In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Özet

Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır.

Özet

Protein arginin metilasyon çekirdeğinde en bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Protein arginin metilasyon tespit ve / veya proteomik yaklaşımlar ile belirlenir, ve / ya da metil-arginin özel antikorlar ile immunoblotting edilebilir. Ancak, bu teknikler bazen yanıltıcı olabilir ve sık sık yanlış pozitif sonuçlar vermektedir. En önemlisi, bu teknikler, metilasyon deneyler, diğer yandan, hassas olan yararlı biyokimyasal deneyler, in vitro olarak. PRMT substrat spesifikliği desteklemek için doğrudan bir kanıt sağlayamaz ve tanımlanan proteinlerin gerçekte PRMT alt-tabakalar ise sürekli olarak ortaya koymaktadır. Tipik olarak in vitro deney, metilasyon, saflaştırılmış aktif PRMTs saflaştırılmış alt-tabaka ve bir radyo-izotop işaretli metil donörü ^{(S-adenosil-L-[metil-3H]} metionin) içerir. Burada katalitik olarak aktif PRMT1 bir yerde ifade PRMT aile üyesi izole edilmesi için bir adım adım protokol açıklar. BeniSaflaştırılmış PRMT1 arasında methyl transferaz aktiviteleri daha sonra S-adenosil-L-metil donörü ^[metil-3H] Metioninin varlığında, protein 1 (G3BP1) bağlayıcı bir Ras-GTPaz aktive edici protein, bilinen bir PRMT alt-tabaka test edilmiştir. Bu protokol, yeni fizyolojik PRMT1 substratların metilasyon durumunu oluşturulması için değil, aynı zamanda protein arginin metilasyon temel mekanizmasını anlamak için sadece kullanılabilecektir.

Giriş

Protein metilasyonu ilk kez 1968 ¹ yılında tanımlanmıştır. Araştırmacılar ² Bu post-translasyonel modifikasyon önemini takdir başladı, 1996 yılında PRMT1 ilk klonlanması kadar değildi. İlginç bir şekilde, nükleer özler proteinlerinin arginin kalıntısının yaklaşık% 2, bu değişiklik gösteren bolluğu, ^3, metile edilir. Arginin olabilir arginin yan zincirleri içinde bir bazik yan zincire ve nitrojen / s olan, pozitif yüklü bir amino asit olup, çeviri sonrası bir metil grubu, arginin metilasyon ^4-6 olarak bilinen bir süreç eklenmesi ile değiştirilmiş. Arginin metilasyon enzim yani bir sınıf ile katalize edilmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs). Mono-ya da dimetile arjinin ve ikincisi işlemi ^4-6 katalize PRMTs türüne bağlı olarak simetrik veya asimetrik olabilir halinde olabilir.

Arginin gösterilecek ProteinlerE-glisin bakımından zengin motifleri PRMT aracılığıyla meydana gelen katalizler için potansiyel hedeflerdir. Substratların PRMT aracılı metilasyon normal hücresel homeostaz ^7-9 için çok önemli olan, her biri, protein-protein etkileşimi, protein-nükleik asit etkileşimi, proteinin, fonksiyon, gen ekspresyonunu, ve / veya hücresel sinyal modüle ettiği gösterilmiştir. Protein arginin metilasyon biyolojik rolünü anlamak için, kesin etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyler tespit PRMT substratların metilasyon durumunu oluşturmak için gereklidir.

Substratlannın metilasyonunu katalize etmek üzere saflaştırılmıştır PRMTs yeteneklerini değerlendirir nitro metilasyon tahlilinde, arginin, metilasyon ^10-12 araştırılması için kabul edilen bir testtir. Bu deneyin genel başarısı büyük oranda saflaştırılmış PRMTs aktivitesine bağlıdır. PRMTs ifade bakteri ya da memeli hücrelerinden ^10,11 saflaştırılabilir. D Bu in vitro deney, metilasyon,Protokol bölümünde etailed, orjinal Tini ve arkadaşları ¹⁰ tarafından tarif edilen bir yönteme dayanmaktadır. Bu protokol, detaylı olarak, memeli hücrelerinde PRMT1 ekspresyonu ve saflaştırılması yer alan adımları göstermektedir. Protein bağlayıcı protein 1 (G3BP1), bilinen PRMT alt-tabaka ^8, ras-GTPaz aktive edici ile metilasyonu katalizleme saflaştırılmış PRMT1 kabiliyeti daha olarak ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} Metioninin varlığında değerlendirildi metil donör. Bu analizi kullanarak, güvenilir bir şekilde bir protein arginin metilasyon çalışmada temel bir adımdır metilat roman ya da bilinen alt-tabakalar için, PRMTs yeteneklerini tanımlayabilir.

Protokol

Tanım yapılarından oluşan 1. Hazırlık

1. Protokolü başlamadan önce, bir N-terminal epitop (Myc veya HA) ve bakteriyel bir hücreden yüksek düzeyde protein ekspresyonu ve saflaştırılması için alt-tabaka çerçeve-içi glutation-S-transferaz (GST) ile bir memeli ifade vektörlerine klonlanabilir PRMTs Standart moleküler biyolojik teknikler kullanılarak lizatlarının.

PRMTs 2. saflaştırılması

1. İnsan bronş epitel hücrelerinin (Beas2B) sağlamak için, 100 mm kültür kaplarına kullanın. Passage hücreler her 3 gün ve onları izdiham büyümeye izin vermeyin.
2. Transfeksiyondan bir önceki gün, 100 mm kültür çanağı içinde 10 ml kültür ortamı içinde 7.5 x 10 ⁵ hücre tohum. Girdap hücreler eşit olarak dağıtmak, ve 5% _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe etmek.
3. Ertesi gün, medya aspire ve serum ve antibiyotik olmadan kültür ortamı 5 ml ekleyin. Girdap ve orta aspire. Bu adımı tekrarlayın biridaha fazla zaman, ve son olarak da, serum / antibiyotik içermeyen ortamdan 5 ml ilave edilir ve transfeksiyondan devam edin.
4. Steril 1.5 ml'lik plastik bir santrifüj tüpüne, serum barındırmayan ortam içinde 750 ul plazmit DNA'nın 6 ug seyreltin.
5. Başka bir 1.5 ml'lik plastik bir santrifüj tüpü, serum barındırmayan ortam içinde 750 ul transfeksiyon tepkin maddesi 30 ul seyreltin.
6. Seyreltilmiş DNA (aşama 2.4) içeren tüp seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi çözeltisi (adım 2.5) aktarın. Pipetleme ve birkaç kez yavaşça karıştırın.
7. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin transfeksiyon karışımı.
8. 15 dakika sonra, hücreler üzerine yavaşça transfeksiyon karışımı pipetle, girdap eşit karıştırın ve 5% _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe etmek.
9. 3 saat sonra hücreler transfeksiyon karışımları içeren ortamın aspire. Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş taze hücre kültür ortamı ilave edin.
10. % 5 nemlendirilmiş _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe48 saat boyunca kuluçka makinesi.
11. 48 saat sonra liziz tamponu 1 ml hücreler lize edildi (1 x fosfat tamponlu tuzlu su,% 1 Nonidet P-40,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat ve 1 ug / ml fenilmetil sülfonil fluorür). Hücre kaldırıcı plastik bir santrifüj tüpüne lisatlan toplayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizatları.
12. Hücre lizatları artıklardan temizlemek için bir masaüstü santrifüj ile 10 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin lizatları. [* Oldukça metilasyon analizi için enzimlerin saflaştırılması geçmeden önce bir anti-HA antikorlarına birleştirilmesi ile lizatları, bir alikotunun imünoblotlama ile HA-PRMT1 ekspresyonunu doğrulamak için tavsiye edilir.]
13. PRMTs saflaştırılması için, fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir anti-HA afinite matrisi 50:50 süspansiyonu 30 ul (PBS) ile hücre lizatlarının 3 mg inkübe ve bir tüp rotatör içinde 4 ° C'de gece boyunca döner.
14. Bir sonraki gün, toplamak için 2 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj ile 14,000 x g'de tüpler dönmeyeboncuklar. Süpernatant atılır ve 2 için 14,000 x g'de santrifüj ile yıkaması ve ardından taneler [20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCI, 5 mM EDTA ve% 1 Triton X-100] her RIPA tamponunda, 1 ml ile 3 kez yıkayın Min. Üçüncü yıkamadan sonra, metilasyona tamponu ile bir kez 100 ul boncuk yıkama (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCI, 10 mM _MgCI2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sükroz). Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak. Hareketsizleştirilmiş PRMTs ihtiva eden haplar, metilasyon deneyinde kullanılmak üzere hazırdır. [* Oldukça metilasyon tahlilde hemen hareketsiz PRMTs kullanmanız tavsiye edilir.]

Yüzey 3. saflaştırılması

1. GST-G3BP1 tek bir koloni 100 ug / ml ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) aracı maddesinde 5 ml BL21 transforme inoküle. 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de bir gece boyunca kültürler büyütün.
2. Bir sonraki gün, taze LB aracı ve Kontrol 50 ml kültür, gece boyunca aktarmainue (yaklaşık 2 saat sürer) bir OD 0,5-0,7 ₆₀₀ büyümeye.
3. OD ₆₀₀ 0,5-0,7 ulaştığında, 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ek bir 4 saat daha kültüre 1 mM nihai konsantrasyona kadar izopropil-β-D-tiyogalaktozid (IPTG) ekleyin ve devam edin.
4. 10 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj ile hücreler hasat ve -80 ° C 'de GST saflaştırılması veya deposu için pelet işler.
5. Liziz tamponu, 5 ml bakteriyel pelet yeniden askıya (proteaz inhibitörleri, lizozim, 100 ug / ml ile 1 x PBS'de% 0.1 Triton X-100) ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe lizatları. Bu zamanda bakteriyel lizatlar genomik DNA'nın serbest bırakılması için bulanık ve yapışkan görünür.
6. Sonikasyon ile genomik DNA (1 sn% 30 lik bir genlik ile her biri 10 palslarının) kayma.
7. 10 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj ile lizatları temizleyin ve 15 ml'lik bir tüp için berrak bir aktif madde aktarın. Süpernatant değil temizse Santrifüj tekrarlayıngasyon süreci bir kez daha.
8. Bununla birlikte, buz gibi soğuk PBS ile iki kez GST-sefaroz boncuklar yıkama ve PBS GST-sefarozun 50:50 süspansiyon elde etmek. Temizlenmiş, bakteri hücre lizat GST-sefaroz süspansiyonu 200 ul ilave edin ve 1 saat boyunca 4 ° C 'de döner.
9. 1 saat sonra, boncuk toplamak için 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj tüpleri. Boncuklar buz gibi soğuk PBS ile 3 kez yıkayın.
10. Son yıkamadan sonra, elüsyon tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCI, 30 mM glutatyon) 100 ul boncuk tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca 4 ° C 'de döner.
11. 2 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj tüpleri ve başka bir plastik bir santrifüj tüpü içine, saflaştırılmış proteini ihtiva eden üst sıvıyı aktarır. Saflaştırılmış protein konsantrasyonunu tahmin etmek için, sığır serumu albümini (BSA) ile birlikte bilinen miktarlarda saflaştırılmış proteinin 5 ul SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz gerçekleştirmek.

4. Metilasyon Deneyi

NOT: radyoizotop çalışmaları ve radyoaktif izotoplar ile deneyler üzerinde kurumun protokolleri ile uyumlu belirlenmiş ayrı bir alanda aşağıdaki adımları uygulayın.

1. Saflaştırılmış GST-alt-tabaka ve metilasyon 1x tamponu (50 mM Tris, pH 8.5, 20 mM KCI, 10 mM _MgCI2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sükroz), 1 uCi ihtiva eden bir ana karışımı 2 ug ekleyin, S-adenosil ^L-[metil-3H] metionin ve su hareketsizleştirilmiş PRMTs (aşama 2.13) ile 10 ul bir son hacme ve 1 saat boyunca 30 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.
2. 1 saat sonra, 2 x SDS örnek tampon maddesi 10 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 95 ° C'de numunelerin bozunmasından sonra, bir SDS-PAGE jeli üzerinde örnekleri ayırın.
3. Daha sonra, yarı-kuru elektroforetik transferi ile nitroselüloz zarı üzerine SDS jelden ayrılan proteinlerin aktarın.
4. Aktarımından sonra, bir ile membran kapakutofluor (bir oto radyografik görüntü yoğunlaştırıcı), yavaşça, oda sıcaklığında 2 saat boyunca sallayın. 2 saat sonra, autofluor kapalı dökün ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. [* Radyoaktif malzeme olarak tüp Etiket]
5. Çabuk hava bir filtre kağıdı üzerinde kuru zar, bir plastik torba içinde sızdırmaz hale getirir ve -20 ° C'de X-ışını filmine maruz membran. Yeterli pozlama süresi 5-30 gün arasında değişmektedir.

PRMT İfade ve Yüzey Eşit Yükleniyor 5. Onayı

1. Yeterli maruz elde edildikten sonra, bloke etme tampon içeren plastik bir kutu [Tween-20 (TBST +% 3 yağsız süt), Tris-tamponlanmış tuzlu su] için zarı transferi ve yavaşça 1 saat boyunca sallayın.
2. Radyoaktif atık olarak engelleme tampon atın. 4 ° C'de gece boyunca TBST içinde (1000 sulandırma 1) bir anti-HA antikoru ile membran inkübe Hafifçe çalkalanarak ° C olarak ölçülmüştür.
3. TBST ile 3x zarın yıkanması ve HRP-işaretli anti-fare ikincil antikoru ile membran inkübeHafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında TBST (1 5000 seyreltme).
4. 1 saat sonra, TBST'dir 3x zarın yıkanması ve bir HRP alt-tabaka ile kimyasal parlama proteinlerin tespiti gerçekleştirmek.
5. HA-etiketli PRMTs saptandıktan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Ponseau-S boyama solüsyonu ile membran inkübe edin. Hızlı GST etiketli substratlar tespit etmek için su ile zar 3 kez yıkayın. Görüntüyü tarayın.

Sonuçlar

GST-G3BP1 metillenmesi HA PRMT1 ait özellikler, bir in vitro deneyi ile metilasyon belirlenmiştir. Beas2B hücre lizatlarından arıtıldı HA-etiketli PRMT1 GST-G3BP1 ihtiva eden bir metilasyon reaksiyonunda kullanılmıştır ve bir metil vericisi olarak ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionin 1 uCi. PRMT1 etkili bir GST-G3BP1 (Şekil 1, üst panel) metilasyonunu katalize olabilir. Negatif kontrol (Şekil 1, üst panel, kuşak 1) olarak görev yapan, boş vektör ...

Tartışmalar

Burada tarif edilen protokol rutin olarak tespit PRMT substratların metilasyon durumunu belirlemek için kullanılır. Bu sağlam ve tutarlı bir tahlil de kendi alt tabakalar için PRMTs spesifıtesine kesin kanıt sağlayacaktır. Bu deneyde başarısı için anahtar bileşenleri şunlardır: Memeli hücrelerinde PRMTs 1. ekspresyonu arıtılmış PRMTs 2. Aktivite, 3. ekspresyonu ve alt-tabaka saflaştırılması ve nitroselüloz zara 4. Tam proteinlerin western transfer.

Rekombinant ifa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific