Utilizando diseño personalizado galvanotaxia Cámaras para Estudiar direccional migración de las células de la próstata

Resumen

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Resumen

El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, tales como la dirección de la migración celular en el desarrollo del embrión, consecuencia neuronal y la curación de la herida epitelial. La aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas in vitro induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí se modifica con cámaras de poli por encargo (cloruro de vinilo) (PVC), superficie de vidrio, electrodos de platino y el uso de una etapa motorizada en la que se crean imágenes de las células. Las cámaras de PVC y electrodos de platino presentan baja citotoxicidad y son asequibles y re-usable. La superficie de vidrio y la platina del microscopio motorizado mejorar la calidad de las imágenes y permiten posibles modificaciones a la superficie de vidrio y tratamientos para las células. Filmamos la galvanotaxia de dos líneas de células no tumorigénicas SV40 inmortalizado próstata, PRN-1-1 y PNT2. Estas dos líneas celulares muestran velocidades de migración similares y ambos migran haciael cátodo, pero muestran un grado diferente de direccionalidad en galvanotaxia. Los resultados obtenidos a través de este protocolo sugerir que los PRN-1.1 y las líneas celulares PNT2 pueden tener diferentes características intrínsecas que gobiernan sus respuestas migratorias direccionales.

Introducción

Campos eléctricos endógenos se detectan en varios tejidos, como la piel ^{1, 32, 33} y el cerebro ^2. El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, incluyendo la dirección de desarrollo del embrión ^{3, 4,} guiando la consecuencia de los procesos neuronales ^{5, 6} y la promoción de cierre de la herida epitelial corneal y ^{1, 7.} In vitro, la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas imita el campo eléctrico fisiológica e induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. Galvanotaxis se ha estudiado en fibroblastos, queratinocitos ⁸ de pescado ^9, epitelial humano y queratinocitos corneales ^10-12, linfocitos ^13, neuroblastos ^2, y células progenitoras neuronales ^14. Cuando se expone al campo aplicado, la mayoría de las células estudiadas migran direccionalmente hacia el catódica polo (-). Sin embargo, varias células cancerosas, incluyendo altamente metastásicocélulas de cáncer de mama humano y la próstata humana línea celular de cáncer PC-3M, se mueven a la anódica polo (+) ^{15, 16.} Se proponen varios mecanismos para mediar galvanotaxia o para explicar la capacidad de las células para detectar el campo eléctrico, incluyendo la activación de los receptores de EGF ^12, el canal de sodio epitelial ^17, PI3K y PTEN ^18, y la liberación de iones de calcio ^{15, 19.} El mecanismo no es todavía plenamente comprendida y es posible que múltiples vías de señalización están implicadas en galvanotaxia.

El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí es útil para caracterizar la migración direccional de adherente, células móviles, ya sea para controlar la migración de células individuales ^{10, 12, 17} o la migración de una hoja de células confluentes ^{18, 20.} Esta técnica se modifica desde Peng y Jaffe ²¹ y Nishimura et al. ¹⁰ con, cámaras de PVC claras a medida, con coversl extraíbleips permitiendo la recuperación de células fácil después galvanotaxia para el análisis secundario, como las imágenes de inmunofluorescencia. La superficie de vidrio de las cámaras galvanotaxia es compatible con óptica, que permite la grabación a alta magnificación y con células marcadas con fluorescencia. También permite que el diseño experimental con la modificación de la superficie de vidrio, tales como cambiar el revestimiento de la superficie o cargos. Los espaciadores hechos de No. 1 cubreobjetos se utilizan en las cámaras para minimizar el flujo de corriente a través de las células; por lo tanto el calentamiento por efecto Joule, que es proporcional al cuadrado del flujo de corriente, no sobrecalentar las células durante el experimento. Los puentes de conexión de agar evitar el contacto directo de los electrodos con las células y prevenir el cambio del pH del medio o la concentración de iones durante galvanotaxia.

Dos no tumorigénicas líneas celulares de próstata humano se examinaron por su respuesta galvanotaxia en este estudio. Los PRN-1-1 ²² y PNT2 ²³ son ambos SV40 inmortalizadas, dependientes de factor de crecimiento de líneas celulares que expresan los marcadores epiteliales citoqueratina 5, 8, 18 y 19 con baja o ninguna expresión de la específica de antígeno de la próstata (PSA). Ambas líneas celulares mantienen la morfología poligonal de las células epiteliales normales, pero anomalía cromosómica se observó en el cariotipo ^{22, 24.} Aunque PRN-1-1 y PNT2 comparten comportamientos similares en la mayoría de los experimentos, muestran diferencias en la formación de la estructura acinar y en galvanotaxia. En una matriz de 3-D, Matrigel, los PRN-1-1 células acinares formar estructuras huecas con lúmenes se asemejan a la tejido de la glándula próstata normal ^25. Sin embargo, las células PNT2 formar esferoides sólidos sin un lumen o epitelio polarizado ^26. Las células PRN-1-1 también demuestran una respuesta galvanotactic más alta que la PNT2 en el estudio actual. La correlación entre la formación de la estructura acinar y galvanotaxia en PRN-1-1 sugiere que las señales galvanotactic pueden jugar un papel en la organización de la prmovimientos de tejido de la glándula ostate en respuesta a campos eléctricos endógenos, y ofrece características adicionales para discriminar entre estas 2 líneas celulares.

Protocolo

1. cultivar células de la próstata

1. Cultura los PRN-1-1 y PNT2 próstata células en 100 mm cultura platos en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y antibióticos Antimycotic a 37 ° C con 5% de CO _2. Actualizar el medio de cultivo cada día hasta que las células alcanzan 80% de confluencia para los experimentos galvanotaxia.

2. Composición galvanotaxia Cámaras

1. Montaje de cámaras inferiores
   1. Limpie una cámara galvanotaxia plástico con 2-propanol. Aplicar el sellador de silicona de grado marino alrededor de las aberturas circulares en la parte inferior de una cámara con una jeringa y adjuntar una gran cubreobjetos (Figura 1). Use la parte de atrás de un aplicador de algodón para empujar hacia abajo el cubreobjetos y limpie el exceso de pegamento con hisopos de algodón. Las aberturas circulares permiten el medio y la corriente eléctrica fluya sobre las células situadas entre los dos depósitos medianas interiores.
   2. Corte un pequeño cubreobjetos para hacer 6 mm x 25 espaciadores mm con un marcador de punta de diamante.
   3. Voltear la cámara. Aplicar 2 rayas de la cola de silicio con una jeringa y / o una espátula de metal para crear un x 25 mm superficie del canal 10 mm para la fijación celular entre las 2 aberturas circulares en el cristal inferior. Pegue 2 piezas de vidrio separador entre las 2 aberturas circulares. Use la parte de atrás de los aplicadores de algodón para empujar hacia abajo los espaciadores y limpie el exceso de pegamento con hisopos y / o palillos de algodón.
   4. Seque la cámara durante 24 horas hasta que se cure el pegamento de silicona. Remojar la cámara durante la noche en agua destilada para eliminar el residuo de ácido acético a partir de la cola. Seque la cámara para su uso inmediato, o almacenar la cámara para su uso posterior en un recipiente limpio.
      
      Figura 1: Montaje de la cámara de la parte inferior galvanotaxia. A) Un gran cubreobjetos está unido a la parte inferior de una cámara limpia. B) Two piezas de separadores de cristal se pegan entre las 2 aberturas circulares para crear una 10 mm x 25 mm para el canal de las células se unan.
2. Siembra de las células en las cámaras galvanotaxia
   1. Preparar el número requerir de cámaras galvanotaxia necesarios para el experimento. Cada línea o el tratamiento de células requiere una única cámara galvanotaxia. Limpie las cámaras galvanotaxia con 2-propanol. Lave las cámaras con estériles PBS 3 veces y compruebe el flujo de líquido entre las 2 aberturas circulares en las cámaras.
   2. Incluya las cámaras en placas de cultivo de células estériles y dejar que se equilibren a 37 ° C durante 15 minutos. Separar las células de la próstata a partir de su plato de cultivo utilizando 5 ml 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Neutralizar la tripsina-EDTA con 5 ml 10% de FBS en PBS.
   3. Transferir las células a tubos de 15 ml y centrifugar las células durante 5 min a 200 xg, 37 ° C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio de cultivo.
   4. Tome 20 μl de solución de células para cargar a una cámara de recuento y calcular el número de células. Ajustar la concentración de células a 8 x 10 ⁴ células / ml con medio de cultivo.
   5. Tome las cámaras galvanotaxia de los 37 ° C incubadora. Semillas 350 l de la suspensión celular sobre cada cámara.
   6. Se incuban las células en las cámaras durante la noche en la placa de cultivo con Kimwipe mojado o en una cámara de humedad en la incubadora a 37 ° C con 5% de CO _2.

Figura 2:. Siembra de las células a la cámara de la cámara inferior se seca y limpia las células A) de próstata se tripsinizaron, se contaron y se transfirieron a la cámara y se incubaron durante la noche B) un cubreobjetos superior está unido a sellar la cámara antes de la filmación...

3. Lassembling las cámaras superiores
   1. Montar la cámara superior antes de la filmación. El microscopio sólo puede acomodar imágenes de una sola cámara galvanotaxia al mismo tiempo. Calentar 10 ml de medio de cultivo a 37 ° C para cada cámara galvanotaxia. Transferir una cámara galvanotaxia de las incubadoras a una placa de calentamiento 37 ° C.
   2. Enjuagar las células con medio de cultivo para eliminar las células no unidas. Deja 400 l de medio en la cámara. Utilice una jeringa para aplicar grasa de alto vacío en la parte superior de ambos separadores de vidrio.
   3. Añadir una pequeña cubreobjetos para sellar la cámara. Presione suavemente el cubreobjetos con el lado posterior de un aplicador de algodón. Limpie el medio exceso con hisopos de algodón.
   4. Seque la superficie del vidrio y aplicar grasa de alto vacío para sellar la brecha entre el cubreobjetos y la cámara. Use una espátula de metal para extender la grasa. Añadir 4 ml de medio de cultivo para los depósitos internos y comprobar el flujo de líquido entre los embalses.
4. Haga agarpuentes
   1. Corte un par de tubos de PVC de 2 pulgadas de largo (503/16 ID x 5.16 OD x 1/16 Wall), dar la vuelta e insertarlos en un vaso de 100 ml.
   2. Mide 200 mg Bacto-Agar y agregarlo en un matraz de 50 ml con medio de cultivo de 10 ml de hacer 2% en gel de agar. Microondas durante 30 segundos. Cargue el gel de agar para el tubo de plástico con una pipeta de transferencia. Deje los puentes de agar a temperatura ambiente durante 10 min para solidificar el agar.
   3. Añadir 2 ml de medio de cultivo a los depósitos exteriores de la cámara galvanotaxia. Inserte los puentes de agar a los embalses medianas interior y exterior para conducir la corriente.

Figura 3:. El rodaje de las células en la cámara de un diagrama para demostrar el montaje final de la cámara de galvanotaxia. La cámara está completamente sellado con grasa de alto vacío. El medio se añadió to llenar los depósitos, y dos puentes de agar se insertan en la cámara. A continuación, la cámara de galvanotaxia se transfiere a la platina del microscopio y los electrodos están unidos a aplicar el campo eléctrico. Vista lateral de la cámara de galvanotaxia ensamblado se muestra para demostrar que la corriente eléctrica fluye sobre las células a través de los puentes de agar y el espacio entre el vidrio de cubierta.

Imaging 3. Time-lapse

1. Encender la cámara ambiental a 37 ° C con 5% de _CO2 en el aire que circula 2 hr antes de la imagen.
2. Encienda el microscopio e iniciar el software de adquisición de imagen. Calibrar la platina del microscopio y seleccione el objetivo de 10X.
3. Transferir las cámaras galvanotaxia a la platina del microscopio, asegure la cámara con cinta y se centran en las células. Introducir los electrodos galvanotaxia a los depósitos exteriores con cátodo en el lado derecho. Fije el cable y los electrodos con cinta.
4. Encienda el bo poderx para aplicar un campo eléctrico a la cámara. Mida el voltaje de salida con el voltímetro a través de la cámara de alcanzar 2,5 voltios para la cámara de 25 mm de largo (100 mV / mm). Mantener la intensidad de campo durante el experimento mediante el ajuste de la corriente de salida.
5. Seleccione 10 puntos a través de la cámara para filmar en el software para generar diez películas a intervalos. Configurar las condiciones de adquisición a intervalos de 10 minutos durante 2 horas.
6. Iniciar el rodaje y ajustar la corriente de salida, según sea necesario.
7. Al final del experimento, retire la cámara desde el escenario y fijar las células con 95% de alcohol. Rompa la cámara con una hoja de afeitar para limpiar y volver a usarlo.

4. Cuantificación de Galvanotaxis

1. Gire las películas a intervalos y reorientar el cátodo a la parte superior de las imágenes. Exportar las películas para el software de seguimiento de la célula.
2. Rastrear manualmente el (x, y), la posición de 10 a 20 células en cada punto de tiempo de cada película (Figura 4 A, B).Las distancias de migración y los ángulos relativos a la dirección norte-sur, la misma orientación del campo eléctrico, se calcularán en el software de seguimiento de la célula (Figura 4C).
   NOTA: La velocidad media de migración se convierte de la distancia de migración total y el tiempo total de rodaje. La direccionalidad se convierte de los ángulos en el valor del coseno. Si las células migran con direccionalidad al azar, el promedio de coseno neto será cercano a cero. Si las células migran directamente hacia el cátodo, el valor del coseno será 1. Si las células migran directamente hacia el ánodo, el valor del coseno será -1.

Figura 4: seguimiento de la célula para medir la direccionalidad A) Superposición de las líneas de seguimiento con imágenes de células.. Los (x, y) posiciones de las células son manually rastreado en las películas a intervalos. . Si las células migran al azar, el coseno promedio es cercano a cero B) Sin embargo, si las células migran hacia el cátodo o el ánodo, el valor del coseno media es de cerca de + (cátodo) o -. (Ánodo) 1,0 C ) La direccionalidad es presentado por el valor del coseno, que se convierte a partir de los ángulos de migración (θ). El coseno (θ) es igual a la relación de la distancia a (la distancia de migración) la distancia b (la distancia proyectada a la dirección del campo eléctrico).

3. Guarde las mediciones. Importe los datos a una aplicación de base de datos para el cálculo de los resultados combinados.
4. Exportar los datos combinados de la velocidad media de migración y el valor promedio del coseno de una hoja de cálculo para trazar los gráficos de barras (Figura 5).

Resultados

Dos líneas de células de la próstata (PRN-1-1 y PNT2) se investigaron con este método. Las células en ambas líneas migran a velocidades similares de 1,0 +/- 0,3 micras / min durante el transcurso de 2 horas (figura 5A). Sin embargo, la direccionalidad al campo eléctrico es 0,7 +/- 0,3-PRN para la línea 1-1, y 0,2 +/- 0,8 para la línea PNT2 (Figura 5B). Los resultados muestran una diferencia significativa en la galvanotaxia de estas dos líneas celulares (p <0,01, 100 célula...

Discusión

El análisis de la respuesta galvanotaxia de una célula ha sido un indicador funcional importante para muchos migratoria o crecimiento celular procesa ^{27, 28.} Aquí se utiliza una cámara de medida con la superficie de vidrio a la película dos líneas celulares de próstata. Estas líneas celulares demostraron diferentes grados de galvanotaxia, y especulan que la localización intracelular o la activación de las proteínas galvanotaxia-mediación pueden ser interferidas durante el proceso de generación de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6 ml syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft