마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

요약

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

초록

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

서문

터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 TDT () 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL)이 dUTP를 3를 연결합니다 가열 치사 효소를 사용하는 과정은 '단일 및 이중 가닥 DNA가 ^{12, 23 나누기} 끝입니다. 세포 사멸 및 DNA 손상의 검출을위한 TUNEL 방법은 첫째 Gavrieli 등. ^1,12,24 20 년 전에보고되었다. 그것은 이후 평가와 다른 조직 준비 ^{7,23,27,40에} 최적화되었습니다. TUNEL 뉴런 ^6,14,29 및 ^{43, 44} 심근 허혈에 의한 세포 죽음, 흥분성 신경 세포 사멸 ^{(30, 31)을} 연구하는 데 사용하고, 관절염 치료 ^(39)의 바이오 마커로하고있다. 또한, 다양한 인간 암에서 ^{2,3,15,32,37,38,42} 예후 인자 및 종양 세포 마커로 사용되었다.

다른 방법은 DNA 손상 및 세포 사멸 검출을 위해 존재하지만, 그들은 기술적 인 문제와주의 사항이 있습니다. 서던 블랏 quantif하는데 사용될 수있다Y DNA 전체 조직 해물 ^7,9-11 손상,하지만이 방법은 세포 수준의 해상도를 제공하고 정량화하기 어려운되지 않습니다. 혜성 분석은 세포 ^{4,20,28,36에서} 보존 핵을 추출 필요로하는 다른 셀 기반 방법입니다. 혜성 분석법 격리 배양 세포에서 잘 작동하지만, 골격근 조직 ^8,21에서 그대로 핵을 제조하는 것이 훨씬 더 곤란하다. 서던 블랏과 마찬가지로 혜성 분석은 전체의 근육 조직 파쇄 액으로부터 세포 유형 특정 정보를 제공하지 않는다. TUNEL 방법에 대한 또 다른 대안은 단일 가닥 DNA ^25,33,41에 대해 또는 DNA 손상 반응과 세포 사멸 경로에 (예를 들어 p53을, H2AX, 그리고 카스파) ^{13,17,22,40 참여} 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학이다. 이러한 항체 - 기반 방법은 높은 신호 대 백그라운드 비율을 수득 항체의 철저한 특성이 우수한 항체 특이성을 필요로한다. 경우에도 사양IFIC 항체들은 항원 검색 절차 ^{(34, 35)을} 통해 목적 단백질의 변성을 요구할 수있는. 우리가 여기에서 토론 할 때, 허용 할 수 없을 정도로 높은자가 형광의 근육 조직 결과에 항원 검색. 다른 방법과 달리, TUNEL 간단 양성 및 음성 대조군, 우수한 조직 침투 항원 검색을 필요로하지 않으며, 세포 수준의 해상도로 테스트 될 수있는 높은 신호, 낮은 백그라운드, 우수한 특이성 DNA 손상 검출을 달성한다. 다른 방법은 전형적으로 밤새 항온 처리를 요구하는 반면, 또한, TUNEL 방법은 완료하는 데 약 4 시간이 걸린다.

우리는 리튬 - Hsieh의 동료 ^(16)에 의해 생성 된 척수 근위축증 (SMA) ^(10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 사멸 연구. 근육 세포 사멸을 정량화하기 위해, 우리는 다른 skele 걸쳐 견고 작동 티슈 제조, 염색 및 정량하는 방법을 개발했다마우스에서 발달 상이한 시점에서 탈 근육 그룹. 우리는 시중에서 판매하는 TUNEL 라벨링 키트 및 상용 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 척수 ^(10)에 면역 형광 염색법과 함께 TUNEL 분석을 사용했다.

여기에 설명 된 방법은 골격 근육에서 조직 병리, 질병의 메커니즘, 노화의 메커니즘과 발달 (사전 및 산후) 세포 사멸을 평가하려는 연구자 유용합니다. TUNEL 기술은 세포의 서브 세트 만이 영향을 세포 수준의 해상도가 필요하다 모델 시스템에서의 DNA 손상과 수리 및 세포 사멸 연구에 특히 유용하다.

이 동영상은 해부, 조직 처리, 절편, 마우스 골격 근육의 형광 기반의 TUNEL 라벨을 설명합니다. 또한 반자동 TUNEL 신호 정량 방법을 설명한다.

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프로토콜

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 절차가 건강 ^(26)의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 프로토콜 (MO13M391)는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 신생아 마우스 희생, 해부 및 고정

1. CO ₂ 흡입 신생아 마우스를 희생.
2. 바로 무릎 위의 사지를 잘라. 약 출생 후 7 일까지, 다리 뼈는 저온 유지 장치에 연속적으로 섹션에 큰 실험실 가위 날카로운 칼날을 극복 할만큼 부드럽고합니다.
3. 15 ML 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS)에 차가운 얼음 4 % 파라 포름 알데히드 10 ㎖의 뒷다리를 놓습니다.
4. 집중은 4 ℃에서 4-24 시간 동안 파라 포름 알데히드의 사지를 고정합니다. 배아 조직은 여러 시간이 필요합니다고정의의.
   1. 이 TUNEL 분석 효율을 감소시킬 수 있으므로 24 시간보다 더 오래 고정을하지 마십시오.
5. 자당 용액에 침지하여 뒷다리를 Cryoprotect.
   1. 같은 15 ML 튜브에 PBS의 10 % 자당에 파라 포름 알데히드를 변경, 4 ℃에서 하룻밤 배양한다.
   2. PBS 30 % 수크로오스로 변경, 4 ° C에서 또는 튜브의 바닥 뒷다리 싱크까지 밤새 배양한다. 조직을 수크로오스 멸균 여과되었음을 제공, 긴 기간 동안 30 % 수크로오스에 남아있을 수있다.

2. 조직 포함]

1. 매체를 포함와 레이블이 포함 금형 절반 방법을 채 웁니다.
2. 몰드의 한쪽 벽에 최대한 가깝게 잘라면이 매립 매체 위에 배치 뒷다리. 금형의 외부에 뒷다리의 방향을 표시합니다.
   1. 여러 뒷다리를 포함하고 같은 블록으로 잘라. 그러나, 모든 힌을 확인하는 것이 중요하다블록 dlimbs은 사지의 축 방향과 일치하는 수준에서 섹션을 얻기 위해 서로에 대해 평행하게 배향된다.
3. 매체를 포함와 뒷다리를 커버. 매체를 붓는 동안 뒷다리가 이동하는 경우, 무딘 팁 집게 또는 이쑤시개로 다시 방향.
4. 적어도 15 분 동안 실온에서 조직에 침투되는 매립 매체 허용.
5. 직접 드라이 아이스 또는 드라이 아이스에 이소 펜탄에 넣어 금형은 매체를 포함 동결. 항상 금형 수준을 유지하고 내장 조직의 이동을 방지해야합니다.
6. 몇 달까지 들어 잘라 준비까지 -80 ℃에서 냉동 금형을 보관하십시오.

3. 냉동 절편 임베디드 사지

1. -20 ° C로 설정 저온 유지 챔버 온도, -18 ° C에서 객체 온도; 필요에 따라 개체를 아래로 온도를 조절합니다.
2. 적어도 30 분 동안 저온 유지 챔버 내부 조직 블록을 평형. 올바른 블록 온도erature 섹션의 품질에 대한 중요합니다.
3. 10 ㎛ 이하의 두께로 잘라 횡단면도. 두꺼운 섹션은 완전히 TUNEL 시약에 의해 침투되지 않습니다. 안티 - 롤 플레이트, 블레이드, 블레이드 각도를 사용하여 (일반적으로 5 °)는 저온 유지하는 것이 좋습니다.
4. 실온에서 젤라틴 또는 vectabond 코팅 된 유리 슬라이드 위에 섹션을 수집합니다. 드라이 아이스에서 슬라이드 상자에 바로 놓습니다. 팔의 손이 닿는 곳에 저온 유지 장치 부근에 드라이 아이스와 별도의 용기에 슬라이드 상자를 보관하십시오.
   1. 100 ~ 200 μm의 생략, 사지의 장축을 통해 가로 시리얼 부분을 잘라. 각 시리얼 수준에서 최소 3 인접한 섹션을 수집합니다.

상업적으로 사용 가능한 키트를 사용하여 뒷다리 섹션 4. TUNEL 분석 (실온에서 모든 단계를 언급하지 않는)

1. 실내 온도와 건조 야간 또는 주말 섹션이 슬라이드를 해동.
2. immersin로 섹션을 재수코 플린 항아리에 2 × 10 분 동안 PBS에서 g 슬라이드. 실험실 건조 가능한 부분 주위에 많은 액체를 제거 닦아냅니다.
3. Permeabilize 하시려면 섹션
   1. 비 단백질 분해, 사포닌 기반 상용 시약 0.5 % 트윈 20 0.05 % PBS에 트리톤 X100를 사용합니다.
   2. 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 충분한 물이 상자의 바닥을 추가로 포함하도록 간단한 습도 챔버는 뚜껑이 꽉 빈 피펫 팁 상자이다.
   3. 섹션을 충당하기 위해 슬라이드에 피펫 충분한 시약 (50 μl의 신생아 마우스 사지에 충분하다). 반복 교반 슬라이드를 떠 섹션의 원인이 될 수 섹션에 직접 피펫하지 마십시오.
   4. 무딘 팁 집게 사용 시약의 드롭을 확산 섹션의 상단에 파라 필름의 작은 사각형을 배치하고 완전히 섹션 커버. 모든 거품이 파라 필름에서 형성되면, 부드럽게 건조, 들어 올릴 및 다시 적용합니다.
   5. permeabili와 슬라이드를 품어덮여 습도 챔버에서 1 시간 동안 아네트 시약. 섹션 슬라이드에서 떠 시작하면, 투과성으로 시간은 30 분으로 감소 할 수있다.
   6. 코 플린 항아리 2 × 5 분에 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 파라 필름 사각형 상단에 떠 있어야하고 제거 및 폐기 될 수있다.
   7. 실험실을 사용하면, 가능한 한 섹션 주위에 많은 액체를 닦아 건조.
4. TdT에 매개 DNA 휴식 라벨링
   1. (50 μL 신생아 마우스 사지에 충분하다) 조직 부분을 충당하기 위해 슬라이드에 1 배 가열 치사 라벨 버퍼, 피펫 충분히 라벨 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 또한, 코 플린 항아리에 가열 치사 라벨 버퍼에 슬라이드를 담가.
   2. 가열 치사 라벨 믹스를 만들기 위해 키트 지침을 따르십시오. 키트는 코발트, 마그네슘, 망간 및 양이온을 포함한다; 망간 양이온은 골격 근육, 신경계, 담배 마는 포함, 다양한 조직에 잘 작동합니다UE들, 간, 피부, 뼈.
   3. 양성 대조군의 경우, 가열 치사 라벨 믹스의 DNase (키트에 표시된 "클레아 제")를 추가합니다. 대안 적으로, 키트 설명서에 따라, 37 ° C에서 1 시간 동안 클레아 버퍼와 DNase를 포지티브 제어부 미리 치료. 교차 오염을 방지하기 위해 멀리 다른 실험 섹션에서 DNase의 솔루션과 DNase를 처리 섹션을 유지합니다.
   4. 음성 대조군의 경우, 라벨 믹스에서 가열 치사 효소를 생략합니다.
   5. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 가열 치사 라벨 버퍼를 제거 와이프 ​​사용합니다. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 가열 치사 라벨 믹스, 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 1 시간 동안 37 ° C에서 습도 챔버에 품어.
   6. 1X 정지 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 슬라이드에서 가열 치사 라벨링 믹스를 닦아 제거하는 랩을 사용하여 조직 절편을 커버하도록 200-300 μL 정지 완충액을 추가 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 알 대체적으로, 코 플린 항아리에 정지 버퍼에 슬라이드를 담가.
   7. PBS에서 슬라이드 2 × 2 분을 씻으십시오. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용.
5. 형광 라벨
   1. DNA 나누기에 dNTPs를 레이블을 형광 라벨 용액을 제조 키트 지침을 따르십시오. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 솔루션은 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 20 분 동안 습도 챔버에 품어.
   2. 코 플린 항아리에 PBS에서 2 분 동안 세척 슬라이드. 연구소는 슬라이드에서 가능한 한 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용.
   3. 슬라이드에 1 μg의의 /의 PBS에서 ml의 피펫에 훽스트 33258 핵 얼룩을 희석 (100 ~ 200 μl의 부분을 커버하기에 충분하다). 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다.
   4. PBS에서 5 분 동안 배를 씻으십시오.
   5. antifade 형광 장착 미디어 커버 슬립과 매니큐어와 가장자리를 밀봉.

jove_title "> 5. 디지털 화상 취득

1. DAPI, FITC, 텍사스 레드 필터 (또는 동급)와 기존의 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 라벨이 성공과 핵 (손상 또는 조각)가 표시되었는지 확인하기 위해 높은 배율의 목표 (20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 10X 목적은 TUNEL 양성 puncta의 정량에 충분하다.
2. 하나의 이미지로 결합 별도의 세 가지 거짓 컬러 채널로 훽스트 염색, TUNEL 염색 및 autofluorescent 신호의 이미지를 수집합니다. TUNEL의 형광 라벨과 적색 필터, 이미지 autofluorescent 신호, 녹색이면 그 반대로.
   1. 이후 임계 값 및 정량 슬라이드 사이에 해당하는 모든 이미지 설정을 유지합니다. 각 필터, 사전 설정 및 녹화 노출 시간, 게인 및 비닝 (binning)을 위해 (더 비닝 (binning)는 최고의 없음); 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오.
   2. 가장 INTEN의 범위를 캡처 노출 및 게인 설정을 찾기 위해 시행 착오를 사용하여모든 스테인드 슬라이드에 걸쳐 잇고. 획득 된 이미지에는 포화 픽셀이 의지 바이어스 정량으로,이 없는지 확인하십시오.
3. 관심의 전체 근육 그룹의 이미지를 가져 가라. 이것은 함께 "스티치"할 여러 이미지를 필요로 할 수있다.

6. 이미지 분석

1. TUNEL 염색의 디지털 이미지를 분석하는 상용 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 분석 여기에 표시됩니다. 대안 적으로, NIH로부터 자유 소프트웨어가 ImageJ에 TUNEL 염색을 분석하는데 사용될 수있다.
2. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 TUNEL 염색 섹션에 인접한 섹션을 얼룩과 기존의 시야 현미경으로 전체 섹션 디지털 이미지를 촬영합니다. 정량화 할 수있는 해부학 적 구조를 추적 해부학 아틀라스 ^5,18,19와 조합이 H & E 이미지를 사용합니다.
3. TUNEL 채널을 끈 상태에서 수동으로 사용하여 정량 영역의 윤곽을 추적훽스트 (Hoechst)와 안내자가 형광 채널. 마스크로 추적 영역 변환 (선택한 화소의 세트를 분석 할 좌표).
4. TUNEL 채널을 켭니다. 이미지 분석 프로그램 기능을 임계 화 강도를 사용하여, 모든 자기 형광 신호를 제외하는 임계 값을 낮게 설정한다.
5. 연구 세트의 모든 이미지에 동일한 임계 값 설정을 적용합니다. 마스크로 역치 선택을 변환합니다.
6. 예를 들어, 각각의 이미지가 근육 영역 마스크와 마스크 TUNEL을 결합한다. 새로운 조합 마스크는 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호를 나타냅니다.
7. 객체의 수를 확인하고 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호의 영역을 객체로 조합 마스크에 마스크 정량을 수행합니다. ImageJ에있는 입자 분석기 기능을 사용하여이 작업을 수행합니다.

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결과

성공적인 조직 화학 염색, TUNEL 양성 신호 강도 임계치를 설정하여자가 형광 물질로부터 격리 할만큼 밝은해야한다. 낮은 배율에서 TUNEL 양성 개체는 골격 근육 (그림 1A)에 밝은 불규칙한 조각을 나타날 수 있습니다. 관련된 세포 사멸 유형은 세포 사멸 (도 1b) 인 경우에는 고배율, 고전 사멸 형태 일부 TUNEL 양성 개체 관찰되어야한다. 양성 대조군 (DNase를 추가) 섹션 (...

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토론

방법은 감지하고 정량적으로 설명 마우스 골격 근육에서 DNA 손상 관련 세포 사멸을 분석합니다. 절차는 조직 수확, TUNEL 염색, 디지털 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함한다. 일반적인 조직 학적 용품 및 도구가 필요하고, 특수 TUNEL 상업용 키트가 필요하다. 필요한 필수적인 큰 장비 항목은 저온 유지 장치, 디지털 영상 능력 epifluorescent 현미경 및 이미지 분석을위한 컴퓨터 시스템이다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline	Electron Microscopy Sciences	19202	For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma	S0389	Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat	Leica	CM 3050S	A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Slides from any supplier may be used.
Gelatin	Sigma	G-9391	Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)	Sigma	243361	Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent	Vector Labs	SP-1800	Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20	Sigma	P9416	A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100	Sigma	T8787	A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit	Trevigen	4812-30-K	Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
DNase/nuclease buffer	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water	Quality Biologicals	351-029-131	Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M	multiple	807	Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera	--	--	Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media	Vector Labs	H-1000	Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness	Brain Research Labs	2222-1	Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish	Ted Pella	114-8	Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.