Un modèle Roman de lésions cérébrales traumatiques légères pour les jeunes rats

Résumé

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Résumé

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introduction

Bien qu'il existe de nombreuses méthodes largement utilisé pour la génération de la forme modérée à sévère lésion cérébrale traumatique (TBI), très peu de techniques ont été développées pour induire doux, fermé blessures à la tête chez les rongeurs. Compte tenu du fait que les lésions cérébrales traumatiques légères (TCL) est trois fois plus fréquente que la lésion cérébrale modérée et sévère combinée ^1, un modèle fiable de TCL est nécessaire pour faciliter la recherche concernant la physiopathologie, les résultats neurobiologiques et comportementales, et les stratégies thérapeutiques. Par exemple, en partie à cause des limitations de modèles animaux actuels ^2, dans la dernière décennie, il ya eu plus de 200 échoué essais cliniques de médicaments pour le traitement de TBI ^3. Lorsque les systèmes de modélisation sont générés pour les études de recherche translationnelle, l'applicabilité des résultats dépendent de la validité du modèle mis en œuvre. Pour l'étude de TCL / commotion cérébrale, un modèle animal fiable serait non seulement imiter la biomécanique forces responSible de blessure étiologie, mais également induire des symptômes compatibles avec ceux rapportés par la population cliniquement pertinente. En outre, parce que les enfants sont à risque particulièrement élevé pour les TCL, systèmes de modélisation optimale serait applicable aux jeunes et aux jeunes rongeurs, en plus de leurs équivalents adultes.

Analyses biomécaniques de circonstances dans lesquelles les athlètes ont subies mTBIs ou lésions cérébrales commotion indiquent que les facteurs prédictifs les plus critiques pour les blessures sont l'accélération rapide de la tête et les impacts à haute vitesse ^4. La majorité des modèles de rongeurs actuellement employées pour l'induction de TBI permet peu ou pas de mouvement de la tête ⁵ (pour revue, voir ^2). Le modèle présenté ici, délivre un impact à grande vitesse à la tête d'un rat juvénile physiquement effrénée qui est accompagné par une rotation de 180 ° et de chute libre qui se applique forces d'accélération / décélération à la tête et le corps du sujet. Tvoici deux principaux avantages associés à cette technique de la goutte de poids modifiée pour l'induction de TCL. Premièrement, le modèle produit commotion cliniquement pertinente comme symptomatologie sans causer aucun dommage manifeste au cerveau (pour une description complète des résultats comportementaux voir ^6). Aussi compatible avec les rapports cliniques du syndrome post-commotion, cette technique poids-goutte modifiée produit des résultats hétérogènes. Bien que les effets de la TCL sont importants, il ya des variations importantes entre les rongeurs qui ont connu une TCL quand on l'examine de multiples mesures des résultats. Deuxièmement, la méthode permet l'étude de TCL répétitif ^7. Comme la majorité des modèles de TBI existants infliger de telles blessures graves, il est souvent difficile d'induire une deuxième blessure, et presque impossible à étudier TBI répétitif sans d'importants dommages à l'ensemble du cortex.

Par conséquent, la principale raison pour utiliser la technique de la goutte de poids modifié pour le induction des TCL est de produire une blessure qui représente plus étroitement la physiopathologie et la symptomatologie de commotion cérébrale et répétitif TBI dans les populations juvéniles. Avec l'incidence croissante de TCL liés aux sports, les chutes et les accidents de la route, en particulier pendant l'enfance, ce modèle de rongeur unique de TCL fournit aux chercheurs un outil précieux pour l'étude de la lésion cérébrale commotion semblable qui peut être facilement appliquée à plusieurs succès paradigmes.

Protocole

NOTE: Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvés par l'Université de Calgary, Comité d'éthique de protection des animaux.

1. Elevage et préparation des animaux

1. Commandez rats enceintes des fournisseurs d'animaux de laboratoire standard ou chiots de race en interne selon des protocoles classiques de sélection.
2. Maison tous les animaux avec accès ad libitum à la nourriture et de l'eau, dans une chambre de logement de rat à température contrôlée (21 ° C), qui est maintenue sur une lumière 12:12 h: cycle d'obscurité.
3. Lorsque chiots atteignent postnatale jour 21 (P21), sevrer leur progéniture de leurs mères et maison dans les groupes de même sexe de 3 ou 4.

2. Mise en place d'un traumatisme craniocérébral léger (TCCL) Appareil

1. Avant le début de la procédure, le poids de l'usine à la masse désirée (par exemple 150 g). Fixer solidement une boucle métallique à l'extrémité supérieure du poids permet la ligne de pêche pour être fixe au poids.
2. Note feuille d'étain avec une lame de rasoir. Se assurer que la feuille d'étain marqué supporte le poids du corps du rat, mais ne interfère pas avec l'accélération de la tête rat après l'impact avec le poids.
3. Ruban de la feuille d'étain marqué au stade en forme de U en matière plastique transparente (38 x 27 x 27 cm ³⁾ qui contient une collection éponge (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (figure 1), de sorte qu'il est tendu.
4. Placer l'étape de plastique en forme de U dans la position correcte au-dessous du tube de guidage en matière plastique claire.
5. Tenir le tube de guidage en plastique (2,2 cm de diamètre x 1,5 m) en place avec un stand de serrage et positionner le tube de guidage de sorte qu'il est de 3,5 cm au-dessus de la feuille d'étain marqué.
6. Attacher la ligne de pêche à travers la boucle de métal à la masse en sorte que le fond de l'pend librement poids 2,5 cm au-dessus de la feuille d'étain marqué.
7. Fixer solidement la ligne de pêche à la barre de serrage.
   REMARQUE: attacher le poids à la palourdestand de p à une hauteur de 2,5 cm au-dessus de la feuille d'étain empêche re-hits tandis que le rat est en baisse de l'impact de l'éponge de la collection).
8. Tirez le poids à travers le tube de guidage en plastique avec la ligne de pêche et maintenez-le en place avec une broche clé Allen à 1,0 m.

3. Induction de TCL

1. Quand les rats atteignent P30 cages de se déplacer dans la pièce de procédure.
2. Placez rats dans une chambre isoflurane et légèrement anesthésier le rat jusqu'à ce qu'il soit non-réponse à une patte ou pincement de la queue.
3. Placer rapidement le rat la poitrine vers le bas sur la feuille d'étain marqué avec sa tête directement dans la trajectoire de la masse tombante. Voir Figure 2. Si le rat commence à se déplacer ou de réveil avant qu'il peut être placé sur la feuille d'étain marqué, revenir à la chambre isoflurane jusqu'à ce non-réponse à une patte ou pincement de la queue et de recommencer.
4. Tirer la goupille clé Allen, permettant au poids de tomber verticalement à travers le tube de guidage en matière plastique et le rat frapper sur la tête. The rat va subir rapidement une rotation de 180 ° et la terre en position couchée.
5. Enlever immédiatement le rat de l'éponge de collecte et d'appliquer la lidocaïne topique à la tête du rat avec un coton-tige.
6. Placez le rat en décubitus dorsal dans une cage propre qui est chauffé en le réglant sur un coussin chauffant disponible dans le commerce.
7. Aide d'un chronomètre ou une minuterie numérique acquérir le "time-to-droit». Temps à droite est le temps pris par le rat se réveiller de l'anesthésie et retourner de la position couchée à la position couchée ou commencez à marcher.
8. Retour le rat à son domicile cage après avoir récupéré un comportement normal (toilettage, marcher, explorer, etc.).
9. Répétez les étapes 3.2 à 3.8 pour chaque rat supplémentaire exigeant un TCL.
10. Répétez la procédure sur le même rat à des points de temps multiples pour TCL expériences répétitives.

4. Induction de la Sham blessures

1. Légèrement anesthetize le rat avec de l'isoflurane jusqu'à ce qu'il soit non-réponse à une patte ou pincement de la queue.
2. Placer rapidement le rat la poitrine vers le bas sur la feuille d'étain marqué avec sa tête directement dans la trajectoire de la masse tombante.
3. Retirer le rat de la feuille d'étain sans tirer la goupille clé hexagonale du tube de guidage en plastique et appliquer lidocaïne à la tête du rat avec un coton-tige.
4. Placez le rat en décubitus dorsal dans une cage propre qui est chauffé en le réglant sur un coussin chauffant disponible dans le commerce.
5. Utilisez un chronomètre ou une minuterie numérique pour acquérir le "time-to-droit».
6. Retour le rat à son domicile cage après avoir récupéré un comportement normal (toilettage, marcher, explorer, etc.).

5. Vérification de TCL avec le faisceau Marcher test ⁸

1. 24 heures après l'induction de la TCL ou faux animaux de retour de blessures à la salle de procédure.
2. Transférer les rats dans une cage de maintien propreet placez la maison-cage du rat à l'extrémité la plus étroite des 165 cm faisceau de telle sorte que la partie ouverte de la maison-cage face à l'extrémité étroite du faisceau conique.
   NOTE: Le faisceau conique est de 165 cm de long. La plate-forme centrale de la poutre a une largeur de 6 cm à l'extrémité large et 1,75 cm à l'extrémité étroite. Le faisceau central a saillies (2 cm de large et 2 cm en dessous de la poutre centrale) qui fournissent la sécurité lorsque pied glisse de l'rat. Placez rembourrage en mousse dessous de la poutre pour réduire le risque de blessure pour les rats qui peuvent tomber le faisceau pendant le test.
3. Placer une caméra vidéo à l'extrémité large de la position de faisceau conique et / zoom de la caméra vidéo afin de se assurer que l'enquêteur regardant la vidéo peut voir clairement les mouvements du rat sur toute la longueur du faisceau conique.
4. Placez le rat à l'extrémité large du faisceau conique et l'encourager à marcher à travers le faisceau de sa maison-cage. Une fois que le rat traverse le faisceau conique, laissez le rat dans sa maison-cage pendant au moins 60 secondes à reinForce l'emplacement cible. Il se agit d'essai n ° 1 et non incluses dans l'analyse.
5. Tournez la caméra vidéo et laissez le rat pour compléter la tâche faisceau marche 4 fois supplémentaires (maintien des périodes de renforcement 60 sec dans la cage de la maison). Une fois que le rat a terminé tous les essais, retourner le rat à sa maison-cage.
6. Pour marquer, enregistrer le nombre de pieds-jambes de derrière feuillets qui se produisent et le temps / la durée de traverser la poutre, pour chaque épreuve individuelle. Utiliser ces données pour calculer le nombre moyen de jambe-pied glisse et de temps derrière pour traverser le faisceau pour chaque rat.

Résultats

La technique poids baisse modifié décrit ci-dessus est une méthode fiable pour l'induction d'une légère lésion cérébrale traumatique (TCL) chez les jeunes rats. Utilisant un poids de 150 g d'impact, cette technique a été appliquée avec succès à de jeunes rats qui vont de 50 à 120 g. En outre, la procédure peut être facilement répété dans les mêmes animaux pour l'étude de TCL répétitif. Bien que les animaux qui subissent une seule exposition TCL une augmentation dans le temps à droite (figure 3) et apparaissent stupéfaits au réveil, ils reprennent rapidement les activités normales et sont impossibles à distinguer visuellement d'animaux sham blessés. Étant donné que la blessure est légère, lidocaïne qui élimine toute la douleur associée à l'impact regardant, est le seul analgésique nécessaire. Ce est important pour la recherche en médicaments contre la douleur sont connus pour interférer avec les processus inflammatoires et de récupération typiques. En raison de l'absence de symptomatologie manifeste, la tâche de marche du faisceau est un fiableol qui peut être utilisé pour valider l'induction de la TCL. Il est important de noter, que tous les animaux qui subissent une TCL présenteront des déficits sur la tâche de marche du faisceau, mais en tant que groupe, les rats juvéniles avec TCL démontrer jambe-pied glisse beaucoup plus derrière par rapport aux rats juvéniles avec une blessure simulée (Figure 4).

Une autre caractéristique clé de cette technique poids baisse modifié est le manque de retenue appliqué chez le rat juvénile au cours des blessures induction. En livrant un coup en regardant à la tête suivi par l'accélération de rotation rapide et la décélération, ce modèle représente plus étroitement les forces biomécaniques attribués à TCL et une commotion cérébrale. Lorsque cette procédure est appliquée à de jeunes rats ou des souris adultes, les taux de mortalité sont extrêmement faibles (7/202 animaux juvéniles ~ taux de mortalité de 3,4%), et une fracture du crâne et une hémorragie intracrânienne sont exceptionnellement rare ^6,7. En outre, le modèle produit sy cliniquement pertinentemptomology. Rongeurs juvéniles qui ont connu un seul TCL démontré déficits dans les comportements d'équilibre et de moteur, avec des déficits de la fonction exécutive, l'augmentation des comportements dépressifs-comme, et les interactions sociales altérées ^6,9. De même, les souris adultes affichent également équilibre et de coordination des déficits légers qui récupèrent avec le temps ^7. Enfin, l'induction de TCL en utilisant ce modèle nécessite anesthésie minimale et ne implique pas de préparation chirurgicale ou des terriers dans le crâne. Les résultats sont donc pas biaisés par des effets inflammatoires ou immunologiques confusion déclenchées par la chirurgie ou anesthésie. En outre, le temps de récupération rapide et le manque de plaies ouvertes permet le début des paradigmes de tests supplémentaires de se produire peu de temps après l'expérience de la TCL rongeurs.

Figure 1: > C représentation artoon de l'U stade de plastique et collection éponge avec toutes les dimensions pertinentes. Une distance de 10 cm doit être maintenue entre l'éponge de la collection et le haut de la scène en plastique pour assurer le rat juvénile a suffisamment de temps pour terminer le 180 rotation °.

Figure 2: (A) une représentation photographique de la plate-forme blessure à induction. Le rat mineur est placé poitrine vers le bas sur la feuille d'étain marqué sorte que la tête est directement sous le poids de tomber. (B) Vue de côté de la plate-forme des blessures à induction. (C) la démonstration photographique du poids utilisé dans l'induction de la TCL .

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Figure 3: Représentation graphique des différences moyennes dans le temps à droite entre les jeunes rats qui ont connu un seul TCL et jeunes rats qui ont connu une blessure fictive (* p <0,01) de rats qui ont reçu une exposition TCL une augmentation significative dans la. la durée de temps nécessaire pour se redresser à partir de la position couchée.

Figure 4: Représentation graphique du nombre moyen de jambe-pied glisse derrière exposés sur la tâche Marcher faisceau par les rats juvéniles qui a connu un seul TCL et jeunes rats qui ont connu une blessure fictive (* p <0,05).

Discussion

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad - 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory