecho de los 165 cm de haz tal que la parte abierta de la casa de jaula enfrenta el extremo más estrecho del haz cónico.
   NOTA: El haz cónico es de 165 cm de largo. La plataforma del centro de la viga tiene una anchura de 6 cm en el extremo ancho y 1,75 cm en la parte más estrecha. La viga central tiene repisas (2 cm de ancho y 2 cm por debajo de la viga central) que proporcionan la seguridad cuando se resbala de la rata. Coloque el acolchado de espuma debajo de la viga de reducir el riesgo de lesiones en las ratas que pueden caer fuera de la viga durante la prueba.
3. Colocar una cámara de vídeo en el extremo ancho de la viga cónica y la posición / zoom de la cámara de vídeo para garantizar que el investigador viendo el vídeo puede ver claramente los movimientos de la rata para toda la longitud de la viga cónica.
4. Coloque la rata en el extremo ancho del haz cónico y animarla a caminar a través de la viga a su casa-jaula. Una vez que la rata cruza el haz cónico, deje la rata en su casa-jaula durante al menos 60 segundos para reinForce la ubicación de destino. Esto es Trial # 1 y no se incluye en el análisis.
5. Encienda la cámara de vídeo y permite la rata para completar la tarea haz de caminar 4 veces más (manteniendo los períodos de refuerzo 60 seg en la jaula de alojamiento). Una vez que la rata ha completado todos los ensayos, volver a la rata a su casa-jaula.
6. Para anotar, registrar el número de la pierna-pie se desliza traseras que se producen y el tiempo / duración de cruzar la viga, para cada ensayo individual. Utilizar estos datos para calcular el número medio de la pierna-pie resbalones y traseras tiempo para cruzar el haz para cada rata.

Resultados

La técnica peso soltar modificado descrito anteriormente es un método fiable para la inducción de la lesión cerebral traumática leve (LCTL) en ratas jóvenes. Utilizando un peso impacto de 150 g, esta técnica se ha aplicado con éxito en ratas jóvenes, que van desde 50 hasta 120 g. Además, el procedimiento se puede repetir fácilmente en los mismos animales para el estudio de repetitivo LCTL. Aunque los animales que experimentan una sola exhibición LCTL un aumento en el tiempo de lanzamiento al derecho (Figura 3), aparezcan sorprendieron al despertarse, que reanuden rápidamente las actividades normales y son visualmente indistinguibles de los animales sham-heridos. Dado que la lesión es leve, lidocaína tópica que elimina cualquier dolor asociado con el impacto de mirar, es el único analgésico necesario. Esto es importante para la investigación como se conoce a medicamentos para el dolor de interferir con los procesos inflamatorios y recuperación típicas. Debido a la falta de sintomatología manifiesta, la tarea de balancín es un fiable paraol que se puede utilizar para validar la inducción de la LCTL. Es importante tener en cuenta, que no todos los animales que experimentan un LCTL exhibirán los déficits en la tarea de balancín, pero como grupo, las ratas jóvenes con un LCTL demostrar la pierna-pie se desliza mucho más traseras cuando se compara con ratas jóvenes con una lesión simulada (Figura 4).

Otra característica clave de esta técnica peso soltar modificado es la falta de restricción aplicada a la rata de menores durante la inducción de la lesión. Mediante la entrega de un golpe de refilón a la cabeza seguido de una rápida aceleración rotacional y desaceleración, este modelo representa más de cerca las fuerzas biomecánicas atribuidos a LCTL y conmoción cerebral. Cuando se aplica este procedimiento a ratas jóvenes o ratones adultos, las tasas de mortalidad son extremadamente bajos (7/202 animales jóvenes ~ 3,4% de tasa de mortalidad), y fractura de cráneo y hemorragia intracraneal son excepcionalmente raros ^6,7. Además, el modelo produce sy clínicamente relevantemptomology. Roedores menores que experimentaron una sola LCTL demostraron déficits de equilibrio y de motor comportamientos, junto con déficits en la función ejecutiva, el aumento de los comportamientos depresivos similares, y las interacciones sociales alteradas ^6,9. Del mismo modo, los ratones adultos también muestran déficits de equilibrio y coordinación leves que se recuperan con el tiempo ^7. Finalmente, la inducción de LCTL el uso de este modelo requiere anestesia mínimo y no implica la preparación quirúrgica o madriguera en el cráneo. Resultados por lo tanto no están sesgadas por confusión efectos inflamatorios o inmunológicos desencadenados por la cirugía o anestesia. Además, el tiempo de recuperación rápida y la falta de heridas abiertas permite el inicio de los paradigmas de ensayo adicionales que se produzca poco después de roedores experimentan el LCTL.

Figura 1: > C artoon representación de la forma de U etapa de plástico y la recogida de esponja con todas las dimensiones pertinentes. Una distancia de 10 cm debe mantenerse entre la esponja recogida y la parte superior de la etapa de plástico para garantizar la rata juvenil tiene tiempo suficiente para completar el 180 rotación °.

Figura 2: (A) la representación fotográfica de la plataforma de la inducción de la lesión. La rata juvenil se coloca en el pecho abajo en el papel de aluminio anotado para que la cabeza está directamente debajo del peso que cae. (B) Vista lateral de la plataforma de la inducción de lesiones. (C) la demostración fotográfico del peso utilizado en la inducción de la LCTL .

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Figura 3: Representación gráfica de las diferencias promedio en el tiempo a derecha entre ratas jóvenes que experimentaron un solo LCTL y ratas jóvenes que experimentaron una lesión simulada (* p <0,01) Las ratas que recibieron una exposición LCTL un aumento significativo en el. duración de tiempo necesario para enderezarse desde la posición supina.

Figura 4: Representación gráfica de la media de la pierna-pie se desliza traseras exhibidos en la tarea Walking Beam de ratas jóvenes que experimentó un solo LCTL y ratas jóvenes que experimentaron una lesión simulada (* p <0,05).

Discusión

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad - 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory