Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Resumen

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Resumen

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Introducción

Terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) es el proceso de utilización de la enzima TdT para adjuntar dUTP a extremos 3 'de doble y de cadena sencilla de ADN rompe ^12,23. El método TUNEL para la detección de la apoptosis y daño del ADN se informó por primera vez hace más de 20 años por Gavrieli et al. ^1,12,24. Desde entonces se ha evaluado y optimizado en diferentes preparaciones de tejidos ^7,23,27,40. TUNEL se ha utilizado para estudiar la isquemia inducida por la muerte celular de las neuronas ^6,14,29 y ^43,44 cardiomiocitos, la muerte celular neuronal excitotóxica ^30,31, y como biomarcador en el tratamiento de la artritis ^39. También se ha utilizado como un factor de pronóstico y marcador de células del tumor en varios cánceres humanos ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Existen métodos alternativos para el daño del ADN y detección de muerte celular, pero tienen dificultades técnicas y advertencias. Transferencia de Southern se puede usar para quantifdaños en el ADN y en el tejido lisados ​​enteros ^7,9-11, pero este método no proporciona resolución a nivel celular y es difícil de cuantificar. El ensayo cometa es un método basado en células alternativa que requiere la extracción de núcleos de células conservadas ^4,20,28,36. Aunque el ensayo cometa funciona bien en células aisladas en cultivo, es mucho más difícil de preparar núcleos intactos a partir de tejido muscular esquelético ^8,21. Al igual que con Southern blot, el ensayo cometa no proporciona información específica del tipo de célula de todo un homogeneizado de tejido muscular. Otra alternativa para el método TUNEL es inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra ADN monocatenario ^25,33,41 o en contra de las proteínas que participan en la respuesta al daño del ADN y la muerte celular vías (por ejemplo, p53, H2AX, y caspasas) ^13,17,22,40. Tales métodos basados ​​en anticuerpos requieren caracterización exhaustiva de anticuerpos y excelente especificidad del anticuerpo para producir una alta relación de señal a fondo. Incluso cuando specexisten anticuerpos IFIC, podrán exigir la desnaturalización de la proteína diana a través de los procedimientos de recuperación de antígeno ^34,35. Mientras discutimos aquí, la recuperación de antígenos en los resultados de tejido muscular en inaceptablemente alta autofluorescencia. A diferencia de los métodos alternativos, TUNEL logra detectar el daño del ADN con una señal de alto y bajo fondo, excelente especificidad que se puede probar con simples controles positivos y negativos, buena penetración en los tejidos que no requiere la recuperación de antígenos, y la resolución a nivel celular. Además, el método TUNEL tarda unas 4 horas en completarse, mientras que los métodos alternativos suelen requerir incubaciones durante la noche.

Estudiamos la muerte celular del músculo esquelético en un modelo de ratón de la atrofia muscular espinal (SMA) ¹⁰ que se ha generado por Hsieh-Li y sus colegas ^16. Para cuantificar las células apoptóticas en el músculo, hemos desarrollado un método de preparación de tejido, tinción y cuantificación que funciona con firmeza a través de diferentes skeleTal grupos musculares en diferentes puntos de tiempo de desarrollo en ratones. Utilizamos un kit TUNEL etiquetado disponible en el mercado y el software de análisis de imágenes disponible en el mercado. También hemos usado con éxito el ensayo de TUNEL en combinación con la tinción de inmunofluorescencia en la médula espinal ^10.

Los métodos descritos aquí son útiles para los investigadores que desean evaluar la patología del tejido, mecanismos de la enfermedad, los mecanismos del envejecimiento y del desarrollo (pre y post-natal) la muerte celular en el músculo esquelético. La técnica de TUNEL es especialmente útil para los estudios de daño y reparación del ADN y la muerte celular en sistemas modelo en el que sólo un subconjunto de las células es de resolución a nivel celular afectada y es necesario.

Este video describe la disección, el procesamiento de tejidos, seccionamiento, y TUNEL etiquetado basado en la fluorescencia del músculo esquelético del ratón. También se describe un método de semi-automatizado señal de cuantificación TUNEL.

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Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud ^26. El protocolo (MO13M391) fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y Uso.

1. Neonatal ratón Sacrificio, disección, y Fijación

1. Sacrificar un ratón neonatal por inhalación de _CO2.
2. Inmediatamente cortar el miembro posterior por encima de la rodilla. Hasta días aproximadamente postnatal 7, los huesos de las piernas son lo suficientemente suaves para cortar con tijeras grandes de laboratorio o cuchilla afilada y posteriormente la sección en un criostato.
3. Coloque la extremidad posterior en 10 ml de hielo frío 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de 15 ml.
4. Inmersión solucionar el miembro posterior en paraformaldehido durante 4-24 horas a 4 ° C. Tejido embrionario sólo requiere varias horass de fijación.
   1. Evite fijación más de 24 horas, ya que esto puede reducir la eficiencia TUNEL ensayo.
5. Cryoprotect la extremidad posterior por inmersión en solución de sacarosa.
   1. Cambiar paraformaldehído al 10% de sacarosa en PBS en el mismo tubo de 15 ml, incubar durante la noche a 4 ° C.
   2. Cambio a 30% de sacarosa en PBS, se incuban durante la noche a 4 ° C o hasta que los sumideros de los miembros posteriores a la parte inferior del tubo. Tissue se puede dejar en 30% de sacarosa durante un período más largo, siempre que la sacarosa ha sido filtrada de forma estéril.

2. Tejido incrustación

1. Llenar un molde de inclusión a medio camino marcado con un medio de inclusión.
2. Colocar las extremidades posteriores en la parte superior del medio de incrustación, con el lado del corte lo más cerca posible a una de las paredes del molde. Marcar la orientación de la extremidad posterior en el exterior del molde.
   1. Insertar varios miembros traseros y corte en el mismo bloque. Sin embargo, es importante asegurarse de que todo hindlimbs en el bloque están orientados paralelos entre sí para obtener secciones en búsqueda de los niveles a lo largo del eje de la extremidad.
3. Cubra miembros posteriores con medio de incrustación. Si extremidades posteriores cambian mientras se vierte el medio, les re-orientar con unas pinzas de punta roma o un palillo de dientes.
4. Permitir medio de inclusión para infiltrarse en el tejido a temperatura ambiente durante al menos 15 min.
5. Coloque los moldes directamente en hielo seco o en isopentano en hielo seco para congelar un medio de inclusión. Asegúrese de mantener el nivel de moldes en todo momento y evitar el desplazamiento del tejido embebido.
6. Mantenga moldes congelados a -80 ° C hasta que esté listo para cortar, durante hasta varios meses.

3. cryosectioning Embedded extremidades

1. Ajuste la temperatura cámara del criostato a -20 ° C, la temperatura del objeto a -18 ° C; ajustar la temperatura del objeto abajo según sea necesario.
2. Equilibrar el bloque de tejido dentro de la cámara del criostato durante al menos 30 min. Temp bloque correctabibliografía es crucial para la calidad de la sección.
3. Los cortes de secciones transversales con un espesor de 10 micras o menos. Secciones más gruesas no será totalmente penetradas por reactivos TUNEL. Utilice la placa estabilizadora, cuchillas, y el ángulo de la hoja (típicamente 5 °) recomendado para el criostato.
4. Recoger secciones Onto gelatin- o portaobjetos de vidrio recubiertos con Vectabond a temperatura ambiente. Coloque inmediatamente en una caja de portaobjetos en hielo seco. Mantenga la caja portaobjetos en un recipiente aparte con hielo seco colocado cerca del criostato alcance de la mano.
   1. Los cortes de secciones transversales en serie a través del eje largo de la extremidad, saltándose 100-200 micras. Recoge al menos 3 secciones adyacentes en cada nivel de serie.

4. Ensayo de TUNEL en las patas traseras Secciones utilizando un kit disponible comercialmente (todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique)

1. Descongele las diapositivas con secciones a temperatura ambiente y se seque durante la noche o el fin de semana.
2. Rehidratar secciones por immersing diapositivas en PBS durante 2 x 10 min en un tarro Coplin. Seque con un paño de laboratorio, la eliminación de la mayor cantidad de líquido alrededor de la sección de lo posible.
3. Secciones permeabilizar
   1. Utilice una no proteolítico, reactivo basado en saponina comercial o 0,5% de Tween 20 y 0,05% de Triton X100 en PBS.
   2. Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad. Una cámara de humedad simple es una caja de puntas de pipeta vacía con tapa hermética, con suficiente agua añadida para cubrir el fondo de la caja.
   3. Pipetear lo suficientemente reactivo sobre el portaobjetos para cubrir la sección (50 l es suficiente para extremidades de ratón neonatales). No pipetear directamente a la sección, como la agitación repetida puede causar la sección de levantar fuera de la diapositiva.
   4. Con unas pinzas de punta roma, colocar un pequeño rectángulo de parafina en la parte superior de la sección para extenderse la gota de reactivo y cubrir completamente la sección. Si todas las burbujas se forman bajo la parafina, levante suavemente si fuera poco, en seco, y volver a aplicar.
   5. Incubar los portaobjetos con permeabilización reactivo durante 1 hora en una cámara de humedad cubierta. Si las secciones comienzan a levantar de la diapositiva, el tiempo de permeabilización puede reducirse a 30 min.
   6. Lavar los portaobjetos en PBS en una jarra Coplin 2 x 5 min. Los rectángulos parafilm deben flotar en la parte superior y luego se pueden sacar y desechar.
   7. El uso de un paño de laboratorio, seque todo el líquido alrededor de las secciones como sea posible.
4. Etiquetado ruptura de ADN mediada por TDT
   1. Siga las instrucciones del juego para hacer 1x tampón TdT etiquetado, pipeta etiquetado de amortiguación suficiente sobre el portaobjetos para cubrir sección de tejido (50 l es suficiente para que los miembros de ratones neonatales). Incubar en la cámara de humedad durante 5 min. Alternativamente, sumerja el portaobjetos en tampón TdT etiquetado en una jarra Coplin.
   2. Siga las instrucciones del juego para hacer mezcla de marcaje TDT. El kit incluye el cobalto, magnesio, y cationes de manganeso; el catión de manganeso funciona bien en una variedad de tejidos, incluyendo el músculo esquelético, el sistema nervioso TISSUES, el hígado, la piel y los huesos.
   3. Para un control positivo, añadir DNasa (etiquetado "nucleasa" en el kit) a la mezcla de marcaje TdT. Alternativamente, pre-tratar una sección de control positivo con DNasa en tampón de nucleasa durante 1 hora a 37 ° C, de acuerdo con las instrucciones del kit. Mantenga solución de DNasa y secciones tratado con DNasa lejos de otras secciones experimentales para prevenir la contaminación cruzada.
   4. Para un control negativo, omita la enzima TdT de la mezcla de marcaje.
   5. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad de tampón TdT etiquetado de la diapositiva como sea posible. Mezcla de marcaje pipeta TDT en el portaobjetos (50 l por sección), cubrir con un nuevo rectángulo de parafina, y se incuba en la cámara de humedad a 37 ° C durante 1 hora.
   6. Siga las instrucciones del juego para hacer tampón de detención 1x. Utilice un paño de laboratorio para eliminar mezcla de marcaje TdT de la diapositiva, y añadir tampón de parada 200-300 l para cubrir la sección de tejido, e incubar en la cámara de humedad durante 5 min. Al ternatively, sumerja el portaobjetos en tampón de detención en una jarra Coplin.
   7. Lavar el portaobjetos 2 x 2 min en PBS. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad de PBS de la diapositiva como sea posible.
5. Fluorescente etiquetado
   1. Siga las instrucciones del kit para preparar solución de etiquetado con fluoresceína para etiquetar dNTPs en ADN se rompe. Solución de la pipeta en el portaobjetos (50 l por sección), cubrir con un nuevo rectángulo de parafina, y se incuba en la cámara de humedad durante 20 min.
   2. Lave los portaobjetos durante 2 minutos en PBS en una jarra Coplin. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad posible de PBS la diapositiva.
   3. Diluir Hoechst 33258 tinción nuclear a 1 g / ml en PBS y pipeta sobre la corredera (100-200 l es suficiente para cubrir la sección). Incubar en la cámara de humedad durante 5 min.
   4. Lavar 3x durante 5 min en PBS.
   5. Cubreobjetos con Antifade medio de montaje de fluorescencia y sellar los bordes con esmalte de uñas.

jove_title "> 5. Adquisición de Imagen Digital

1. Adquirir imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia convencional con DAPI, FITC, y los filtros de Texas Red (o equivalente). Utilice un objetivo mayor aumento (20X o 40X) para verificar que el etiquetado tuvo éxito y los núcleos (intactas o fragmentados) se marcaron. Un objetivo de 10X es suficiente para la cuantificación de puntos lagrimales TUNEL-positiva.
2. Recoger imágenes de la tinción de Hoechst, la tinción TUNEL, y la señal de autofluorescent como tres canales de color falso separadas combinadas en una sola imagen. Si la etiqueta fluoróforo TUNEL es verde, señal de imagen autofluorescent en el filtro rojo, y viceversa.
   1. Mantenga todos los ajustes de imagen equivalente entre diapositivas para su posterior umbral y cuantificación. Para cada filtro, tiempos preestablecidos y exposición récord, ganancia y hurgar en la basura (sin hurgar en la basura es el mejor); no utilice exposición o ganancia ajustes automáticos.
   2. Utilice ensayo y error para encontrar la exposición y los ajustes de ganancia que mejor capturar el rango de intendades en todas las diapositivas manchadas. Asegúrese de que no hay píxeles saturados en las imágenes obtenidas, ya que esta cuantificación sesgo voluntad.
3. Tome fotografías del grupo muscular entera de interés. Esto puede requerir varias imágenes que se "cosido" juntos.

Análisis 6. Imagen

1. Utilice los programas de análisis de imágenes disponibles en el mercado para analizar imágenes digitales de la tinción de TUNEL. Análisis utilizando software comercial se muestra aquí. Alternativamente, el software ImageJ libre de NIH se puede utilizar para analizar la tinción de TUNEL.
2. Teñir una sección adyacente a la sección de TUNEL-teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) y tomar una imagen digital de sección completa con un microscopio de campo claro convencional. Utilice esta imagen H & E en combinación con un atlas de anatomía ^5,18,19 trazar las estructuras anatómicas que ser cuantificados.
3. Con el canal TUNEL apagado, trazar manualmente el contorno de la zona a ser cuantificado, utilizandoHoechst y canales de autofluorescencia de orientación. Convertir el área de trazado en una máscara (un conjunto de coordenadas de píxel seleccionado para ser analizados).
4. Encienda el canal TUNEL. Uso de la función de umbral de intensidad en el programa de análisis de imagen, ajustar el umbral más bajo para excluir toda señal de autofluorescencia.
5. Aplicar la misma configuración de umbral para todas las imágenes de la unidad de estudios. Convertir selecciones de umbral en máscaras.
6. Para cada imagen, combinar la máscara área muscular y la máscara de TUNEL. La nueva máscara combinación representará señal de TUNEL en el área del músculo trazado solamente.
7. Realizar cuantificación máscara de la máscara combinación para determinar el número de objetos y el área de la señal de TUNEL en el área del músculo trazado objeto. Realice este utilizando la función de analizador de partículas en ImageJ.

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Resultados

Con la tinción de éxito, señal de TUNEL-positivas debe ser lo suficientemente brillante como para aislarlo de autofluorescencia estableciendo umbrales de intensidad. Objetos TUNEL-positivas a bajo aumento pueden aparecer fragmentos irregulares brillantes en el músculo esquelético (Figura 1A). Sin embargo, a mayor aumento, se deben observar algunos objetos TUNEL-positivas con la morfología apoptótica clásico, si el tipo de muerte celular en cuestión es la apoptosis (Figura 1B). ...

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Discusión

Un método para detectar y analizar cuantitativamente la apoptosis asociada a daño del ADN en el músculo esquelético de ratón se describe. El procedimiento incluye la recolección del tejido, tinción TUNEL, la adquisición de imagen digital, y análisis de imagen. Se necesitan suministros y herramientas histológicos comunes, y un kit comercial especial TUNEL es necesario. Los grandes elementos esenciales de equipos necesarios son un criostato, microscopio de epifluorescencia con capacidad de imagen digital, y un s...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline	Electron Microscopy Sciences	19202	For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma	S0389	Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat	Leica	CM 3050S	A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Slides from any supplier may be used.
Gelatin	Sigma	G-9391	Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)	Sigma	243361	Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent	Vector Labs	SP-1800	Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20	Sigma	P9416	A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100	Sigma	T8787	A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit	Trevigen	4812-30-K	Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
DNase/nuclease buffer	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water	Quality Biologicals	351-029-131	Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M	multiple	807	Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera	--	--	Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media	Vector Labs	H-1000	Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness	Brain Research Labs	2222-1	Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish	Ted Pella	114-8	Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.