Roman Modell Mild traumatische Hirnverletzung für jungen Ratten

Zusammenfassung

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Zusammenfassung

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Einleitung

Obwohl es viele weit verbreitete Methoden zur Erzeugung von mittelschwerer bis schwerer traumatischer Hirnverletzung (TBI), sehr wenige Techniken entwickelt, um zu induzieren mild, geschlossene Kopfverletzungen bei Nagern. Aufgrund der Tatsache, dass die milden traumatischen Hirnverletzungen (mTBI) ist dreimal häufiger als mittelschweren und schweren Hirnverletzungen in Verbindung ¹ ist ein zuverlässiges Modell der mTBI benötigt, um Forschung in Bezug auf Pathophysiologie neurobiologischen und Verhaltensergebnisse und therapeutische Strategien zu erleichtern. Zum Beispiel, teilweise aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Tiermodellen ^2, in den letzten zehn Jahren gab es mehr als 200 gewesen gescheitert klinischen Arzneimittelstudien für die Behandlung von TBI ^3. Bei der Modellierung von Systemen für translationale Forschung Studien erstellt, die Anwendbarkeit der Ergebnisse sind abhängig von der Gültigkeit des Modells implementiert. Für die Studie der mTBI / Gehirnerschütterung, wäre eine zuverlässige Tiermodell nicht nur imitieren die biomechanischen Kräfte Verantwortlich für Verletzungen Ätiologie, aber auch Symptome, die mit den von der klinisch relevanten Bevölkerung berichtet induzieren. Darüber hinaus, weil Kinder ein besonders hohes Risiko für mTBI würde optimale Modellierungssysteme für junge und jugendliche Nagetiere, zusätzlich zu ihrem Erwachsenenäquivalente.

Biomechanische Analysen der Umstände, in denen Athleten mTBIs oder erschütternder Hirnverletzungen erlitten zeigen, dass die wichtigsten Prognosefaktoren für Verletzungen sind schnelle Kopfbeschleunigung und hoher Geschwindigkeit Auswirkungen ^4. Die Mehrheit der Nagetiermodellen derzeit für die Induktion von TBI beschäftigt erlauben wenig oder keine Bewegung des Kopfes ⁵ (für einen Überblick siehe ^2). Die hier vorgestellte Modell liefert ein Hochgeschwindigkeits-Aufprall des Kopfes eines physikalisch ungebremst juvenilen Ratten, die durch eine Drehung um 180 ° und im freien Fall, die Beschleunigungs- / Verzögerungskräften gilt für Kopf und Körper der Person begleitet wird. THier sind vor allem zwei Vorteile mit dieser modifizierten Gewicht Drop-Technik für die Induktion von mTBI verbunden. Zuerst das Modell produziert klinisch relevanten concussive wie Symptomatik, ohne dass eine offensichtliche Schädigung des Gehirns (für eine vollständige Beschreibung der Verhaltensergebnisse siehe ^6). Auch im Einklang mit klinischen Berichte über post concussive Syndrom, diese modifizierte Gewicht-Drop-Technik produziert heterogene Ergebnisse. Obwohl die Auswirkungen der mTBI signifikant sind, gibt es erhebliche Unterschiede zwischen Nagern, die eine mTBI erlebt, wenn auf mehreren Zielparameter untersucht. Zweitens gestattet das Verfahren die Untersuchung der repetitiven mTBI ^7. Da die Mehrheit der bestehenden TBI Modelle wie schwere Verletzungen verursachen, ist es oft schwierig, eine zweite Verletzung zu induzieren, und fast unmöglich, sich wiederholende TBI ohne großen Schaden für die gesamte Cortex studieren.

Daher ist die primäre Grund für die Verwendung der modifizierten Gewicht Drop-Technik für die Induction des mTBI ist es, eine Verletzung, die der Pathophysiologie und Symptomatik von Gehirnerschütterung und repetitive TBI in Jugendgruppen stärker repräsentiert zu produzieren. Mit der zunehmenden Häufigkeit von mTBI im Zusammenhang mit Sport, Stürze und Autounfälle, vor allem während der Kindheit, dieses einzigartige Nagetiermodell der mTBI bietet Forschern ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von erschütternder artigen Hirnverletzung, die leicht mehrere Hit-angewendet werden können Paradigmen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council von Animal Care durchgeführt und von der University of Calgary, Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt.

1. Zucht und Tier Vorbereitung

1. Bestellen trächtigen Ratten von Standard-Labortier Lieferanten oder Rasse Welpen im Haus nach der Norm Zuchtprotokolle.
2. Dunkel-Zyklus: Haus alle Tiere mit freien Zugang zu Nahrung und Wasser, in einer temperaturgeregelten Ratte Gehäuseraum (21 ° C), das auf einem 12:12 Stunden Licht erhalten.
3. Als Jungtiere erreichen postnatalen Tag 21 (P21), zu entwöhnen Welpen von ihren Müttern und Haus in gleichgeschlechtlichen Gruppen von 3 oder 4.

2. Aufbau von Milde traumatische Hirnverletzung (mTBI) Geräte

1. Vor Beginn des Verfahrens, Mühle Gewichte auf die gewünschte Masse (zB 150 g). Befestigen Sie eine Metallschlaufe am oberen Ende des Gewichts ermöglicht die Angelschnur fi seinzum Gewicht feste.
2. Ergebnis Alufolie mit einer scharfen Rasierklinge. Stellen Sie sicher, dass die erzielte Alufolie unterstützt das Körpergewicht der Ratten, aber nicht mit einer Beschleunigung der Ratte folgenden Kopfaufprall mit dem Gewicht stören.
3. Klebeband die erzielt Alufolie auf der U-förmigen Stufe aus durchsichtigem Kunststoff (38 x 27 x 27 cm ³⁾ hergestellt, die eine Sammlung Schwamm (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (Figur 1) enthält, so daß es straff ist.
4. Platzieren Sie den U-förmigen Kunststoffphase in der richtigen Position unterhalb des Führungsrohres aus durchsichtigem Kunststoff.
5. Halten Sie das Kunststoffführungsrohr (Durchmesser von 2,2 cm x 1,5 m) an Ort und Stelle mit einer Klemme Stand und die Position der Führungsrohr, so dass es 3,5 cm über der erzielte Alufolie.
6. Befestigen Sie die Angelschnur durch die Metall-Schleife, um das Gewicht dafür, dass der Boden das Gewicht frei 2,5 cm über der erzielte Alufolie hängt.
7. Befestigen Sie die Angelschnur an der Klammer stehen.
   HINWEIS: Kovalente Verknüpfung das Gewicht zum clamp Stand auf einer Höhe von 2,5 cm über der Alufolie verhindert Re-Hits, während die Ratte von den Auswirkungen auf die Sammlung Schwamm) fallen.
8. Up Ziehen Sie das Gewicht durch die Kunststoffführungsrohr mit der Angelschnur und halten Sie sie fest mit einem Innensechskantschlüssel Stift bei 1,0 m.

3. Induktion von mTBI

1. Bei Ratten erreichen P30 Schritt Käfige in den Verfahrensraum.
2. Platzieren Ratten in einer Isofluran Kammer und leicht zu betäuben die Ratte, bis es nicht reagiert auf die Pfote oder Schwanz kneifen.
3. Legen Sie schnell die Ratte Brust nach unten auf das erzielte Alufolie mit Hauptsitz direkt im Weg des Fallgewicht. Siehe Abbildung 2. Wenn die Ratte beginnt sich zu bewegen oder Wake-up, bevor es auf der erzielte Alufolie gelegt werden, kehren Sie zum Isofluran Kammer, bis nicht mehr reagiert auf eine Pfote oder Schwanz Prise und von neuem beginnen.
4. Ziehen Sie die Innensechskantschlüssel Stift, so dass das Gewicht, das vertikal durch die Kunststoffführungsrohr fallen und schlagen Sie die Ratte auf dem Kopf. The Ratte rasch eine Drehung um 180 ° und Grundstücke in der Rückenlage unterziehen.
5. Ziehen Sie sofort den Ratten aus der Sammlung Schwamm und gelten topische Lidocain zu Kopf der Ratte mit einem Wattestäbchen.
6. Legen Sie die Ratte in der Rückenlage in einem sauberen Käfig, indem sie auf einem handelsüblichen Heizkissen erwärmt wird.
7. Mit einer Stoppuhr oder digitaler Timer erwerben die "Time-to-right". Time-to-Recht ist die Zeit von der Ratte, um von der Narkose aufwachen und Flip aus der Rückenlage in die Bauchlage oder Laufen beginnen.
8. Bringen Sie die Ratte in die Ausgangs-Käfig, nachdem es ein normales Verhalten (Putzen, Wandern, Ausflüge, etc.) erholt.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,8 für jede weitere Ratten die eine mTBI.
10. Wiederholen Sie den Vorgang auf der gleichen Ratte zu mehreren Zeitpunkten für sich wiederholende mTBI Experimente.

4. Induktion der Sham Injury

1. Leicht anesthetize die Ratten mit Isofluran, bis es nicht reagiert auf die Pfote oder Schwanz kneifen.
2. Legen Sie schnell die Ratte Brust nach unten auf das erzielte Alufolie mit Hauptsitz direkt im Weg des Fallgewicht.
3. Entfernen Sie die Ratte aus der Alufolie ohne Ziehen des Innensechskantschlüssel Stift aus der Kunststoffführungsrohr und gelten topische Lidocain auf den Kopf der Ratte mit einem Wattestäbchen.
4. Legen Sie die Ratte in der Rückenlage in einem sauberen Käfig, indem sie auf einem handelsüblichen Heizkissen erwärmt wird.
5. Verwenden Sie eine Stoppuhr oder digitaler Timer, um die "Time-to-right" zu erwerben.
6. Bringen Sie die Ratte in die Ausgangs-Käfig, nachdem es ein normales Verhalten (Putzen, Wandern, Ausflüge, etc.) erholt.

5. Prüfung der mTBI mit dem Strahl-Walking Test ⁸

1. 24 Stunden nach der Induktion der mTBI oder Schein-Verletzungen Rückkehr Tiere auf den Verfahrensraum.
2. Übertragen Sie die Ratten in eine saubere Haltekäfigund platzieren Heimkäfig der Ratte am engeren Ende der 165 cm verjüngt Strahls derart, dass die offene Teil des Heimkäfig das schmalere Ende des Balkens gegenübersteht.
   HINWEIS: Die Kegelstrahl ist 165 cm lang. Das Zentrum Plattform der Strahl eine Breite von 6 cm am breiten Ende und 1,75 cm am schmalen Ende. Das Zentrum Strahl Leisten (2 cm breit und 2 cm unterhalb der Mittelstrahl), die Sicherheit bieten, wenn der Fuß rutscht der Ratte. Zeigen Polsterung unter dem Träger um die Verletzungsgefahr zu Ratten, die aus dem Strahl während des Tests fallen können, zu reduzieren.
3. Zeigen einer Videokamera an dem breiten Ende des sich verjüngenden Lichtstrahl und Positions / Zoomen der Videokamera, um sicherzustellen, dass der Prüfer das Video kann eindeutig die Bewegungen der Ratte zu sehen für die gesamte Länge des verjüngten Träger.
4. Legen Sie die Ratte am breiten Ende des Kegelstrahl und ermutigen sie, um über den Strahl in die Ausgangskäfig gehen. Sobald die Ratte kreuzt die Kegelstrahl, lassen Sie die Ratte in den Heimkäfig für mindestens 60 Sek reinForce den Zielort. Dies ist Test # 1 und nicht in die Analyse einbezogen.
5. Schalten Sie die Kamera ein und lassen Sie die Ratte, den Strahl-Walking Aufgabe 4 weitere Male (Beibehaltung der 60 Sek Verstärkung Zeiten im Käfig) zu vervollständigen. Sobald die Ratte hat alle Prüfungen abgeschlossen ist, geben die Ratte in die Ausgangskäfig.
6. Ein Tor, notieren Sie die Anzahl der Hinterbein Fuß-Zettel, die auftreten und die Zeit / Dauer, um den Strahl zu überschreiten, für jede einzelne Studie. Verwenden Sie diese Daten, um die durchschnittliche Anzahl der Hinterbein Fuß-Slips und Zeit zu berechnen, um den Strahl für jede Ratte überqueren.

Ergebnisse

Das modifizierte Gewichts Drop-Technik oben beschrieben ist eine zuverlässige Methode zur Induktion von milden traumatischer Hirnverletzung (mTBI) bei jungen Ratten. Mit Hilfe einer Schlaggewicht von 150 g, ist diese Technik erfolgreich an jungen Ratten, die von 50 bis 120 g reichen angewendet. Darüber hinaus kann das Verfahren einfach in der gleichen Tiere für die Untersuchung der repetitiven mTBI wiederholt werden. Obwohl Tiere, die eine einzige mTBI Ausstellung zu einem Anstieg in der Zeit nach rechts (Abbildung 3) und erscheinen nach dem Aufwachen überwältigt, sie schnell wieder normalen Tätigkeiten und sind optisch nicht von schein verletzte Tiere. Da die Schadens ist mild, aktuelle Lidocain, die Schmerzen mit dem Glanz Auswirkungen verbunden eliminiert wird das nur schmerzstill erforderlich. Dies ist wichtig für die Forschung als Schmerzmittel sind dafür bekannt, mit typischen entzündlichen und Recovery-Prozesse stören. Aufgrund des Mangels an manifester symptomology ist der Strahl Fuß Aufgabe verlässlicher zuol, das verwendet werden kann, um die Induktion der mTBI validieren. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle Tiere, die eine mTBI erleben werden Defizite auf dem Balken zu Fuß Aufgabe zeigen, sondern als Gruppe, jungen Ratten mit einem mTBI zeigen deutlich mehr Hinterbein Fuß-Slips im Vergleich zu jungen Ratten mit einem Schein-Verletzungen (Abbildung 4).

Ein weiteres wichtiges Merkmal dieses modifizierten Gewicht-Drop-Technik ist das Fehlen von Rückhalte zum juvenilen Ratte während Verletzungen Induktion aufgetragen. Durch die Bereitstellung einer Streif Schlag auf den Kopf, gefolgt von schnellem Dreh Beschleunigung und Verzögerung, dieses Modell stärker repräsentiert die biomechanischen Kräfte mTBI und eine Gehirnerschütterung zugeschrieben. Wenn dieses Verfahren auf juvenile Ratten oder erwachsenen Mäusen angewandt, sind Sterblichkeit extrem niedrig (7/202 Jungtiere ~ 3,4% Sterblichkeit) und Schädelbruch und Hirnblutungen sind außerordentlich selten ^6,7. Zusätzlich ist das Modell produziert klinisch relevanten symptomology. Juvenile Nagetiere, die ein einzelnes mTBI erlebt zeigte Defizite im Gleichgewicht und motorische Verhaltensweisen sowie Defizite in exekutiven Funktionen, erhöhte depressive artigen Verhaltensweisen und veränderten sozialen Interaktionen ^6,9. Ebenso erwachsenen Mäusen zeigen auch mild Gleichgewicht und Koordination Defizite, die mit der Zeit ⁷ wiederherstellen. Schließlich Induktion mTBI Verwendung dieses Modells erfordert nur minimale Betäubung und ist nicht mit chirurgischen Vorbereitung oder Wühlen in den Schädel. Die Ergebnisse sind deshalb nicht durch verwirrende entzündlichen oder immunologischen Auswirkungen der Operation oder Narkose ausgelöst vorgespannt ist. Darüber hinaus die schnelle Recovery-Zeit und der Mangel an offenen Wunden ermöglicht die Aufnahme der weiteren Tests Paradigmen zu treten kurz nach Nagetieren erleben Sie die mTBI.

Abbildung 1: > C artoon Darstellung des U-förmigen Kunststoffphase und Sammlung Schwamm mit allen dazugehörigen Dimension. Zwischen der Sammlung Schwamm und der Spitze der Kunststoffphase, die juvenile Ratten zu gewährleisten muss ein Abstand von 10 cm eingehalten werden genügend Zeit hat, um die 180 zu vervollständigen ° Rotation.

Abbildung 2: (A) Foto Darstellung der Verletzung Induktions Plattform. Die juvenile Ratten platziert Brust nach unten auf das erzielte Alufolie, so dass der Kopf ist direkt unter dem Fallgewicht. (B) Seitenansicht der Verletzung Induktionsplattform. (C) Foto Demonstration des Gewichts in der Induktion der mTBI verwendet .

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Abbildung 3: Graphische Darstellung der durchschnittlichen Unterschiede in der Zeit nach rechts von jungen Ratten, die eine einzelne mTBI und jungen Ratten, die eine Schein Verletzungen erlebt (* p <0,01) Ratten, die eine mTBI weisen einen deutlichen Anstieg der das empfangene erlebt habe. Dauer der Zeit benötigt, um sich von der Rückenlage rechts.

Abbildung 4: Graphische Darstellung der durchschnittlichen Anzahl der Hinterbein Fuß-Zettel auf dem Balken Gehen Aufgabe von jungen Ratten zeigten, die eine einzelne mTBI und jungen Ratten, die eine Schein Verletzungen erlebt (* p <0,05) erlebt.

Diskussion

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad - 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory