In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Resumen

Proteína arginina metilación, catalizada por una clase de enzimas viz., La proteína arginina metil transferasas (PRMTs), es el proceso de adición enzimática de grupo (s) metilo para argininas dentro de las proteínas. El ensayo de metilación in vitro es la herramienta más fiable para evaluar el estado de metilación de sustratos PRMT conocidos o nuevos.

Resumen

Proteína arginina metilación es una de las más abundantes modificaciones post-traduccionales en el núcleo. Proteína arginina metilación se puede identificar y / o determina a través de enfoques proteómicos, y / o inmunotransferencia con anticuerpos específicos metil-arginina. Sin embargo, estas técnicas a veces pueden ser engañosas ya menudo proporcionan resultados positivos falsos. Más importante, estas técnicas no pueden proporcionar evidencia directa en apoyo de la especificidad de sustrato PRMT. Los ensayos in vitro de metilación, por otro lado, son ensayos bioquímicos útiles, que son sensibles, y consistentemente revelan si las proteínas identificadas son de hecho los sustratos PRMT. Un ensayo típico de metilación in vitro incluye, PRMTs activos purificados, sustrato purificado y marcado con un radioisótopo metil donante ^{(S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina). Aquí se describe un protocolo de paso a paso para aislar PRMT1 catalíticamente activo, un miembro de la familia PRMT doquier expresó. El metransferasa actividades Thyl del PRMT1 purificada más tarde fueron probados en Ras-proteína activadora de GTPasa proteína de unión 1 (G3BP1), un sustrato PRMT conocido, en presencia de ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina como donante de metilo. Este protocolo se puede emplear no sólo para establecer el estado de metilación de sustratos fisiológicos PRMT1 nuevos, sino también para la comprensión del mecanismo básico de la metilación de arginina de proteínas.

Introducción

Metilación de proteínas fue descrita por primera vez en 1968 ^1. No fue sino hasta la primera clonación de PRMT1 en 1996, que los investigadores comenzaron a apreciar la importancia de esta modificación después de la traducción ^2. Curiosamente, alrededor del 2% de los residuos de arginina en las proteínas de extractos nucleares se metilado ^3, lo que indica la abundancia de esta modificación. La arginina es un aminoácido cargado positivamente con una cadena lateral básica y el nitrógeno / s dentro de las cadenas laterales de arginina puede ser modificado después de la traducción a través de la adición de un grupo metilo, un proceso conocido como arginina metilación ^4-6. Metilación de arginina es catalizada por una clase de enzimas viz., Transferasas proteína arginina metil (PRMTs). Argininas pueden o bien ser monometilado o dimetilado y el segundo pueden ser simétricos o asimétricos, dependiendo del tipo de PRMTs que catalizan el proceso de ^4-6.

Las proteínas que muestran argininamotivos ricos e-glicina son objetivos potenciales para la catálisis PRMT mediada. PRMT metilación mediada de sustratos se ha demostrado que modulan la interacción proteína-proteína, interacciones proteína-ácido nucleico, la función de proteínas, la expresión génica, y / o de señalización celular, todos los cuales son críticos para la homeostasis celular normal ^7-9. Con el fin de entender el papel biológico de la proteína metilación de arginina, se requieren ensayos precisos, eficientes y reproducibles para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados.

En ensayo de metilación in vitro, que evalúa las capacidades de PRMTs purificadas para catalizar la metilación de sus sustratos, es un ensayo bien aceptado para el estudio de la metilación de arginina ^10-12. El éxito general de este ensayo depende en gran medida de la actividad de los PRMTs purificados. PRMTs pueden ser expresadas y purificadas a partir de bacterias o células de mamífero, ^10,11. Este ensayo de metilación in vitro, como detailed en la sección de protocolo, se basa en un método descrito originalmente por Tini y sus colegas ^10. En este protocolo, se muestra en detalle los pasos necesarios para la expresión y purificación de PRMT1 en células de mamíferos. La capacidad de la PRMT1 purificada para catalizar la metilación en Ras GTPasa-activación de la proteína de unión a la proteína 1 (G3BP1), un sustrato conocido PRMT ^8, más tarde fue evaluada en presencia de ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina como el donante de metilo. Utilizando este ensayo, podemos definir con fiabilidad las habilidades de los PRMTs a la novela metilato o sustratos conocidos, que es un paso principal en el estudio de la metilación de arginina de proteínas.

Protocolo

1 Preparación de construcciones de expresión

1. Antes de comenzar el protocolo, PRMTs clones en vectores de expresión de mamífero con una etiqueta de epítopo N-terminal (Myc o HA), y el sustrato en marco con la glutatión-S-transferasa (GST) para la expresión de proteínas de alto nivel y purificación a partir de células bacterianas lisados, usando técnicas de biología molecular estándar.

2. Purificación de PRMTs

1. Utilice 100 mm cultura platos para mantener las células epiteliales bronquiales humanas (Beas2B). Pasaje de las células cada 3 días y no dejarlos crecer hasta confluencia.
2. En el día antes de la transfección, las semillas 7,5 x 10 ⁵ células en medio de cultivo de 10 ml en una placa de cultivo de 100 mm. Agitar para dispersar uniformemente las células, y se incuba a 37 ° C en un incubador de _CO2 humidificado 5%.
3. Al día siguiente, aspirar los medios de comunicación y añadir 5 ml de medio de cultivo sin suero y antibióticos. Agitar y aspirar el medio. Repita este paso unomás tiempo y, finalmente, añadir 5 ml de medio libre de suero / antibiótico y proceder a la transfección.
4. Diluir 6 g de ADN plásmido en 750 l de medio libre de suero en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml estéril.
5. En otro tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml, diluir 30 l de reactivo de transfección en 750 l de medio libre de suero.
6. Transferir la solución diluida reactivo de transfección (paso 2,5) al tubo que contiene el ADN diluido (paso 2.4). Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
7. Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 15 min.
8. Después de 15 minutos, la mezcla de transfección pipetear suavemente sobre las células, remolino para mezclar uniformemente, y se incuba a 37 ° C en un incubador de _CO2 humidificado 5%.
9. Después de 3 horas, aspirar el medio que contiene mezclas de transfección de las células. Añadir medio de cultivo celular fresco suplementado con suero y antibióticos.
10. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO ₂ humidificadoincubadora durante 48 horas.
11. Después de 48 h, la lisis de las células en 1 ml de tampón de lisis (1x solución salina tamponada con fosfato, 1% Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, y 1 mg / ml phenlymethyl sulfonil fluoruro). Recoger los lisados ​​en un tubo de centrífuga de plástico con un levantador de células e incubar los lisados ​​en hielo durante 30 min.
12. Centrifugar los lisados ​​a 15.000 xg durante 10 min en una centrífuga de sobremesa para borrar los lisados ​​de restos celulares. [* Se recomienda confirmar la expresión de HA-PRMT1 través inmunotransferencia de una parte alícuota de los lisados ​​con anticuerpos anti-HA, antes de proceder a la purificación de las enzimas para ensayo de metilación.]
13. Para la purificación de PRMTs, incubar 3 mg de lisados ​​celulares con 30 l de 50:50 suspensión de matriz de afinidad anti-HA en tampón fosfato salino (PBS), y rotar durante la noche a 4 ° C en un rotador de tubo.
14. Al día siguiente, girar los tubos a 14.000 xg en una centrífuga de sobremesa durante 2 minutos para recogerlas perlas. Descartar el sobrenadante y lavar las perlas 3 veces con 1 ml de tampón RIPA [Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM y 1% de Triton-X-100] en cada lavado seguido de centrifugación a 14.000 xg durante 2 min. Después del tercer lavado, lavar las perlas una vez con 100 l de tampón de metilación (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM de MgCl _2, 1 mM β-mercaptoetanol, sacarosa 100 mM). Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante. Las perlas que contienen los PRMTs inmovilizados están listos para ser utilizado en el ensayo de metilación. [* Se recomienda utilizar los PRMTs inmovilizados inmediatamente en el ensayo de metilación.]

3. Purificación de Sustrato

1. Inocular una sola colonia de GST-G3BP1 transformó BL21 en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contenían 100 mg / ml de ampicilina. Crecer los cultivos durante la noche a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
2. Al día siguiente, transferir el cultivo durante la noche a 50 ml de medio LB fresco y continue crezca a un OD ₆₀₀ de 0,5-0,7 (tarda aproximadamente 2 horas).
3. Cuando el OD ₆₀₀ alcanza 0,5-0,7, añadir isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y continuar a la cultura de 4 horas adicionales a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
4. Recoger las células por centrifugación a 1500 xg durante 10 minutos, y el proceso de la pastilla para la purificación GST o almacenar a -80 ° C.
5. Vuelva a suspender el sedimento bacteriano en 5 ml de tampón de lisis (PBS 1x con inhibidores de proteasa, 100 g / ml de lisozima, y ​​0,1% de Triton-X-100) y se incuban los lisados ​​a 37 ° C durante 30 min. En este momento los lisados ​​aparecerá turbia y viscosa debido a la liberación de ADN genómico bacteriano.
6. Cortar el ADN genómico por tratamiento con ultrasonidos (10 pulsos de 1 seg cada uno con una amplitud de 30%).
7. Borrar los lisados ​​por centrifugación a 15.000 xg durante 10 min y transferir el sobrenadante transparente a un tubo de 15 ml. Si el sobrenadante no está claro repetir el centrifugación proceso una vez más.
8. Mientras tanto, lavar las perlas de sefarosa-GST dos veces con PBS enfriado con hielo y hacer una suspensión 50:50 de GST-sefarosa en PBS. Añadir 200 l de la suspensión GST-sefarosa al lisado celular bacteriana despejado y rotar a 4 ° C durante 1 hr.
9. Después de 1 hora, centrifugar los tubos a 500 xg durante 3 minutos para recoger las perlas. Lavar las perlas 3 veces con PBS frío hielo.
10. Después del lavado final, resuspender las perlas en 100 l de tampón de elución (50 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, glutatión 30 mM) y girar a 4 ° C durante 10 min.
11. Centrifugar los tubos a 15.000 xg durante 2 min y transferir el sobrenadante que contiene la proteína purificada en otro tubo de centrífuga de plástico. Llevar a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) análisis sobre 5 l de la proteína purificada junto con cantidades conocidas de albúmina de suero bovino (BSA) para estimar la concentración de la proteína purificada.

4. metilación Ensayo

NOTA: Realice los pasos siguientes en un área separada designada para el trabajo de radioisótopos y de acuerdo con los protocolos de la institución en la realización de experimentos con isótopos radiactivos.

1. Añadir 2 g de GST-sustrato purificada y una mezcla maestra que contiene tampón de metilación 1x (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM de MgCl _2, 1 mM β-mercaptoetanol, sacarosa 100 mM), 1 Ci de S-adenosil- ^L-[metil-3H] metionina, y agua hasta un volumen final de 10 l a los PRMTs inmovilizados (paso 2,13) ​​y se incuba la reacción a 30 ° C durante 1 hr.
2. Después de 1 hora, detener la reacción mediante la adición de 10 l de tampón de muestra 2x SDS. Después de la desnaturalización de las muestras a 95 ° C durante 10 min, separar las muestras en un gel de SDS-PAGE.
3. Más tarde, transferir las proteínas separadas del gel de SDS sobre membrana de nitrocelulosa mediante el uso de una transferencia electroforética semi-seco.
4. Después de la transferencia, cubrir la membrana con unutofluor (un intensificador de imagen autorradiográfica), y el rock lento durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de 2 horas, verter la autofluor y conservar para su uso posterior. [* Etiquetar el tubo como material radiactivo]
5. Aire rápidamente se seque la membrana en un papel de filtro, sellar en una bolsa de plástico y exponer la membrana a una película de rayos X a -20 ° C. Tiempo de exposición suficiente oscila entre 5-30 días.

5. Confirmación de la expresión PRMT y la igualdad de carga de Sustrato

1. Después de lograr exposiciones suficientes, transferir la membrana a una caja de plástico que contiene tampón de bloqueo [Tris-buffer salino con Tween-20 (TBST + leche descremada 3%)] y el rock suave durante 1 hora.
2. Deseche el tampón de bloqueo como residuos radiactivos. Incubar la membrana con anticuerpo anti-HA (dilución 1: 1.000) en TBST durante la noche a 4 ° C, con suave balanceo.
3. Lavar la membrana con TBST 3x e incubar la membrana con marcado con HRP anti-ratón anticuerpo secundario(1: 5000 dilución) en TBST a temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave.
4. Después de 1 hora, lavar la membrana con TBST 3x, y realizar la detección de quimioluminiscencia de proteínas con un sustrato de HRP.
5. Después de la detección de los PRMTs HA-etiquetados, incubar la membrana con solución de tinción Ponseau-S durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar rápidamente las 3x membrana con agua para detectar los sustratos GST-etiquetados. Escanear la imagen.

Resultados

Las habilidades de HA-PRMT1 de metilato de GST-G3BP1 se determinaron por un ensayo in vitro de metilación en. PRMT1 marcada con HA purificada a partir de lisados ​​de células Beas2B se empleó en una reacción de metilación que contiene GST-G3BP1, y 1 Ci de ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina, como un donante de metilo. PRMT1 podría catalizar eficazmente la metilación de GST-G3BP1 (Figura 1, panel superior). Reacciones de metilación utilizando menús desplegabl...

Discusión

El protocolo descrito en el presente documento se utiliza rutinariamente para establecer el estado de metilación de los sustratos PRMT identificados. Este ensayo robusto y consistente también proporcionará evidencia definitiva de la especificidad de PRMTs para sus sustratos. Los componentes clave para el éxito de este ensayo son: 1. Expresión de PRMTs en células de mamífero, 2. Actividad de PRMTs purificados, 3. Expresión y purificación de sustrato, y 4. transferencia Western completa de las proteínas a la mem...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific