Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Riepilogo

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Abstract

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Introduzione

Etichettatura fine nick Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP (TUNEL) è il processo di utilizzo dell'enzima TdT allegare dUTP al 3 'estremità del doppio e singolo filamento di DNA rompe ^12,23. Il metodo TUNEL per il rilevamento di apoptosi e danni al DNA è stato segnalato prima oltre 20 anni fa da Gavrieli et al. ^1,12,24. Da allora è stato valutato e ottimizzate in diverse preparazioni di tessuto ^7,23,27,40. TUNEL è stato utilizzato per studiare ischemia indotta morte cellulare dei neuroni ^6,14,29 e cardiomiociti ^43,44, eccitotossico morte neuronale ^30,31, e come biomarker nel trattamento dell'artrite ^39. E 'stato anche utilizzato come fattore prognostico e marker delle cellule tumorali in diversi tumori umani ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Esistono metodi alternativi per il danno al DNA e la rilevazione morte cellulare, ma hanno sfide tecniche e avvertimenti. Southern blotting può essere utilizzato per quantifdanno al DNA y in tutto lisati tissutali ^7,9-11, ma questo metodo non fornisce la risoluzione-livello cellulare ed è difficile da quantificare. Il Comet assay è un metodo a base di cellule alternativa che richiede l'estrazione di nuclei conservati dalle cellule ^4,20,28,36. Sebbene il saggio comet funziona bene su cellule isolate coltivate, è molto più difficile preparare nuclei intatti dal tessuto muscolare scheletrico ^8,21. Come con la macchia del sud, il test della cometa non fornisce informazioni cell-tipo-specifica da un intero tessuto omogenato muscolare. Un'altra alternativa al metodo TUNEL è immunoistochimica utilizzando anticorpi contro il DNA a singolo filamento ^25,33,41 o contro le proteine ​​che partecipano a percorsi di DNA di risposta danno e morte cellulare (ad es p53, H2AX, e caspasi) ^13,17,22,40. Tali metodi a base di anticorpi richiedono caratterizzazione completa di anticorpi ed eccellente anticorpo specificità per produrre un elevato rapporto segnale-background. Anche quando specEsistono anticorpi IFIC, possono richiedere la denaturazione delle proteine ​​bersaglio mediante procedure di recupero antigene ^34,35. Mentre discutiamo qui, il recupero antigene risultati tessuto muscolare in inaccettabilmente alto autofluorescenza. A differenza dei metodi alternativi, TUNEL raggiunge DNA rilevamento dei danni con un segnale alto e basso fondo, eccellente specificità che può essere testato con semplici controlli positivi e negativi, buona penetrazione tissutale, che non richiedono il recupero dell'antigene, e la risoluzione a livello cellulare. Inoltre, il metodo TUNEL dura circa 4 ore per completare, mentre i metodi alternativi in ​​genere richiedono incubazione durante la notte.

Studiamo la morte delle cellule del muscolo scheletrico in un modello murino di atrofia muscolare spinale (SMA) ¹⁰ che è stato generato da Hsieh-Li e colleghi ^16. Per quantificare cellule apoptotiche nel muscolo, abbiamo sviluppato un metodo di preparazione dei tessuti, la colorazione, e quantificazione che funziona robusto tra i diversi Skelegruppi muscolari Tal in diversi momenti dello sviluppo nei topi. Usiamo un kit TUNEL etichettatura disponibile in commercio e disponibile in commercio software di analisi dell'immagine. Abbiamo anche utilizzato con successo il test TUNEL in combinazione con immunofluorescenza nel midollo spinale ^10.

I metodi descritti sono utili per gli investigatori che vogliono valutare la patologia dei tessuti, dei meccanismi della malattia, i meccanismi di invecchiamento, e di sviluppo (pre e post-natale) la morte cellulare nel muscolo scheletrico. La tecnica TUNEL è particolarmente utile per gli studi di danno e riparazione del DNA e morte cellulare in sistemi modello in cui solo un sottoinsieme di celle è colpita e risoluzione livello cellulare è necessaria.

Questo video descrive la dissezione, processazione dei tessuti, sezionamento, e l'etichettatura TUNEL basato sulla fluorescenza del mouse del muscolo scheletrico. Viene inoltre descritto un metodo di semi-automatico del segnale quantificazione TUNEL.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state effettuate in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health ^26. Il protocollo (MO13M391) è stato approvato dall'Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins.

Sacrificio 1. neonatale mouse, Dissection, e fissazione

1. Sacrifica un mouse neonatale da CO ₂ inalazione.
2. Immediatamente tagliare il arti posteriori sopra il ginocchio. Fino al giorno di circa 7 postnatale, le ossa delle gambe sono abbastanza morbido per tagliare con forbici grandi laboratorio o lama affilata e alla successiva sezione un criostato.
3. Posizionare il hindlimb in 10 ml di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide in tampone fosfato salino (PBS) in una provetta da 15 ml.
4. Immersion fissare il arti posteriori in paraformaldeide per 4-24 ore a 4 ° C. Tessuti embrionali richiede solo alcune ores di fissazione.
   1. Evitare di fissaggio più di 24 ore, in quanto ciò potrebbe ridurre l'efficienza TUNEL assay.
5. Cryoprotect il arti posteriori immergendolo in una soluzione di saccarosio.
   1. Cambiare paraformaldeide al 10% di saccarosio in PBS nello stesso tubo 15 ml, incubare una notte a 4 ° C.
   2. Variazione al 30% di saccarosio in PBS, incubare una notte a 4 ° C o fino ai lavandini hindlimb al fondo della provetta. Tissue può essere lasciato nel 30% di saccarosio per un periodo più lungo, a condizione che il saccarosio è stata filtrata sterile.

2. Tissue Embedding

1. Riempire uno stampo embedding metà marcato con mezzo di inclusione.
2. Inserire hindlimb sopra il mezzo di inclusione, con la parte tagliata il più vicino possibile ad una parete dello stampo. Contrassegnare l'orientamento della arti posteriori sulla parte esterna dello stampo.
   1. Incorpora diverse arti posteriori e tagliare nello stesso blocco. Tuttavia, è importante assicurare che tutte hindlimbs nel blocco sono orientate parallelamente tra loro per ottenere sezioni in corrispondenza livelli lungo l'asse dell'arto.
3. Coprire arti posteriori con mezzo di inclusione. Se zampe posteriori spostano durante il versamento del mezzo, ri-orientare con una pinza a punta smussata o uno stuzzicadenti.
4. Lasciare mezzo di inclusione per infiltrarsi tessuto a temperatura ambiente per almeno 15 min.
5. Mettere gli stampi direttamente in ghiaccio secco o in isopentano in ghiaccio secco per congelare mezzo di inclusione. Assicurarsi di mantenere il livello di stampi in ogni momento e di evitare lo spostamento del tessuto incorporato.
6. Mantenere stampi congelati a -80 ° C fino al momento di taglio, fino a diversi mesi.

3. criosezionamento incorporato Limbs

1. Impostare temperatura della camera criostato a -20 ° C, la temperatura dell'oggetto a -18 ° C; regolare la temperatura dell'oggetto verso il basso, se necessario.
2. Portate il blocco di tessuto all'interno della camera criostato per almeno 30 min. Blocco corretta temperaturaerature è fondamentale per la qualità sezione.
3. Tagliare sezioni trasversali ad uno spessore di 10 micron o meno. Sezioni spesse non saranno pienamente penetrati da reagenti TUNEL. Utilizzare la piastra anti-rollio, pale, e l'angolo della lama (tipicamente 5 °), raccomandato per il criostato.
4. Raccogliere sezioni su gelatin- o vetrini vectabond rivestite a temperatura ambiente. Mettere subito in una scatola di diapositive in ghiaccio secco. Conservare la scatola diapositiva in un contenitore separato con ghiaccio secco posto in prossimità del criostato a portata di mano.
   1. Tagliare sezioni trasversali seriali attraverso l'asse dell'arto, saltare 100-200 micron. Raccogliere almeno 3 sezioni adiacenti a ciascun livello di serie.

4. TUNEL test sulle sezioni degli arti posteriori utilizzando un kit in commercio Disponibile (tutte le misure a temperatura ambiente se non indicato)

1. Scongelare vetrini con sezioni a temperatura ambiente e asciugare durante la notte o durante il fine settimana.
2. Reidratare sezioni di immersing vetrini in PBS per 2 x 10 min in una vaschetta Coplin. Asciugare con un laboratorio di pulire, rimuovere quanto più liquido intorno alla sezione possibile.
3. Sezioni permeabilize
   1. Utilizzare un non-proteolitici, reattivo a base di saponina commerciale oppure 0,5% e il 0,05% Tween20 Triton X100 in PBS.
   2. Posizionare il vetrino in una camera umida. Una semplice camera umida è una scatola vuota puntale con un coperchio a tenuta, con acqua sufficiente a coprire appena aggiunto il fondo della scatola.
   3. Pipetta abbastanza reattivo sul vetrino per coprire la sezione (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Non pipettare direttamente sulla sezione, come agitazione ripetuta può provocare la sezione per sollevare la diapositiva.
   4. Utilizzando pinze a punta smussata, posizionare un piccolo rettangolo di parafilm sulla parte superiore della sezione di diffondere la goccia di reagente e coprire completamente la sezione. Se le bolle si formano sotto la parafilm, delicatamente sollevarlo, asciutto, e riapplicare.
   5. Incubare i vetrini con permeabilireattivo zione per 1 ora in una camera umida coperta. Se sezioni iniziano a sollevarsi dalla diapositiva, tempo di permeabilizzazione può essere ridotto a 30 min.
   6. Lavare i vetrini in PBS in una vaschetta Coplin 2 x 5 min. I rettangoli parafilm dovrebbero fluttuare verso l'alto e può quindi essere rimosso e scartato.
   7. Utilizzando un laboratorio strofinata, asciugare quanto più liquido intorno sezioni possibili.
4. DNA etichettatura pausa TdT-mediata
   1. Seguire le istruzioni del kit per fare 1x buffer di etichettatura TdT, pipetta abbastanza buffer di etichettatura sul vetrino per coprire la sezione di tessuto (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Incubare nella camera umida per 5 min. In alternativa, immergere il vetrino in buffer di etichettatura TdT in una vaschetta Coplin.
   2. Seguire le istruzioni del kit per fare TdT mix di etichettatura. Il kit comprende cobalto, magnesio, manganese e cationi; il catione manganese funziona bene su una varietà di tessuti, compresi i muscoli scheletrici, tiss sistema nervosoUES, il fegato, la pelle e ossa.
   3. Per un controllo positivo, aggiungere DNase (etichetta "nuclease" nel kit) per il mix di etichettatura TdT. In alternativa, pre-trattamento di una sezione di controllo positivo con DNasi in tampone nucleasi per 1 ora a 37 ° C, secondo le istruzioni del kit. Tenere soluzione DNasi e sezioni DNasi trattati da altre sezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata.
   4. Per un controllo negativo, omettere TdT enzima dalla miscela etichettatura.
   5. Utilizzare un laboratorio wipe per rimuovere la maggior quantità di buffer etichettatura TdT dalla diapositiva possibile. Pipettare TdT mix etichettatura sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida a 37 ° C per 1 ora.
   6. Seguire le istruzioni del kit per fare tampone arresto 1x. Utilizzare un laboratorio pulire per rimuovere TdT mix etichettatura dalla diapositiva, e aggiungere 200-300 tampone di arresto microlitri per coprire la sezione di tessuto e incubare in camera umida per 5 min. Al ternativa, immergere il vetrino in buffer di arresto in una vaschetta Coplin.
   7. Lavare il vetrino 2 x 2 min in PBS. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere quanto più PBS dal vetrino possibile.
5. Etichettatura fluorescente
   1. Seguire le istruzioni del kit per la preparazione soluzione di etichettatura fluoresceina etichettare dNTP a rotture del DNA. Soluzione Pipettare sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida per 20 min.
   2. Lavare il vetrino per 2 minuti in PBS in una vaschetta Coplin. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere il più possibile dal PBS diapositiva.
   3. Diluire Hoechst 33258 colorazione nucleare a 1 mg / ml in PBS e pipetta sul vetrino (100-200 ml è sufficiente a coprire la sezione). Incubare nella camera umida per 5 min.
   4. Lavare 3x per 5 min in PBS.
   5. Coverslip con Antifade mezzi di montaggio fluorescenza e sigillare i bordi con smalto.

jove_title "> 5. Acquisizione Immagine Digitale

1. Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale con DAPI, FITC, e filtri Texas rossi (o equivalenti). Utilizzare un obiettivo più alto ingrandimento (20X o 40X) per verificare che l'etichettatura era successo e nuclei (intatti o frammentati) sono stati etichettati. Un obiettivo 10X è sufficiente per la quantificazione di puncta TUNEL-positive.
2. Raccogliere immagini della colorazione Hoechst, TUNEL colorazione, e il segnale autofluorescenti come tre canali a falsi colori separati uniti in una sola immagine. Se l'etichetta fluoroforo TUNEL è verde, segnale di immagine autofluorescenti nel filtro rosso, e viceversa.
   1. Mantenere tutte le impostazioni di imaging equivalente tra le diapositive per la successiva soglia e quantificazione. Per ogni filtro, i tempi prestabiliti e di esposizione di registrazione, il guadagno, e binning (senza binning è meglio); non utilizzare le impostazioni di esposizione o di guadagno automatico.
   2. Usa-prove ed errori per trovare esposizione e guadagno impostazioni che meglio catturare la gamma di intenpiazzole in tutti i vetrini colorati. Assicurarsi che non vi siano pixel saturi nelle immagini acquisite, in modo da pregiudizi quantificazione.
3. Prendere le immagini di tutto il gruppo muscolare di interesse. Questo può richiedere più immagini da "cuciti" insieme.

Analisi 6. Immagine

1. Utilizzare i programmi di analisi delle immagini disponibili in commercio per analizzare le immagini digitali di TUNEL colorazione. Analisi con software commerciale qui è mostrato. In alternativa, il software ImageJ esente da NIH può essere utilizzato per analizzare TUNEL colorazione.
2. Macchia una sezione adiacente alla sezione TUNEL macchiato con ematossilina eosina (H & E) e prendere un full-sezione di immagine digitale con un microscopio campo chiaro convenzionale. Usa questa immagine H & E in combinazione con un atlante di anatomia ^5,18,19 tracciare le strutture anatomiche da quantificare.
3. Con il canale TUNEL spento, tracciare manualmente il contorno dell'area da quantificare, utilizzandoHoechst e canali di autofluorescenza di orientamento. Convertire l'area tracciata in una maschera (un insieme di pixel selezionato coordinate da analizzare).
4. Attivare il canale TUNEL. Utilizzando la funzione di intensità thresholding nel programma di analisi delle immagini, impostare la soglia inferiore di escludere tutti i segnali autofluorescenza.
5. Applicare le stesse impostazioni di soglia a tutte le immagini del set di studio. Convertire le selezioni thresholded in maschere.
6. Per ogni immagine, combinare la maschera zona muscolare e la maschera TUNEL. La nuova maschera combinazione rappresenterà segnale TUNEL all'interno solo l'area del muscolo tracciato.
7. Eseguire maschera quantificazione sulla maschera combinazione per determinare il numero di oggetti e l'area del segnale TUNEL all'interno dell'area muscolare tracciata oggetto. Eseguire questo utilizzando la funzione Particle Analyzer in ImageJ.

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Risultati

Con la colorazione di successo, il segnale TUNEL-positivi dovrebbe essere abbastanza luminoso per isolare da autofluorescenza impostando soglie di intensità. Oggetti TUNEL-positive a basso ingrandimento possono apparire frammenti irregolari come brillanti nel muscolo scheletrico (Figura 1A). Tuttavia, a più alto ingrandimento, si devono osservare alcuni oggetti TUNEL-positivi con la classica morfologia apoptotica, se il tipo di morte cellulare in questione è l'apoptosi (Figura 1B).

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Discussione

Un metodo per rilevare e analizzare quantitativamente DNA danni associata apoptosi nel topo muscoli scheletrici è descritto. La procedura prevede la raccolta dei tessuti, TUNEL colorazione, l'acquisizione di immagini digitali, e l'analisi delle immagini. Sono necessarie forniture istologiche comuni e strumenti, e uno speciale kit di TUNEL commerciale è necessario. Gli elementi essenziali necessari grandi apparecchiature sono un criostato, microscopio epifluorescente con capacità di immagine digitale, e un sis...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline	Electron Microscopy Sciences	19202	For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma	S0389	Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat	Leica	CM 3050S	A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Slides from any supplier may be used.
Gelatin	Sigma	G-9391	Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)	Sigma	243361	Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent	Vector Labs	SP-1800	Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20	Sigma	P9416	A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100	Sigma	T8787	A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit	Trevigen	4812-30-K	Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
DNase/nuclease buffer	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water	Quality Biologicals	351-029-131	Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M	multiple	807	Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera	--	--	Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media	Vector Labs	H-1000	Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness	Brain Research Labs	2222-1	Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish	Ted Pella	114-8	Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.