Выявление и анализ повреждений ДНК в клетках мышиной скелетных мышц<em&gt; На месте</em&gt; Использование Тюнеля метод

Резюме

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Аннотация

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Введение

Терминал дезоксинуклеотидтрансферазу (TdT) дУТФ ник конец маркировка (TUNEL) является процесс с использованием фермента TdT приложить дУТФ к 3 'концах дважды и одноцепочечной ДНК разрушает ^12,23. Метод TUNEL для обнаружения апоптоза и повреждения ДНК впервые было сообщено в течение 20 лет назад Gavrieli и др. ^1,12,24. С тех пор были оценены и оптимизированы в различных тканевых препаратов ^7,23,27,40. TUNEL был использован для изучения ишемии-индуцированной гибели клеток нейронов ^6,14,29 и кардиомиоциты ^43,44, эксайтотоксический нейронов гибель клеток ^30,31, и в качестве биомаркера в лечении артрита ^39. Он также используется в качестве прогностического фактора и опухолевых клеток маркера в различных человеческих раковых ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Существуют альтернативные методы для повреждения ДНК и обнаружения гибели клеток, но они имеют технические проблемы и подводные камни. Саузерн-блоттинг может использоваться для quantifу повреждение ДНК в целом лизатов ткани ^7,9-11, но этот метод не дает разрешение сотовой уровня и трудно поддаются количественной оценке. Кометы анализ является альтернативным способом на основе клеток, что требуется извлечение сохранившиеся ядра из клеток ^4,20,28,36. Хотя комет хорошо работает на культивируемых изолированных клеток, это гораздо сложнее подготовить нетронутыми ядра от скелетной мышечной ткани ^8,21. Как Саузерну, комет не дает типов клеток конкретную информацию от целого мышечной ткани гомогенате. Другой альтернативой способу TUNEL является иммуногистохимии с использованием антител против одноцепочечной ДНК ^25,33,41 или против белков, участвующих в ответ повреждение ДНК и гибели клеток путей (например, р53, H2AX и каспазы) ^13,17,22,40. Такие методы на основе антител требует тщательного характеристику антител и отличную специфичность антител с получением высокого отношения сигнал-фон. Даже тогда, когда спецификациисуществуют БР антитела, они могут потребовать денатурации белка-мишени в соответствии с процедурами поисковых антиген ^34,35. Когда мы будем обсуждать здесь, антиген поиска в результатах мышечной ткани неприемлемо высокой флуоресценции. В отличие от альтернативных методов, TUNEL достигает обнаружение повреждений ДНК с высоким отношением сигнал и низким уровнем фона, отличную специфичность, которые могут быть проверены с помощью простых положительных и отрицательных контролей, хорошее проникновения в ткани, которые не требуют извлечения антигена, а разрешение сотовой уровня. Кроме того, метод TUNEL занимает около 4 часов, чтобы закончить, в то время как альтернативные методы, как правило, требуют ночные инкубации.

Мы изучаем скелетных смерть мышечных клеток в мышиной модели спинальной мышечной атрофии (SMA) ^10, которая была сгенерирована Се-Li и его коллеги ^16. Для количественной оценки апоптоза клетки в мышцы, мы разработали способ получения тканей, окрашивания и количественного который работает энергично через другой ШкелеTal группы мышц в различных развития временных точках мышей. Мы используем имеющийся в продаже TUNEL-маркировки комплект и коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Мы также успешно использовали анализ TUNEL в комбинации с иммунофлуоресцентного окрашивания в спинном мозге ^10.

Методы, описанные здесь, являются полезными для исследователей, которые хотят, чтобы оценить тканей патологии, механизмы заболевания, механизмы старения и развития (пре- и послеродовой) гибель клеток в скелетных мышцах. Методика TUNEL особенно полезно для исследований повреждений ДНК и ремонт и клеточной смерти в модельных системах, где только часть клеток зависит и клеточная разрешения уровня необходимо.

Это видео описывает вскрытие, обработки тканей, секционирование и флуоресценции основе TUNEL маркировки мыши скелетных мышц. Он также описывает способ полуавтоматического TUNEL сигнала количественного определения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения ^26. Протокол (MO13M391) был одобрен Комитетом Университета Джонса Хопкинса уходу и использованию животных мимо.

1. новорожденных мыши Жертва, рассечение, и фиксация

1. Пожертвуйте новорожденных мыши, CO ₂ ингаляции.
2. Сразу отрезать выше колена задней конечности. Примерно до послеродового день 7, кости ног не достаточно мягким, чтобы прорваться через большие лабораторных ножницами или острым лезвием и впоследствии раздел на криостата.
3. Поместите задних конечностей в 10 мл ледяной 4% параформальдегидом в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) в 15 мл пробирку.
4. Погружение зафиксировать задних конечностей в параформальдегида течение 4-24 ч при 4 ° С. Эмбриональной ткани требуется только несколько часовс фиксации.
   1. Во избежание фиксации больше, чем 24 ч, так как это может снизить эффективность анализа TUNEL.
5. Cryoprotect задних конечностей, погружая его в растворе сахарозы.
   1. Изменение параформальдегида до 10% сахарозы в PBS в той же трубе 15 мл, инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
   2. Изменение до 30% сахарозы в PBS, инкубируют в течение ночи при 4 ° С или до задней конечности опускается на дно пробирки. Ткань может быть оставлен в 30% сахарозы в течение более длительного периода, при условии, что сахароза была стерильно фильтруют.

2. Ткань вложения

1. Заполните меченого вложения плесени на полпути с вложение среды.
2. Поместите задних конечностей в верхней части вложения среды, с вырезом части как можно ближе к одной из стенок формы. Отметить ориентацию задней конечности на наружной стороне формы.
   1. Вставить несколько задних конечностей и сократить в том же блоке. Тем не менее, важно, чтобы убедиться, что все хинdlimbs в блоке ориентированы параллельно друг другу, чтобы получить секции в соответствие уровни вдоль оси конечности.
3. Обложка задних конечностей с вложение среды. Если задние конечности перейти при заливке среду, переориентировать их с тупыми наконечниками пинцета или зубочисткой.
4. Разрешить вложение среды, чтобы проникнуть в ткань при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
5. Место формы непосредственно на сухом льду или в изопентан на сухом льду, чтобы заморозить вложение среды. Удостоверьтесь, чтобы держать уровень прессформ во все времена и во избежание смещение встроенного ткани.
6. Держите замороженные формы при температуре -80 ° С до готовности, чтобы вырезать, в течение нескольких месяцев.

3. Cryosectioning Embedded Конечности

1. Установка криостата температуры в камере до -20 ° С, температура объекта до -18 ° С; регулировать температуру объекта вниз по мере необходимости.
2. Уравновешивают тканей блок внутри криостата камеры, по крайней мере, 30 мин. Правильный блок температуратературы имеет решающее значение для качества разделе.
3. Сокращение поперечные срезы с толщиной 10 мкм или менее. Более толстые участки не будут полностью проникает TUNEL реагентов. Используйте стабилизатор пластины, ножи и угол лезвия (как правило, 5 °) рекомендуется для криостата.
4. Соберите разделы на gelatin- или vectabond покрытием стеклах при комнатной температуре. Поместите сразу в слайд-поле на сухом льду. Сохраните упаковку слайд в отдельном контейнере с сухим льдом расположенной вблизи криостата на расстоянии вытянутой руки.
   1. Сокращение поперечной серийных срезов через длинной оси конечности, пропуская 100-200 мкм. Соберите по крайней мере 3 соседних участков на каждого последовательного уровне.

4. TUNEL пробы на задних конечностях частей с помощью коммерчески доступного набора (все шаги при комнатной температуре, если не указано иное)

1. Оттепель слайды с разделами до комнатной температуры и сухой на ночь или на выходные.
2. Увлажняет разделы от immersinг слайды в PBS в течение 2 × 10 мин в банке Коплин. Высушите лаборатории протрите, удаляя как можно больше жидкости вокруг секции, как это возможно.
3. Проницаемыми разделы
   1. Используйте или не-протеолитическую, сапонин основе коммерческого реагента или 0,5% Tween20 и 0,05% Triton X100 в PBS.
   2. Поместите слайд в камере влажности. Простой камера влажности является пустой пипетки коробка с плотной крышкой, с достаточным количеством воды, добавляют, чтобы покрыть дно коробки.
   3. Внесите достаточно реагент на слайд, чтобы покрыть часть (50 мкл достаточно для новорожденных конечностей мыши). Не пипетки непосредственно на участке, а повторное возбуждение может вызвать раздел для того чтобы поднять слайд.
   4. Использование тупыми наконечниками пинцета, поместите небольшой прямоугольник парафильмом на верхней части раздела разложить падение реагента и полностью покрывают раздел. Если пузырьки образуются под парафином, осторожно поднимите его, сухой, и повторно.
   5. Выдержите слайды с permeabiliзации реагента в течение 1 ч в закрытой камере влажности. Если части начинают отрываться от ползуна, время пермеабилизации может быть уменьшено до 30 мин.
   6. Вымойте слайды в PBS в Коплин банку 2 х 5 мин. Парафильмом прямоугольники должны плавать на поверхности и может снять и выбросить.
   7. Использование лаборатории салфеткой, сушить как можно больше жидкости вокруг участков, как это возможно.
4. ТДТ-опосредованной ДНК-брейк маркировка
   1. Следуйте инструкциям по установке, чтобы 1x TdT маркировки буфер, пипетки достаточно буфер маркировки на слайд, чтобы покрыть срезы ткани (50 мкл достаточно для новорожденных конечностей мыши). Инкубируют в камере влажности в течение 5 мин. Кроме того, погрузите слайд в TdT маркировки буфера в Коплин банку.
   2. Следуйте инструкциям по установке, чтобы TdT маркировки смеси. Комплект включает в себя кобальт, магний и катионов марганца; катионом марганца хорошо работает на разнообразных тканей, в том числе скелетных мышц, нервных TISS системыЕЭС, печени, кожи и костного.
   3. Для положительного контроля, добавить ДНКазы (обозначенный "нуклеазы" в наборе) в смеси маркировки TdT. Альтернативно, предварительно обработать положительный секцию управления с ДНКазы в нуклеазы буфера в течение 1 ч при 37 ° С, в соответствии с инструкциями набора. Держите решение ДНКазы и ДНКазы лечение разделы вдали от других опытных участков, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
   4. Для отрицательного контроля, опустить TdT фермент от маркировки смеси.
   5. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше TdT маркировки буфер из слайда, как это возможно. Пипетка TdT маркировки смесь на слайде (50 мкл) в разделе, крышка с новой прямоугольника парафином и инкубируют в камере влажности при 37 ° С в течение 1 часа.
   6. Следуйте инструкциям по установке, чтобы 1x буфер остановки. Использование лаборатории протереть, чтобы удалить TdT маркировки смесь из ползуна, и добавить 200-300 мкл буфера остановки, чтобы покрыть срезы ткани, и инкубируют в камере влажности в течение 5 мин. Аль ternatively, погрузите слайд в стоп-буфера в банке Коплин.
   7. Вымойте слайд 2 х 2 мин в PBS. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше PBS с горкой, как это возможно.
5. Флуоресцентных меток
   1. Следуйте инструкциям по установке, чтобы подготовить флуоресцеина решение маркировки на этикетке дНТФ в разрывов ДНК. Внесите раствора на слайде (50 мкл в разделе), накрыть новый прямоугольник парафильма, и инкубировать в камере влажности в течение 20 мин.
   2. Вымойте слайд в течение 2 мин в PBS в банке Коплин. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше PBS как можно дальше от слайда.
   3. Развести Hoechst 33258 ядерных пятно на 1 мкг / мл в PBS и пипеткой на предметное стекло (100-200 мкл достаточно, чтобы покрыть раздел). Инкубируют в камере влажности в течение 5 мин.
   4. Промыть 3 раза в течение 5 мин в PBS.
   5. Покровное с antifade флуоресценции монтажных СМИ и печать края с лаком для ногтей.

jove_title "Приобретение Digital Image> 5.

1. Получение изображений с помощью обычного флуоресцентного микроскопа с DAPI, FITC и Техас Red фильтров (или эквивалент). Используйте большее увеличение цели (20x или 40X), чтобы убедиться, что маркировка была успешной, и ядра (нетронутых или фрагментированные) были помечены. 10X Цель является достаточным для количественного определения TUNEL-положительных Puncta.
2. Собирают изображения окрашивания Hoechst, окрашивание TUNEL и autofluorescent сигнала в виде трех отдельных искусственных цветовых каналов, объединенных в одно изображение. Если флуорофор этикетки TUNEL зеленый, изображение autofluorescent сигнала в красный фильтр, и наоборот.
   1. Держите все настройки визуализации эквивалентны между слайдами для последующего порога и количественного определения. Для каждого фильтра, заданных и записи времени воздействия, усиления и биннинга (без отбора по не лучше); не использовать автоматические настройки экспозиции или усиления.
   2. Используйте проб и ошибок, чтобы найти настройки экспозиции и усиления, которые лучше всего учесть весь спектр Intenстей во всех окрашенных слайдов. Убедитесь, что нет насыщенные пиксели в получаемых изображений, как это количественного воля смещения.
3. Выполняйте съемку всей группы мышц интересов. Это может потребоваться несколько образов, которые будут "сшитые" вместе.

Анализ 6. Изображение

1. Используйте имеющиеся в продаже программы анализа изображений для анализа цифровых изображений окрашивания TUNEL. Анализ с использованием коммерческого программного обеспечения показано здесь. Кроме того, бесплатное программное обеспечение ImageJ от НИЗ может быть использована для анализа окрашивание TUNEL.
2. Пятно раздел прилегающей к секции TUNEL-окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) и взять полный раздел цифровое изображение с помощью обычного светлого микроскопа. Используйте этот H & E изображение в сочетании с анатомии атлас ^5,18,19 проследить анатомические структуры должны быть определены количественно.
3. С канала TUNEL выключен вручную отслеживать контур области, чтобы быть количественно, используяHoechst и автофлуоресцентной каналы для руководства. Преобразование прослеживается область в маске (множество выбранных координатах пикселей, которые будут проанализированы).
4. Включите канал TUNEL. Использование интенсивности пороговых значений функции в программе анализа изображения, установите нижний порог, чтобы исключить все автофлуоресцентной сигнал.
5. Примените те же настройки пороговых ко всем изображениям в наборе исследования. Преобразование порогами выбор в масках.
6. Для каждого изображения, объедините маску мышцы области и маску TUNEL. Новая комбинация маска будет представлять сигнал TUNEL в рамках прослеживается области мышц всего.
7. Выполните маски количественное от комбинации маску, чтобы определить количество объектов и объектов площадью сигнала TUNEL в рамках прослеживается области мышц. Выполните это, используя функцию анализатора частиц в ImageJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

С успешной окрашивания TUNEL-позитивный сигнал должен быть достаточно ярким, чтобы изолировать автофлюоресценции, установив пороги интенсивности. TUNEL-позитивные объекты на малом увеличении может отображаться в виде ярких нерегулярные фрагменты в скелетных мышцах (рис 1А). Тем н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод обнаружения и количественного анализа повреждений ДНК, ассоциированных с апоптоз в клетках мышиной скелетных мышцах описано. Процедура включает в себя сбор тканей, окрашивание TUNEL, цифровой захвата изображений и анализа изображений. Общие гистологические материалы и инструмен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline	Electron Microscopy Sciences	19202	For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma	S0389	Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat	Leica	CM 3050S	A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Slides from any supplier may be used.
Gelatin	Sigma	G-9391	Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)	Sigma	243361	Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent	Vector Labs	SP-1800	Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20	Sigma	P9416	A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100	Sigma	T8787	A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit	Trevigen	4812-30-K	Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
DNase/nuclease buffer	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water	Quality Biologicals	351-029-131	Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M	multiple	807	Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera	--	--	Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media	Vector Labs	H-1000	Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness	Brain Research Labs	2222-1	Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish	Ted Pella	114-8	Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.