В пробирке метилирования Пробирной по изучению белка аргинин метилирования

Резюме

Белок аргинин метилирование, катализируемой класса ферментов именно., Белок аргинин метил трансферазы (PRMTs), представляет собой процесс ферментативного добавлением метилового группы (групп) в пределах аргинина белков. В пробирке метилирование анализ является самым надежным инструментом для оценки статуса метилирования известных или новых субстратов PRMT.

Аннотация

Белок аргинин метилирование является одним из наиболее распространенных пост-трансляционных модификаций в ядре. Белок аргинин метилирование могут быть идентифицированы и / или определяется с помощью протеомическим подходов, и / или иммуноблоттинга с метил-аргинина специфических антител. Однако, эти методы иногда может ввести в заблуждение и часто предоставляют ложные положительные результаты. Самое главное, эти методы не могут обеспечить прямое свидетельство в поддержку PRMT субстратной специфичности. В пробирке метилирования анализы, с другой стороны, полезные биохимические анализы, которые чувствительны, и последовательно показывают, если определенные белки действительно PRMT подложки. Типичный в пробирке метилирование анализ включает очищенные активные PRMTs, очищенный субстрат и радиоизотопный помечены метил донора (S-аденозил-L [метил ³ H] метионина). Здесь мы опишем протокол шаг за шагом, чтобы изолировать каталитически активный PRMT1, а повсеместно выраженную члена PRMT семьи. Меняметил трансферазы из очищенного PRMT1 позже были протестированы на Рас-ГТФ активирующего белка связывающего белка 1 (G3BP1), известным PRMT субстрата, в присутствии S-аденозил-L- ^{[метил-3Н]} метионина в качестве донора метила. Этот протокол может быть использован не только для установления статуса метилирования новых физиологических PRMT1 субстратов, но и для понимания основной механизм белок аргинина метилирования.

Введение

Белок метилирование был впервые описан в 1968 году ^1. Он не был до первого клонирования PRMT1 в 1996 году, что исследователи начали ценить важность этого посттрансляционной модификации ^2. Интересно, что примерно на 2% остатков аргинина в белках ядерных экстрактов метилированный ^3, что указывает на обилие этой модификации. Аргинин представляет собой положительно заряженный аминокислотный с основной боковой цепи и азота / с в пределах боковых цепей аргинина может быть посттрансляционно изменена добавлением метильной группы, процесс, известный как аргинин метилирования ^4-6. Аргинин метилирование катализируется класса ферментов именно., Белок аргинин метиловый трансферазы (PRMTs). Аргинина может быть либо монометилированного или диметилированный а последний может быть либо симметричным или асимметричным в зависимости от типа PRMTs, катализирующих процесс ^4-6.

Белки, которые отображают аргинине-глицин богатые мотивы являются потенциальными мишенями для PRMT опосредованного катализа. PRMT опосредованного метилирование субстратов было показано, модулирует белок-белковое взаимодействие, взаимодействие белка-нуклеиновой кислоты, функции белка, экспрессию генов и / или передачи сигналов в клетке, все из которых имеют важное значение для нормального клеточного гомеостаза ^7-9. Для того чтобы понять биологическую роль белка аргинин метилирования, точные, эффективные и воспроизводимые анализы необходимы для установления статуса метилирования выявленных PRMT субстратов.

В пробирке метилирования анализа, который оценивает способности очищенного PRMTs катализировать метилирование их субстратов, является широко признанным анализа для изучения аргинин метилирование ^10-12. Общий успех этого анализа во многом зависит от активности очищенных PRMTs. PRMTs может быть выражена и очищают от бактерий или клеток млекопитающих ^10,11. Это в пробирке метилирование анализ, как дetailed в разделе протокола, основана на методе, впервые описанной Tini и коллег ^10. В этом протоколе, мы покажем подробно этапы в экспрессии и очистки PRMT1 в клетках млекопитающих. Способность очищенной PRMT1 катализировать метилирование на Рас-GTPase активации белка-связывающий белок 1 (G3BP1), известный PRMT подложки ^8, впоследствии оценивали в присутствии ^{S-аденозил-L-[метил-3Н]} метионина в качестве метил донора. С помощью этого анализа, можно надежно определить способностей PRMTs, чтобы повести метилата или известных субстратов, который является основным шагом в изучении белок аргинина метилирования.

протокол

1 Получение экспрессирующие конструкции

1. Перед началом протокола, клон PRMTs минуте векторов экспрессии млекопитающих с N-терминал эпитопной меткой (Мус или HA), и подложки в рамке с глутатион-S-трансферазы (GST) для высокого уровня экспрессии белка и очистки от бактериальной клетки лизаты, с использованием стандартных молекулярно-биологических методов.

2 Очистка PRMTs

1. Используйте 100 мм чашки для культивирования для поддержания человека бронхиальных эпителиальных клеток (Beas2B). Пассаж клетки каждые 3 дня и не позволяйте им расти до слияния.
2. За день до трансфекции, семян 7,5 х 10 ⁵ клеток в 10 мл культуральной среды в 100 мм блюдо культуры. Вихревой, чтобы равномерно диспергировать клетки, и инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO _{2-инкубаторе.}
3. На следующий день, аспирация СМИ и добавить 5 мл культуральной среде без сыворотки и антибиотиков. Вихревой и аспирации среды. Повторите этот шаг одинбольше времени, и, наконец, добавить 5 мл сыворотки / антибиотиков свободной среде и перейти к трансфекции.
4. Развести 6 мкг плазмидной ДНК в 750 мкл бессывороточной среде в стерильном 1,5 мл пластиковые центрифужные пробирки.
5. В другом 1,5 мл пластиковую пробирку центрифуги, разбавленной 30 мкл реагента для трансфекции в 750 мкл бессывороточной среде.
6. Трансфер разбавленный раствор реагента для трансфекции (шаг 2.5) в пробирку с разбавленной ДНК (шаг 2.4). Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
7. Инкубируйте трансфекции смеси при комнатной температуре в течение 15 мин.
8. Через 15 мин пипетки трансфекции смесь осторожно на клетках, вихрем, равномерно смешать и инкубировать при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO _{2-инкубаторе.}
9. После 3 ч, аспирации среды, содержащей трансфекции смеси из клеток. Добавить свежую клеточную культуральную среду с добавлением сыворотки и антибиотиков.
10. Инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO ₂инкубатор в течение 48 часов.
11. Через 48 ч лизиса клеток в 1 мл лизирующего буфера (1x фосфатным буферным раствором, 1% Nonidet Р-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфата натрия и 1 мкг / мл phenlymethyl сульфонил фторид). Сбор лизатов в пластиковой центрифужной пробирке с сотовым подъемника и инкубировать лизатов на льду в течение 30 мин.
12. Центрифуга лизатов при 15000 мкг в течение 10 мин на скамейке центрифуге, чтобы очистить лизатов из клеток мусора. [* Настоятельно рекомендуется, чтобы подтвердить экспрессию HA-PRMT1 через иммуноблотинга аликвоты лизатов с анти-Ха антител, прежде чем приступить к очистке ферментов для метилирования анализа.]
13. Для очистки PRMTs, инкубировать 3 мг клеточных лизатов с 30 мкл суспензии 50:50 анти-Ха аффинной матрицы в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), и поворот в течение ночи при 4 ° С в трубчатой ​​ротатора.
14. На следующий день, спина пробирки при 14000 мкг на скамейке центрифуге в течение 2 мин, чтобы собратьшарики. Жидкость над осадком сливают и мыть шарики 3x 1 мл RIPA буфере [20 мМ Трис (рН 8,0), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА и 1% Triton-X-100] в каждой промывки с последующим центрифугированием при 14000 х г в течение 2 мин. После третьей промывки, мыть шарики один раз 100 мкл метилирования буфере (50 мМ Трис, рН 8,5, 20 мМ KCl, 10 мМ MgCl _2, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 мМ сахароза). После центрифугирования удалите супернатант. Гранулы, содержащие иммобилизованные PRMTs готовы быть использованы в анализе метилирования. [* Настоятельно рекомендуется немедленно использовать иммобилизованные PRMTs в метилирования анализа.]

3 Очистка субстрата

1. Инокуляции одну колонию от GST-G3BP1 преобразованы BL21 в 5 мл Лурии-Бертани (LB) среды, содержащей 100 мкг / мл ампициллина. Grow культур в течение ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
2. На следующий день, передавать ночной культуры в 50 мл свежей LB среды и продолжениеinue расти к OD ₆₀₀ из 0,5-0,7 (Она занимает около 2 ч).
3. Когда наружный диаметр ₆₀₀ достигает 0,5-0,7, добавить изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и продолжают культуре в течение дополнительных 4 ч при 37 ° С при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
4. Сбора клеток центрифугированием при 1500 х г в течение 10 мин, и обработать гранул для очистки GST или хранить при температуре -80 ° С.
5. Повторное приостановить бактериальный осадок в 5 мл буфера для лизиса (1х PBS с ингибиторами протеазы, 100 мкг / мл лизоцима и 0,1% Triton-X-100) и лизаты инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. В это время лизаты появится мутной и вязкой вследствие высвобождения бактериальной геномной ДНК.
6. На сдвиг геномной ДНК с помощью ультразвука (10 импульсов 1 сек каждой с амплитудой 30%).
7. Очистка с лизатов центрифугированием при 15000 х г в течение 10 мин и передавать прозрачный супернатант в 15 мл пробирку. Если супернатант не ясно повторить centrifuдование процесс еще раз.
8. Между тем, мыть GST-сефарозы дважды ледяной PBS и сделать 50:50 приостановление GST-сефарозе в PBS. Добавить 200 мкл GST-сефарозой суспензии очищенного лизата клеток бактерий и вращать при 4 ° С в течение 1 часа.
9. Через 1 ч пробирки центрифуги при 500 х г в течение 3 мин, чтобы собрать шарики. Вымойте бисером 3x ледяной PBS.
10. После последней промывки, ресуспендируют бисером в 100 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 30 мМ глутатион) и вращать при 4 ° С в течение 10 мин.
11. Центрифуга трубки при 15000 х г в течение 2 мин и передачи супернатант, содержащий очищенный белок в другой пластиковой центрифужной пробирке. Провести электрофорез в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE) Анализ на 5 мкл очищенного белка вместе с известными количествами бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы оценить концентрацию очищенного белка.

4 Метилирование Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в отдельном районе, выделенном для радиоизотопной работы и в соответствии с протоколами учреждения по проведению экспериментов с радиоактивными изотопами.

1. Добавить 2 мкг очищенного GST-подложки и мастер-смеси, содержащей 1х буфере метилирования (50 мМ Трис, рН 8,5, 20 мМ KCl, 10 мМ MgCl _2, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 мМ сахароза), 1 мкКи S-adenosyl- ^{L-[метил-3Н]} метионин, и вода до конечного объема 10 мкл с иммобилизованным PRMTs (шаг 2,13) ​​и инкубируют реакционную смесь при 30 ° С в течение 1 часа.
2. Через 1 час, остановить реакцию, добавив 10 мкл 2x SDS образец буфера. После денатурации образцов при 95 ° С в течение 10 мин, отдельные образцы на SDS-PAGE геле.
3. Позже, передавать выделенные белки из геля ДСН на нитроцеллюлозную мембрану с использованием полусухого электрофоретического переноса.
4. После передачи, покрыть мембрануutofluor (авторадиографические ЭОП), и осторожно встряхнуть в течение 2 часов при комнатной температуре. Через 2 часа, слить autofluor и сохранить для последующего использования. [* Этикетка трубку как радиоактивных материалов]
5. Быстро воздух сухой мембраны на фильтровальной бумаге, запечатать его в пластиковый пакет и подвергнуть мембрану к рентгеновской пленке при -20 ° С. Достаточное время экспозиции составляет от 5-30 дней.

5 Подтверждение PRMT слова и равных Загрузка субстрата

1. После достижения достаточного воздействия, передать через мембрану в пластиковой коробке, содержащей блокирующий буфер [трис-буферный солевой раствор с Tween-20 (TBST + 3% обезжиренным молоком)] и осторожно рок в течение 1 часа.
2. Откажитесь от блокирующий буфер как радиоактивных отходов. Выдержите мембрану с анти-HA антитела (1: 1000 разбавления) в TBST в течение ночи при 4 ° C, с нежным покачиванием.
3. Вымойте мембрану TBST 3x и инкубировать мембрану с HRP-меченными анти-мыши вторичного антитела(1: 5000 разведение) в TBST при комнатной температуре в течение 1 часа при осторожном качания.
4. После 1 ч, промывают TBST мембраны с 3x, и выполнять обнаружение chemiluminiscence белков с HRP субстрат.
5. После обнаружения HA-меченых PRMTs на, инкубировать мембрану Ponseau-S окрашивающим раствором в течение 5 мин при комнатной температуре. Быстро промыть мембраны 3 раза водой, чтобы обнаружить GST-меченый субстраты. Сканирование изображения.

Результаты

Способности HA-PRMT1 метилировать GST-G3BP1 определялись в пробирке метилирования анализа. HA-меткой PRMT1 очищен из клеточных лизатов Beas2B был использован в реакции метилирования, содержащей GST-G3BP1 и 1 мкКи S-аденозил-L- ^{[метил-3Н]} метионина, как метил донора. PRMT1 может эффективно катали?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, обычно используется для установления статуса метилирования выявленных PRMT субстратов. Эта надежная, и в соответствии анализ также предоставит окончательные доказательства на специфике PRMTs для их субстратов. Основные компоненты для успеха этого анализа явля?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific