Um novo modelo de Mild Traumatic Brain Injury para ratos jovens

Resumo

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Resumo

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introdução

Embora existam muitos métodos amplamente utilizados para a geração de moderada a grave lesão traumática do cérebro (TBI), muito poucas técnicas foram desenvolvidas para induzir leve, fechado ferimentos na cabeça em roedores. Devido ao fato de que leve traumatismo cranioencefálico (mTBI) é três vezes mais comum do que a lesão cerebral moderada e grave combinado ^1, é necessário um modelo confiável de mTBI para facilitar a investigação sobre fisiopatologia, os resultados neurobiológicos e comportamentais, e estratégias terapêuticas. Por exemplo, em parte devido às limitações dos modelos animais atuais ^2, na última década, houve mais de 200 falhou ensaios clínicos de medicamentos para o tratamento de TBI ^3. Quando os sistemas de modelagem são gerados para estudos de investigação de translação, a aplicabilidade dos resultados dependem da validade do modelo implementado. Para o estudo da mTBI / concussão, um modelo animal de confiança não apenas imitar a biomecânica forças responsável pela etiologia da lesão, mas também induzir sintomas consistentes com os relatados pela população clinicamente relevante. Além disso, porque as crianças estão em risco particularmente elevado para mTBI, sistemas de modelagem óptimos seria aplicável aos roedores jovens e jovens, em adição aos seus equivalentes adultos.

Análises biomecânicas das circunstâncias em que os atletas sofreram mTBIs ou lesões cerebrais concussivas indicam que os fatores preditivos mais críticos para lesão são aceleração cabeça rápido e impactos de alta velocidade ^4. A maioria dos modelos de roedores actualmente utilizados para a indução de TCE permitir pouco ou nenhum movimento da cabeça ⁵ (para revisão ver ^2). O modelo descrito aqui, proporciona um impacto de alta velocidade para a cabeça de um rato juvenil fisicamente desenfreada que é acompanhada por uma rotação de 180 ° e de queda livre que se aplica forças de aceleração / desaceleração de cabeça e no corpo do sujeito. Taqui são dois principais vantagens associadas a esta técnica de queda de peso modificado para a indução de mTBI. Primeiro, o modelo produz concussiva clinicamente relevante como sintomatologia sem causar qualquer dano evidente para o cérebro (para uma descrição completa de resultados comportamentais ver ^6). Também consistente com os relatórios clínicos da síndrome pós-concussão, esta técnica peso-drop modificado produz resultados heterogêneos. Embora os efeitos da mTBI são significativos, há uma variação substancial entre os roedores que passaram por um mTBI quando examinado em várias medidas de resultado. Em segundo lugar, o método permite o estudo de ⁷ mTBI repetitivo. Como a maioria dos modelos de TCE existentes provocado tais ferimentos graves, muitas vezes é difícil para induzir uma segunda lesão, e quase impossível estudar TBI repetitivo, sem grandes danos a todo o córtex.

Portanto, a razão primária para a utilização da técnica de queda de peso modificado para a inducção de mTBI é produzir uma lesão que representa mais de perto a fisiopatologia e sintomatologia de concussão e repetitivo TBI nas populações juvenis. Com o aumento da incidência de mTBI relacionado a esportes, quedas e acidentes automobilísticos, especialmente durante a infância, este modelo de roedor única de mTBI fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para o estudo de concussão-like lesão cerebral que pode ser facilmente aplicada a multiple-hit paradigmas.

Protocolo

Nota: Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Conselho Canadense de cuidados com animais e foram aprovados pela Universidade de Calgary, Comitê de Ética Animal Care.

1. Criação e Preparação animal

1. Encomende ratas prenhes de fornecedores de animais de laboratório padrão ou filhotes da raça em casa de acordo com protocolos de reprodução padrão.
2. Casa todos os animais com acesso ad libitum a comida e água, em um rato quarto habitação temperatura controlada (21 ° C), que é mantido em uma luz 12:12 hr: ciclo escuro.
3. Quando os filhotes chegar dia pós-natal 21 (P21), desmamar filhotes de suas mães e casa em grupos do mesmo sexo de 3 ou 4.

2. Defina-up de Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) Apparatus

1. Antes do início do procedimento, pesos moinho para a massa desejado (por exemplo, 150 g). Fixe firmemente um anel de metal para a extremidade superior do peso permitindo que a linha de pesca para ser fifixada para o peso.
2. Pontuação folha de estanho com uma lâmina afiada. Certifique-se de que a folha de estanho teve suporta o peso do corpo do rato mas não irá interferir com a aceleração do rato após impacto da cabeça com o peso.
3. Fita da folha de estanho marcado para o estágio em forma de U feito de plástico transparente (38 x 27 x 27 ^cm3), que contém uma esponja de recolha (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (Figura 1), de modo que é esticada.
4. Coloque a fase de plástico em forma de U na posição correcta por baixo do tubo de guia feita de plástico transparente.
5. Segure o tubo guia de plástico (2,2 cm de diâmetro x 1,5 m) no lugar com um suporte de tripé e posicionar o tubo guia de modo que é de 3,5 cm acima da folha de estanho marcou.
6. Coloque a linha de pesca, através do anel de metal para assegurar que o peso da parte inferior do peso pendura livremente 2,5 centímetros acima da folha de estanho marcado.
7. Fixe firmemente a linha de pesca para o suporte de fixação.
   NOTA: Amarrar o peso para o clamp suporte a uma altura de 2,5 cm acima da folha de estanho evita re-hits enquanto o rato está caindo do impacto para a esponja de coleção).
8. Puxe o peso para cima através do tubo guia de plástico com a linha de pesca e mantê-lo no lugar com um pino de chave allen em 1,0 m.

3. Indução de mTBI

1. Quando os ratos atingir P30 movimento gaiolas dentro da sala processual.
2. Coloque ratos em uma câmara de isoflurano e levemente anestesiar o rato até que ele não responde a uma pata ou cauda pitada.
3. Coloque rapidamente o rato peito para baixo sobre o papel alumínio marcou com a cabeça diretamente no caminho do peso cair. Veja a Figura 2. Se o rato começa a se mover ou wake-up antes de poder ser colocado no papel alumínio marcou, voltar para a câmara de isoflurano até que não responde a uma pata ou cauda pitada e começar de novo.
4. Puxe o pino chave Allen, permitindo que o peso a cair verticalmente através do tubo guia de plástico e bata no rato na cabeça. The rato serão submetidos a uma rápida rotação e terra 180 ° na posição supina.
5. Remover imediatamente o rato a partir da esponja coleção e aplicar lidocaína tópica para a cabeça do rato com um aplicador de algodão Pontas.
6. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma gaiola limpa, que é aquecida por defini-lo em cima de uma almofada de aquecimento disponíveis comercialmente.
7. Usando um cronômetro ou timer digital adquirir o "time-to-right". Tempo para a direita é o tempo que o rato para acordar da anestesia e virar a partir da posição deitada para a posição prona ou comece a caminhar.
8. Retorne o rato para sua gaiola de casa depois de ter recuperado o comportamento normal (aparência, andar, explorar, etc.).
9. Repita os passos de 3,2-3,8 para cada rato adicional exigindo uma mTBI.
10. Repita o procedimento no mesmo rato em vários pontos de tempo para experiências MTBI repetitivas.

4. A indução da lesão Sham

1. Levemente Anesthetize o rato com isoflurano até que ele não responde a uma pata ou cauda pitada.
2. Coloque rapidamente o rato peito para baixo sobre o papel alumínio marcou com a cabeça diretamente no caminho do peso cair.
3. Retire o rato da folha de estanho sem puxar o pino de chave allen do tubo guia de plástico e aplique lidocaína tópica para a cabeça do rato com um aplicador de algodão Pontas.
4. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma gaiola limpa, que é aquecida por defini-lo em cima de uma almofada de aquecimento disponíveis comercialmente.
5. Use um cronômetro ou timer digital para adquirir o "time-to-right".
6. Retorne o rato para sua gaiola de casa depois de ter recuperado o comportamento normal (aparência, andar, explorar, etc.).

5. Verificação de mTBI com o teste de caminhada de feixe ⁸

1. 24 h após a indução do mTBI ou animais sham lesão de retorno para o quarto processual.
2. Transfira os ratos a uma gaiola exploração limpoe colocá-home-gaiola do rato na extremidade mais estreita dos 165 centímetros afuniladas feixe de modo que a parte aberta da gaiola de casa enfrenta a extremidade mais estreita do feixe.
   NOTA: O feixe cônico é de 165 cm de comprimento. A plataforma central do feixe tem uma largura de 6 cm na extremidade larga e 1,75 cm na parte mais estreita. O feixe de centro tem bordas (2 cm de largura e 2 cm abaixo da viga central) que fornecem segurança quando deslizamentos pé do rato. Coloque enchimento de espuma abaixo do feixe para reduzir o risco de lesões nos ratos que podem cair fora do feixe durante o teste.
3. Coloque uma câmara de vídeo na ponta mais larga do feixe e da posição afunilada / aumentar a câmara de vídeo para assegurar que o investigador observar o vídeo pode ver claramente os movimentos do rato por todo o comprimento da viga afunilada.
4. Coloque o rato na grande final do feixe cônico e incentivá-la a atravessar o feixe de sua gaiola de casa. Quando o rato cruza o feixe cônico, deixar o rato em sua gaiola de casa por pelo menos 60 segundos para reinForce o local de destino. Esta experimentação é # 1 e não incluídos na análise.
5. Ligue a câmera de vídeo e permitir que o rato para concluir a tarefa feixe-walking 4 vezes adicionais (mantendo os períodos de reforço 60 seg na gaiola). Uma vez que o rato tenha completado todos os ensaios, o retorno do rato para sua gaiola de casa.
6. Para marcar, registrar o número de perna-pé deslizamentos traseiras que ocorrem eo tempo / duração para atravessar o feixe, para cada prova individual. Use esses dados para calcular o número médio de pernas traseiras pé-deslizamentos e tempo para atravessar o feixe para cada rato.

Resultados

A técnica de peso-gota modificado descrito acima é um método fiável para a indução de uma lesão cerebral traumática leve (mTBI) em ratos juvenis. Utilizando um peso impacto de 150 g, esta técnica tem sido aplicada com sucesso em ratos jovens que vão 50-120 g. Além disso, o procedimento pode ser facilmente repetido nos mesmos animais para o estudo de mTBI repetitivo. Embora os animais que passam por uma única exposição mTBI um aumento do tempo para a direita (Figura 3) e aparecem surpreendeu ao acordar, eles rapidamente retomar suas atividades normais e são visualmente indistinguíveis de animais feridos por simulação. Tendo em conta que a lesão é leve, lidocaína tópica que elimina qualquer dor associada com o impacto de olhar, é o único analgésico necessário. Isso é importante para a investigação como medicamentos para a dor são conhecidos por interferir com os processos inflamatórios e recuperação típicas. Devido à falta de sintomatologia evidente, a tarefa é um feixe de passeio fiável paraol que pode ser utilizado para validar a indução da mTBI. É importante notar, que nem todos os animais que experimentam uma mTBI exibirão défices na tarefa viga curta, mas como um grupo, os ratos juvenis com uma mTBI demonstrar significativamente mais traseiras da perna do pé-deslizamentos quando em comparação com ratos jovens com uma lesão simulada (Figura 4).

Outra característica chave desta técnica peso-gota modificado é a falta de contenção aplicada ao rato juvenil durante a indução da lesão. Ao entregar um golpe de raspão na cabeça seguido de rápida aceleração e desaceleração de rotação, este modelo representa mais de perto as forças biomecânicas atribuídos a mTBI e concussão. Quando este procedimento é aplicado a ratos jovens ou ratos adultos, as taxas de mortalidade são extremamente baixos (7/202 animais juvenis ~ taxa de mortalidade de 3,4%), e fratura de crânio e hemorragia intracraniana são excepcionalmente raros ^6,7. Além disso, o modelo produz sy clinicamente relevantemptomology. Roedores jovens que experimentaram um único mTBI demonstrou déficits de equilíbrio e motor comportamentos, juntamente com déficits de função executiva, o aumento de comportamentos de tipo depressivo, e interações sociais alterados ^6,9. Da mesma forma, camundongos adultos também apresentam equilíbrio e coordenação déficits leves que recuperar com o tempo ^7. Finalmente, a indução de mTBI usando este modelo requer anestesia mínima e não envolve preparação cirúrgica ou se esconder debaixo do crânio. Os resultados, portanto, não são distorcidos por efeitos inflamatórios ou imunológicos confusão desencadeada pela cirurgia ou anestesia. Além disso, o tempo de recuperação rápida e falta de feridas abertas permite o início de paradigmas de ensaio adicionais para ocorrer pouco depois de experimentar o mTBI roedores.

Figura 1: > C artoon representação da forma de U fase de plástico e esponja de recolha com todas as dimensões relevantes. Uma distância de 10 cm deve ser mantida entre a esponja de recolha e o início da fase de plástico para assegurar o rato juvenil tem tempo suficiente para completar os 180 rotação °.

Figura 2: (A) representação fotográfica da plataforma a indução da lesão. O rato juvenil é colocado no peito para baixo sobre o papel alumínio marcou de modo que a cabeça está diretamente abaixo do peso em queda. (B) Vista lateral da plataforma de indução da lesão. (C) demonstração fotográfica do peso usado na indução do mTBI .

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Figura 3: Representação gráfica das diferenças médias de tempo para a direita entre ratos jovens que experimentaram um único mTBI e ratos jovens que sofreram uma lesão sham (* p <0,01) Os ratos que receberam uma exposição mTBI um aumento significativo no. duração de tempo necessária para endireitar-se a partir da posição supina.

Figura 4: Representação gráfica do número médio de perna-pé deslizamentos traseiras expostas na tarefa Walking Beam por ratos jovens que experimentaram um único mTBI e ratos jovens que sofreram uma lesão sham (* p <0,05).

Discussão

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad - 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory