Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Resumen

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Resumen

Modificaciones post-traduccionales (PTMs), tales como fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, y sumoylation, regulan la función celular de muchas proteínas. PTM de proteínas cinetocoro que se asocian con el ADN centromérico median segregación cromosómica fieles a mantener la estabilidad del genoma. Enfoques bioquímicos como la espectrometría de masas y análisis de transferencia Western son los más utilizados para la identificación de los PTM. Aquí, un método de purificación de proteínas se describe que permite la detección de tanto sumoylation y ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en Saccharomyces cerevisiae. Una cepa que expresa etiquetados-polihistidina-Bandera Smt3 (HF-Smt3) y Myc-etiquetados Ndc10 o Ndc80 fue construido y utilizado para nuestros estudios. Para la detección de sumoylation, ideamos un protocolo para purificar por afinidad proteínas sumoylated etiquetados-Su usando perlas de níquel y utilizamos Western blot con anti-Myc anticuerpos para detectar sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Para la detección de ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación de proteínas Myc-etiquetados y utilizamos Western blot con el anticuerpo anti-Ub para demostrar que Ndc10 y Ndc80 se ubiquitinated. Nuestros resultados muestran que el epítopo de etiquetado proteína de interés en el Su-Bandera etiquetado cepa Smt3 facilita la detección de múltiples PTM. Los estudios futuros deben permitir la explotación de esta técnica para identificar y caracterizar las interacciones de proteínas que son dependientes de un PTM específico.

Introducción

La ubiquitinación y la sumoilación permiten la conjugación de la ubiquitina y el modificador Pequeño ubiquitina-like (SUMO; Smt3 en S. cerevisiae ¹⁾ a una proteína diana, respectivamente. PTMs de proteínas kinetochore afectan a sus niveles celulares y las interacciones proteína-proteína durante las diferentes fases del ciclo celular para asegurar la segregación cromosómica fiel. Por ejemplo, los niveles celulares de Cse4 / CENP-A y proteínas cinetocoro externo DSN1 están regulados por la proteólisis mediada por ubiquitina de asegurar la estabilidad del genoma ^2-5. La desestabilización de accesorios-cinetocoro microtúbulos incorrectas requiere la quinasa B Ipl1 / Aurora, que fosforila Dam1 y Ndc80 complejos que interactúan directamente con los microtúbulos ^6-8. A pesar de la identificación de más de setenta proteínas cinetocoro, hay muy pocos estudios que investiguen las modificaciones de estas proteínas con PTM, por ejemplo, ubiquitina y SUMO. Una limitación importante es la capacidad de preservar la PTMs durante la purificación y la escasez de anticuerpos personalizados para la detección de PTM tales como sumoylation, fosforilación, metilación, y otros. Caracterización de proteínas cinetocoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1 y Ndc80 utiliza un anticuerpo encargo ^9. Además, Ndc10 ha sido implicado como un sustrato para la ubiquitinación ^10. Hec1 Humano (Ndc80 en S. cerevisiae) también está sustrato para la ubiquitinación, regulado por APC / C-hCdh1 E3 ligasa ^11. Por lo tanto, Ndc10 y Ndc80 son buenos candidatos para la optimización del protocolo para detectar tanto sumoylation y ubiquitinación en S. cerevisiae.

Para facilitar la identificación de sumoylation, construimos cepas que expresan HF-Smt3 y etiquetada-Myc Ndc10 o Ndc80. El uso de etiquetas de epítopo (HF: His6-Flag) minimiza el fondo debido a la reactividad cruzada que se observa frecuentemente en el suero policlonal generado contra una proteína candidato. Hemos elaborado un protocolo de afinidadpurificar conjugados de HF-Smt3 y luego se usa anticuerpos anti-myc anti-Flag y comercial para detectar la presencia de sumolyated Ndc10 y Ndc80 en la preparación Smt3 purificado. Para ubiquitinación, ideamos un protocolo de inmunoprecipitación modificada que conserva la ubiquitinación de las proteínas del cinetocoro Myc-etiquetados y realizó el análisis de Western blot con el anticuerpo anti-Ub comercial para detectar la ubiquitinación de Ndc10 y Ndc80.

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Protocolo

1. Crecimiento de células de levadura

1. Inocular células de levadura en 30 ml de YPD (Tabla 1) en un matraz pequeño. Incubar a 30 ° C durante la noche con agitación.
2. Diluir las células a una densidad óptica de 0,2 a 600 nm (OD ₆₀₀ = 0,2) en 50 ml de YPD y se incuba a 30 ° C con agitación.
3. Mantener el cultivo a una densidad óptica de 1,0 a 600 nm (OD ₆₀₀ = 1,0).
4. Centrifugar las células durante 5 minutos a 2.000 xg y descartar el sobrenadante.
5. Resuspender el sedimento celular en 40 ml de agua estéril y centrifugar durante 5 min a 2000 xg para lavar las células. Descartar el sobrenadante y el sedimento celular almacenar a -20 ° C.

2. Extracción de Proteínas

1. Resuspender las células en 0,5 ml de tampón enfriado con hielo de guanidina (Tabla 1) para el ensayo de pull-down usando perlas Superflow Ni-NTA o tampón A (Tabla 1) para la inmunoprecipitación. Mantenga los tubos en hielo en todo momento.
2. Transferencia a 2 ml tubo de tapón de rosca.
3. Añadir el mismo volumen de cuentas de vidrio (Tabla de Materiales).
4. Bolas de batir las células en un mini batidor grano (Tabla de Materiales) durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego se coloca en hielo durante 2-3 minutos. Repita esto tres veces.
5. Vortex a velocidad alta a 4 ° C durante 30-60 minutos. Compruebe las células mediante visualización bajo el microscopio para asegurar que las células se lisan.
   Nota: Las células lisadas aparecerán fantasmas oscuros y carecen de un límite o forma definida. De manera óptima al menos 80% de las células debe ser lisadas.
6. Perforar un agujero en la parte inferior del tubo utilizando un alfiler y el lugar en una colección de 15 ml tubo cónico (tapón de rosca debe ser suelta).
7. Centrifugar a 1000 xg durante 1 min para recoger el lisado.
8. Transferir el lisado a un tubo de micro centrífuga.
9. Centrifugar a 15000 xg durante 30 min a 4 ° C para recoger las proteínas extraídas.
10. Medir la concentración de las proteínas extraídas mediante el assa proteínay kit (Tabla de Materiales) y normalizar todos los extractos para contener la misma cantidad de proteína. Llevar el volumen total a 1 ml con tampón apropiado.
    Nota: Alrededor de 5 mg de proteína total se obtiene de 50 OD ₆₀₀ células.
11. Ahorre 50 l (g de proteína 250 si la proteína total extraído de paso 2,10 es 5 mg) en forma de extracto de células enteras (EBB). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x (Tabla 1) y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Cargar 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).

3. Purificación de HF-Smt3 conjugados

1. Obtener las perlas Superflow Ni-NTA (Tabla de materiales) necesarios para los experimentos (100 l de granos por muestra) por centrifugación a baja velocidad (800-1,500 xg) durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante.
2. Lave las perlas de 5x con 1 ml de PBS (Tabla de Materiales): Invertir top-sobre-inferior hasta que se vuelven a suspender las cuentas, recoger perlas por centrifugación a baja velocidad, y retire el sobrenadante.
3. Suspender perlas en 1 ml de tampón de guanidina (Tabla 1) y alícuota ellos en el número de tubos correspondientes a las muestras para ser procesados. Recoger los granos mediante centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante. Mezclar los granos bien invirtiendo arriba sobre la parte inferior.
   Nota: Mezclar los granos bien invirtiendo bottom top-over.
4. Para cada muestra, añadir 950 l de la WCE restante (del Paso 2.11: Extracción de proteínas) a 100 l de perlas de Ni-NTA Superflow.
5. Incubar en una plataforma oscilante a 4 ° C durante al menos 4 horas o durante la noche.
6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
7. Ahorre 50 l como sobrenadante (SUP). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Cargar 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: anal Western blotanalysis).
8. Perlas Lavar una vez con 1 ml de tampón de guanidina para 5-10 minutos sobre una plataforma oscilante.
9. Lavar las perlas de 5x con 1 ml de tampón de ruptura (Tabla 1) durante 5-10 minutos en una plataforma oscilante.
10. Perlas de resuspender en 90 l de tampón de muestra Laemmli 2x.
11. Añadir 10 l de 1 M imidazol.
    Nota: imidazol ayuda a disociar la proteína marcada con His de las perlas de Ni-NTA debido a la interacción que compiten entre imidazol y las perlas.
12. Incubar a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 minutos.
13. Vortex y centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
14. Cargar 10-20 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).
    Nota: 10-20 l corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, si se utiliza 5 mg de WCE.

4. La inmunoprecipitación de etiquetado-Myc proteínas cinetocoro

1. Obtener-c-Myc contra afinidad de agarosa un geltibody (Tabla de materiales) necesarios para los experimentos (25 l de resina por muestra) por centrifugación a baja velocidad (800-1,500 xg). Eliminar el sobrenadante.
2. Lave 5x resina con 1 ml de tampón A: top-sobre-fondo Invertir hasta que se volvió a suspender la resina, resina recogen por centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante.
3. Suspender resina en 1 ml de tampón A y alícuota ellos en el número de tubos correspondientes a las muestras para ser procesados. Recoger resina mediante centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante.
   Nota: Mezclar la resina bien invirtiendo top-sobre-fondo.
4. Añadir 950 l de la EBB restante (del Paso 2.11: La extracción de proteínas) a 25 l de resina.
5. Incubar en una plataforma oscilante a 4 ° C durante la noche.
6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
7. Ahorre 50 l como sobrenadante (SUP). Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli 2x y se incuba a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 min. Load 10 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).
8. Lave 5x resina con 1 ml de tampón A: top-sobre-fondo Invertir hasta que se volvió a suspender la resina, resina recogen por centrifugación a baja velocidad, y eliminar el sobrenadante.
9. Resuspender la resina en 100 l de tampón de muestra SUMEB (Tabla 1).
   Nota: tampón de muestra SUMEB contiene urea 8 M y SDS al 1% (fuerte condición de desnaturalización).
10. Incubar a 100 ° C en un bloque de calor durante 3-5 minutos.
11. Vortex y centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
12. Cargar 10-20 l de cada muestra en un gel de SDS-PAGE para el análisis de Western Blot (Sección 5: Western blot).
    Nota: 10-20 l corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, si se utiliza 5 mg de WCE.

5. Western Blot Analysis

1. Cargue los extractos de proteínas de 4-12% Bis-Tris geles (Tabla de Materiales) y perfelectroforesis orm a 120 V durante 90 min (Ejecución de búfer: Tabla de Materiales).
2. Transferencia de las proteínas a partir de gel a una membrana de nitrocelulosa (Tabla de Materiales) usando un aparato de transferencia a 30 V durante 90 minutos (tampón de transferencia: Tabla de Materiales).
3. Bloquear la membrana en 5% leche / TBST 1x (Tabla 1) durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario (Tabla de Materiales) en 5% de leche / 1x TBST durante la noche a 4 ° C. Para los anticuerpos primarios, utilizar una dilución de 1: 1000 (anticuerpos anti-Flag y anti-UB) o 1: 5000 (anticuerpo anti-Myc).
5. Lave 3x membrana durante 10 minutos cada uno con 1x TBST.
6. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (Tabla de Materiales) en 5% de leche / 1x TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice una dilución 1: 5000 de anticuerpos secundarios.
7. Lave 3x membrana durante 10 minutos cada uno con 1x TBST.
8. Incubar la membrana con ECL workisolución ng (Tabla de Materiales) durante 5 min.
9. Exponer la membrana sensible al azul película de rayos X (Tabla de Materiales) y desarrollar el uso de un programador automático (Tabla de Materiales).

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Resultados

Para detectar sumoylation de proteínas cinetocoro Ndc80 y Ndc10, cepas con HF-Smt3 y proteínas cinetocoro etiquetados-Myc (Ndc80 o Ndc10) fueron construidos (Tabla 2), como se describió anteriormente ^9,12. Conjugados HF-Smt3 fueron purificados por afinidad utilizando perlas de Ni-NTA. Western blot de purificado HF-Smt3 con un permitido la detección de anticuerpos anti-Bandera de formas sumoylated de sustratos SUMO que en la cepa control sin HF-Smt3 (Figura 1A y 1B...

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Discusión

Etiquetas de epítopo tales como HA, Myc, Flag, GST y son ampliamente utilizados para el análisis bioquímico de las proteínas. Construcción de cepas con HF-Smt3 y kinetochore proteínas etiquetadas-Myc, tales como Ndc10 y Ndc80, facilita la detección de PTM tales como sumoylation y ubiquitinación. HF-Smt3 desplegable ensayo permite la detección de proteínas cinetocoro sumoylated, Ndc10 y Ndc80 (Figura 1). El protocolo de purificación por afinidad y análisis de transferencia Western usando anti...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass beads	BioSpec Products	11079105	0.5 mm diameter
Mini beadbeater	BioSpec Products	#693	8 cell disrupter
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody	Covance	MMS-258R	Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay	Bio-Rad	500-0116
Nitrocellulose membrane	Novex	LC2001	0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Blue sensitive X-Ray film	Dbio	DBOF30003
Automatic developer	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg