In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l'arginine

Résumé

Protéine méthylation de l'arginine, catalysée par une classe d'enzymes à savoir. Protéine arginine méthyl transférases (en PRMT), est le processus d'addition enzymatique de groupe (s) méthyle arginines à l'intérieur des protéines. Le test de méthylation in vitro est l'outil le plus fiable pour évaluer l'état de méthylation de substrats connus ou nouveaux PRMT.

Résumé

Protéine méthylation de l'arginine est l'une des modifications post-traductionnelles les plus abondants dans le noyau. Protéine méthylation de l'arginine peut être identifié et / ou déterminé par l'intermédiaire d'approches de protéomique, et / ou immunotransfert avec des anticorps spécifiques méthyl-arginine. Cependant, ces techniques peuvent parfois être trompeuses et fournissent souvent des résultats faussement positifs. Plus important encore, ces techniques ne peuvent pas fournir une preuve directe à l'appui de la spécificité de substrat de PRMT. Des essais in vitro de méthylation, d'autre part, sont des dosages biochimiques utiles, qui sont sensibles, et révèlent systématiquement si les protéines identifiées sont en effet des substrats PRMT. Un dosage typique de méthylation in vitro, comprenant PRMT actives purifiées substrat purifié, et un radio-isotope marqué donneur de méthyle ^{(S-adénosyl-L-[méthyl-3H]} methionine). Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler PRMT1 activité catalytique, un membre de la famille de PRMT exprimé de façon ubiquitaire. Le moiThyl activités de transferase de la PRMT1 purifiés ont ensuite été testés sur Ras-GTPase activant la protéine de liaison 1 (G3BP1) protéine, un substrat de PRMT connu, en présence de ^{S-adénosyl-L-[méthyl-3H]} methionine en tant que donneur de méthyle. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour l'établissement de l'état de méthylation de nouveaux substrats de PRMT1 physiologiques, mais également pour la compréhension du mécanisme de base de la méthylation de l'arginine protéine.

Introduction

Méthylation des protéines a été décrite pour la première en 1968 ^1. Ce n'est que le premier clonage d'PRMT1 en 1996, que les chercheurs ont commencé à comprendre l'importance de cette modification post-traductionnelle ^2. Fait intéressant, environ 2% des résidus arginine dans les protéines d'extraits nucléaires sont méthylés ^3, ce qui indique l'abondance de cette modification. L'arginine est un acide aminé chargé positivement avec une chaîne latérale de base et la teneur en azote / s dans les chaînes latérales de l'arginine peut être modifié après la traduction par l'intermédiaire de l'addition d'un groupe méthyle, un processus connu comme l'arginine méthylation ^6.4. Arginine méthylation est catalysée par une classe d'enzymes à savoir. Protéine transférases, méthyle arginine (PRMT). Arginines peuvent être soit monométhylées ou diméthylées et celui-ci peut être soit symétrique ou asymétrique selon le type de PRMT catalysant le procédé ^4-6.

Les protéines qui présentent arginineriches motifs de e-glycine sont des cibles potentielles pour la catalyse de PRMT médiation. méthylation de PRMT médiée par des substrats a été montré pour moduler l'interaction protéine-protéine, une interaction protéine-acide nucléique, la fonction des protéines, l'expression des gènes, et / ou de signalisation cellulaire, qui sont critiques pour l'homéostasie cellulaire normale ^7-9. Afin de comprendre le rôle biologique de la protéine méthylation de l'arginine, les dosages précis, efficaces et reproductibles sont nécessaires pour établir le statut de méthylation des substrats de PRMT identifiés.

En test de méthylation in vitro, qui évalue les capacités de PRMT purifiées à catalyser la méthylation de leurs substrats, est un test bien accepté pour étudier la méthylation de l'arginine ^10-12. Le succès global de ce dosage dépend largement de l'activité des PRMT purifiés. PRMT peuvent être exprimées et purifiées à partir de bactéries ou de cellules de mammifères, ^10,11. Ce dosage in vitro de la méthylation, comme detailed dans la partie protocole, est basée sur un procédé décrit à l'origine par Tini et collègues ^10. Dans ce protocole, on montre en détail les étapes intervenant dans l'expression et la purification de PRMT1 dans des cellules de mammifères. La capacité de la PRMT1 purifiée pour catalyser la méthylation de Ras-GTPase activating protein protéine de liaison 1 (G3BP1), un substrat connu PRMT ^8, a ensuite été évaluée en présence de ^{S-adénosyl-L-[méthyl-3H]} methionine en tant que donneur de méthyle. En utilisant ce dosage, on peut définir de manière fiable les capacités des PRMT à nouveau le méthylate ou substrats connus, ce qui est une étape primordiale dans l'étude de la protéine méthylation de l'arginine.

Protocole

1 Préparation de constructions d'expression

1. Avant de commencer le protocole, PRMT clones dans des vecteurs d'expression de mammifère avec une étiquette d'épitope N-terminal (Myc ou HA), et le substrat dans le cadre avec la glutathion-S-transférase (GST) pour l'expression de protéine à haut niveau et la purification à partir de cellules bactériennes lysats, en utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire.

2 Purification de PRMT

1. Utilisez des boîtes de 100 mm de culture pour maintenir les cellules épithéliales bronchiques humaines (Beas2B). Passage des cellules tous les 3 jours et ne les laissez pas se développer jusqu'à confluence.
2. Le jour avant la transfection, semences 7,5 x 10 ⁵ cellules dans 10 ml de milieu de culture dans une boîte de culture de 100 mm. Agiter pour disperser uniformément les cellules et incuber à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 humidifié à 5%.
3. Le lendemain, aspirer les médias et ajouter 5 ml de milieu de culture sans sérum et antibiotiques. Agiter et aspirer le support. Répétez cette étape unplus de temps, et, enfin, ajouter 5 ml d'/ milieu sans antibiotique de sérum et de procéder à la transfection.
4. Diluer 6 pg d'ADN de plasmide dans 750 ul de milieu sans sérum dans un tube en plastique de 1,5 ml de centrifugation stérile.
5. Dans un autre tube à centrifuger en plastique de 1,5 ml, diluer 30 pi de réactif de transfection dans 750 ul de milieu sans sérum.
6. Transférer la solution de réactif de transfection dilué (étape 2.5) dans le tube contenant l'ADN dilué (étape 2.4). Mélanger doucement par aspiration et à plusieurs reprises.
7. Incuber le mélange de transfection à la température ambiante pendant 15 min.
8. Après 15 min, la pipette le mélange de transfection doucement sur ​​les cellules, agiter pour mélanger uniformément, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié CO ₂ de 5%.
9. Après 3 heures, aspirer le milieu contenant les mélanges de transfection des cellules. Ajouter du milieu frais de culture de cellules additionné de sérum et d'antibiotiques.
10. Incuber à 37 ° C dans un CO humidifié à 5% ₂incubateur pendant 48 heures.
11. Après 48 h, de lyser les cellules dans 1 ml de tampon de lyse (1x solution saline tamponnée phosphate, 1% Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium à 0,5%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium, et 1 ug / ml phenlymethyl sulfonyl fluorure). Recueillir les lysats dans un tube de centrifugeuse en matière plastique avec un dispositif de levage de pile et incuber les lysats sur de la glace pendant 30 min.
12. Centrifuger les lysats à 15 000 xg pendant 10 min sur une centrifugeuse de paillasse pour éliminer les lysats à partir des débris cellulaires. [* Il est fortement recommandé de confirmer l'expression de HA-PRMT1 par immunoblot d'une aliquote de lysats avec des anticorps anti-HA, avant de procéder à la purification des enzymes pour le dosage de la méthylation.]
13. Pour la purification de PRMT, incuber 3 mg de lysats de cellules avec 30 pl de suspension de 50:50 anti-HA matrice d'affinité dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), et faire tourner pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur de tubes.
14. Le jour suivant, tourner les tubes à 14000 xg dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 min à collecterles billes. Jeter le surnageant et laver les billes 3 fois avec 1 ml de tampon RIPA [20 mM Tris (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM et 1% de Triton-X-100] à chaque lavage suivie d'une centrifugation à 14 000 xg pendant 2 min. Après le troisième lavage, laver les billes une fois avec 100 pl de tampon de méthylation (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM de _MgCl2, 1 mM β-mercaptoéthanol, 100 mM de saccharose). Après la centrifugation, éliminer le surnageant. Les perles contenant des PRMT immobilisées sont prêts à être utilisée dans le dosage de la méthylation. [* Il est fortement recommandé d'utiliser immédiatement les PRMT immobilisés dans le test de méthylation.]

3 Purification de substrat

1. Inoculer une colonie unique de GST-G3BP1 BL21 transformé dans 5 ml de milieu Luria-Bertani (LB) contenant 100 ug / ml d'ampicilline. Cultiver les cultures pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
2. Le lendemain, transférer la culture de la nuit à 50 ml de milieu LB frais et suiteinue de croître à une _DO600 de 0,5-0,7 (Il faut environ 2 heures).
3. Lorsque la _DO600 atteigne 0,5 à 0,7, ajouter isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et de continuer la culture pendant encore 4 heures à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
4. Récolter les cellules par centrifugation à 1 500 g pendant 10 min, et traiter le culot pour la purification de la TPS ou conserver à -80 ° C.
5. Re-suspendre le culot bactérien dans 5 ml de tampon de lyse (PBS 1x avec des inhibiteurs de la protéase, de 100 pg / ml de lysozyme et 0,1% de Triton-X-100) et on incube les lysats à 37 ° C pendant 30 min. A cette époque, les lysats apparaîtront trouble et visqueuse due à la libération de l'ADN génomique bactérienne.
6. Cisailler l'ADN génomique par traitement aux ultrasons (10 impulsions d'une seconde chacune avec une amplitude de 30%).
7. Effacer les lysats par centrifugation à 15 000 g pendant 10 min et transférer le surnageant clair à un tube de 15 ml. Si le surnageant n'est pas clair répéter la centrifuprocessus gation un plus de temps.
8. Pendant ce temps, laver les billes de TPS-sépharose deux fois avec du PBS froid et faire une suspension à 50:50 de GST-sépharose dans du PBS. Ajouter 200 ul de la suspension de GST-sépharose au lysat de cellules bactériennes dégagée et tourner à 4 ° C pendant 1 heure.
9. Après 1 heure, centrifuger les tubes à 500 g pendant 3 min pour recueillir les perles. Lavez les perles 3x avec le froid de la glace PBS.
10. Après le lavage final, remettre en suspension les billes dans 100 pl de tampon d'élution (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 30 mM de glutathion) et tourner à 4 ° C pendant 10 min.
11. Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 2 min et transférer le surnageant contenant la protéine purifiée dans un autre tube à centrifuger en plastique. Effectuer gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) d'analyse de 5 pi de la protéine purifiée avec des quantités connues d'albumine de sérum bovin (BSA) afin d'estimer la concentration de la protéine purifiée.

4. test de Méthylation

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes dans une zone séparée désigné pour le travail de radio-isotopes et en conformité avec les protocoles de l'établissement sur la réalisation d'expériences avec des isotopes radioactifs.

1. Ajouter 2 ug de GST-substrat purifiée et un mélange maître contenant un tampon de méthylation 1x (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM de KCl, 10 mM de _MgCl2, 1 mM β-mercaptoéthanol, saccharose 100 mM), 1 uCi de S-adenosyl- ^{L-[méthyl-3H]} methionine, et de l'eau jusqu'à un volume final de 10 ul aux PRMT immobilisées de l'étape (2.13) et incuber la réaction à 30 ° C pendant 1 heure.
2. Après 1 h, stopper la réaction par addition de 10 pi de tampon d'échantillon SDS 2x. Après dénaturation des échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes, séparer les échantillons sur un gel SDS-PAGE.
3. Par la suite, le transfert des protéines séparées dans le gel SDS sur une membrane de nitrocellulose en utilisant un transfert électrophorétique semi-sec.
4. Après le transfert, couvrir la membrane avec unutofluor (une image de intensificateur autoradiographique), et bercer doucement pendant 2 h à température ambiante. Après 2 h, verser le autofluor et le conserver pour un usage ultérieur. [* Etiqueter le tube de matière radioactive]
5. Air rapidement sécher la membrane sur un papier filtre, l'enfermer dans un sac en plastique et d'exposer la membrane à un film X-ray à -20 ° C. Durée d'exposition suffisante varie entre 5-30 jours.

5 Confirmation d'expression et de l'égalité de PRMT Chargement de substrat

1. Après la réalisation de l'exposition suffisantes, transférer la membrane à une boîte en plastique contenant un tampon de blocage [solution saline tamponnée au Tris avec du Tween-20 (TBST + 3% de lait écrémé)] et balancer doucement pendant 1 heure.
2. Jetez le tampon de blocage en tant que déchets radioactifs. Incuber la membrane avec l'anticorps anti-HA (1: 1000 dilution) dans du TBST pendant une nuit à 4 ° C, avec des doux balancement.
3. Laver la membrane avec du TBST 3x et incuber la membrane avec un anticorps secondaire anti-souris marqué à la HRP(1: 5000 dilution) dans du TBST à température ambiante pendant 1 h avec doux balancement.
4. Après 1 heure, laver la membrane avec du TBST 3x, et effectuer la détection de chimiluminescence de protéines avec un substrat HRP.
5. Après détection des PRMT HA-tags, incuber la membrane avec une solution de coloration Ponseau-S pendant 5 min à température ambiante. Laver rapidement les 3x membrane avec de l'eau pour détecter les substrats de la TPS-étiqueté. Numériser l'image.

Résultats

Les capacités de HA-PRMT1 de méthylate TPS-G3BP1 ont été déterminées par un test in vitro de méthylation. PRMT1 étiquetée HA-purifié à partir de lysats de cellules Beas2B a été utilisé dans une réaction de méthylation contenant GST-G3BP1 et 1 uCi de ^{S-adénosyl-L-[méthyl-3H]} methionine, comme donneur de méthyle. PRMT1 pourrait efficacement catalyser la méthylation de TPS-G3BP1 (figure 1, partie supérieure). réactions de méthylation à l'aide de listes ...

Discussion

Le protocole décrit ici est couramment utilisée pour établir le statut de méthylation des substrats de PRMT identifiés. Ce test robuste et cohérente sera également apporter la preuve définitive de la spécificité de PRMT pour leurs substrats. Les éléments clés pour la réussite de ce test sont les suivants: 1 Expression de PRMT dans les cellules de mammifères, 2 Activité de PRMT purifiées, 3 Expression et purification de substrat, et 4 transfert occidentale complète des protéines de la membrane de nitro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific