Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Resumo

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Resumo

As modificações pós-traducionais (PTMs), tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, e sumoilação, regular a função de muitas proteínas celulares. PTMs de proteínas cinetócoro que se associam com DNA centromeric mediar segregação cromossômica fiéis para manter a estabilidade do genoma. Abordagens bioquímicas, tais como espectrometria de massa e análise de transferência de western são mais comumente utilizado para a identificação de PTMs. Aqui, um método de purificação de proteínas está descrito que permite a detecção de ambos sumoilação e ubiquitinação das proteínas cinetocoro, Ndc10 Ndc80, e em Saccharomyces cerevisiae. Uma estirpe que expressa polihistidina-Flag-etiquetado Smt3 (HF-Smt3) e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80 foi construída e utilizada para os nossos estudos. Para a detecção de sumoylation, eu inventei um protocolo para purificar por afinidade proteínas sumoylated His-tag usando esferas de níquel e usado western blot com anti-Myc anticorpo para detectar sumoylated Ndc10 umnd Ndc80. Para a detecção de ubiquitinação, que concebido um protocolo para a imunoprecipitação das proteínas Myc-tag e utilizada a análise de Western blot com um anticorpo anti-Ub para mostrar que Ndc10 e Ndc80 são ubiquitinadas. Os nossos resultados mostram que o epitopo marcado com proteína de interesse na sua bandeira-tagged Smt3 estirpe facilita a detecção de vários PTMs. Estudos futuros deverão permitir a exploração desta técnica para identificar e caracterizar as interações proteína que são dependentes de um PTM específico.

Introdução

Ubiquitinação e sumoilação permitir a conjugação de ubiquitina e modificador pequeno Ubiquitina-like (SUMO; Smt3 em S. cerevisiae ¹⁾ para uma proteína-alvo, respectivamente. PTMs de proteínas cinetócoro afectar os níveis celulares e interacções proteína-proteína durante as diferentes fases do ciclo celular para assegurar a segregação cromossómica fiel. Por exemplo, os níveis celulares de Cse4 / CENP-A e proteína cinetócoro exterior Dsn1 são regulados através de proteólise mediada por ubiquitina para assegurar a estabilidade do genoma ^2-5. A desestabilização das ligações cinetócoro-microtúbulo incorrectas requer a IPL1 / Aurora B-quinase, que fosforila e Dam1 Ndc80 complexos que interagem directamente com os microtúbulos ^6-8. Apesar da identificação de mais de setenta proteínas cinetócoro, há muito poucos estudos que investigam as modificações dessas proteínas com PTMs, por exemplo, ubiquitina e SUMO. Uma limitação importante é a capacidade de preservar a PTMs durante a purificação e a escassez de anticorpos para a detecção de mercadorias, tais como PTMs sumoilação, fosforilação, metilação, e outros. Caracterização de proteínas cinetócoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizou um anticorpo costume ^9. Além disso, Ndc10 tem sido implicado como um substrato para ubiquitinação ^10. Hec1 Humano (Ndc80 em S. cerevisiae) é também substrato para ubiquitinação, regulamentada pelo APC / C-hCdh1 E3 ligase ^11. Portanto, Ndc10 e Ndc80 são bons candidatos para otimização do protocolo para detectar tanto sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae.

Para facilitar a identificação de sumoilação, construiu-se as estirpes que expressam HF-Smt3 e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80. O uso de marcadores de epitopo (HF: His6-Flag) minimiza o fundo devido à reatividade cruzada que é frequentemente observada no soro policlonal criado contra uma proteína candidato. Eu inventei um protocolo de afinidadepurificar conjugados HF-Smt3 e, em seguida, utilizado anti-Flag comercial e anticorpos anti-myc para detectar a presença de sumolyated Ndc10 e Ndc80 na preparação Smt3 purificado. Para ubiquitination, eu inventei um protocolo de imunoprecipitação modificado que preserva ubiquitinação das proteínas cinetócoro Myc marcadas e realizadas análises de Western blot com o anticorpo anti-Ub comercial para detectar ubiquitination de Ndc10 e Ndc80.

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Protocolo

1. Crescimento de Células de Levedura

1. Inoculação das células de levedura em 30 ml de YPD (Tabela 1) em um balão pequeno. Incubar a 30 ° C durante a noite com agitação.
2. Dilui-se as células até uma densidade óptica de 0,2 a 600 nm (DO ₆₀₀ = 0,2) em 50 ml de meio YPD e incubar a 30 ° C com agitação.
3. Crescer a cultura a uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm _(DO600 = 1,0).
4. Centrifugar células durante 5 min a 2000 xg e desprezar o sobrenadante.
5. Ressuspender o sedimento celular em 40 ml de água estéril e centrifugar durante 5 minutos a 2000 x g para lavar as células. Descartar o sobrenadante e o sedimento de células armazenar a -20 ° C.

2. Extracção de proteínas

1. Ressuspender as células em 0,5 ml de tampão de guanidina arrefecido em gelo (Tabela 1) para o ensaio suspenso usando pérolas de Ni-NTA Superflow ou tampão A (Tabela 1) para imunoprecipitação. Manter tubos em gelo em todos os momentos.
2. Transferir a 2 ml tubo de tampa de rosca.
3. Adicionar o mesmo volume de esferas de vidro (Tabela de Materiais).
4. Conta-bater as células de uma mini-grânulo batedor (tabela de materiais) durante 2 min à temperatura ambiente, depois colocar sobre gelo durante 2-3 minutos. Repita isso três vezes.
5. Vortex em alta velocidade, a 4 ° C durante 30-60 min. Verificar as células por visualização sob o microscópio para garantir que as células são lisadas.
   Nota: As células lisadas aparece como fantasmas escuros e não têm um limite ou uma forma definida. Optimamente, pelo menos, 80% das células devem ser lisadas.
6. Perfurar um buraco no fundo do tubo usando um pino do impulso e coloque em uma coleção 15 ml tubo cônico (tampa de rosca deve ser solto).
7. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para recolher o lisado.
8. Transferir o lisado para um tubo de micro centrífuga.
9. Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C para recolher as proteínas extraídas.
10. Medir a concentração das proteínas extraídas utilizando a proteína assay kit (Tabela de Materiais) e normalizar todos os extractos de conter a mesma quantidade de proteína. Levar o volume total a 1 ml com tampão apropriado.
    Nota: Cerca de 5 mg de proteína total é obtida a partir de 50 _OD600 células.
11. Guardar a 50 ul (250 ug de proteína, se a proteína total extraído a partir do passo 5 é 2,10 mg) como extracto celular total (WCE). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x (Tabela 1) e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).

3. Purificação de HF-Smt3 Conjugados

1. Obter os grânulos Superflow Ni-NTA (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (100 ul de contas por amostra) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg) durante 1 min. Remover o sobrenadante.
2. Grânulos lavagem 5x com 1 ml de PBS (Tabela de Materiais): Inverter top-sobre-inferior até que as contas são novamente suspensas, coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
3. Suspender pérolas em 1 ml de tampão de guanidina (Tabela 1) e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Misture as contas bem invertendo top-over inferior.
   Nota: Misture bem grânulos invertendo top-over inferior.
4. Para cada amostra, adicionar 950 ul de WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 100 ul de contas de Ni-NTA Superflow.
5. Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite.
6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
7. Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Anal Western blotysis).
8. Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de guanidina durante 5-10 min sobre uma plataforma oscilante.
9. Lavar as pérolas de 5x com 1 ml de tampão de Rebentamento (Tabela 1) durante 5-10 minutos numa plataforma de agitação.
10. Grânulos Ressuspender em 90 ul de tampão de amostra Laemmli 2x.
11. Adicionar 10 ul de 1 M de imidazol.
    Nota: Imidazole ajuda para dissociar a proteína marcada com His a partir das pérolas de Ni-NTA, devido à interacção entre a competir imidazole e os grânulos.
12. Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos.
13. Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
14. Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
    Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado.

4. Immunoprecipitation de Myc-marcados kinetochore Proteínas

1. Obter anti-c-Myc de afinidade em gel de agarose umtibody (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (25 ul de resina por exemplo) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg). Remover o sobrenadante.
2. Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
3. Suspender a resina em 1 ml de tampão A e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Recolha resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
   Nota: Misture a resina bem invertendo-bottom top-over.
4. Adicionar 950 ul da WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 25 ul de resina.
5. Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante a noite.
6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
7. Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Load 10 uL de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
8. Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
9. Ressuspender a resina em 100 ul de tampão de amostra SUMEB (Tabela 1).
   Nota: tampão de amostra contém SUMEB Ureia 8 M e 1% de SDS (forte condição de desnaturação).
10. Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos.
11. Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
12. Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
    Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado.

5. Análise de mancha Ocidental

1. Coloque os extratos de proteínas em 4-12% Bis-Tris géis (Tabela de Materiais) e perfeletroforese orm a 120 V durante 90 minutos (tampão corrente: Tabela de Materiais).
2. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Tabela de Materiais) usando um aparelho de transferência a 30 V durante 90 min (tampão de transferência: Tabela de Materiais).
3. Bloquear a membrana em 5% leite / TBST 1x (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
4. Incubar membrana com anticorpo primário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma diluição de 1: 1000 (os anticorpos anti-FLAG e anti-Ub) ou 1: 5000 (anticorpo anti-Myc).
5. Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x.
6. Incubar membrana com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante 1 hora à temperatura ambiente. Usar uma diluição de 1: 5000 de anticorpos secundários.
7. Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x.
8. Incubar membrana com ECL workisolução ng (Tabela de Materiais) durante 5 min.
9. Expor a membrana sensível ao azul filme X-Ray (Tabela de Materiais) e desenvolver usando um desenvolvedor automático (Tabela de Materiais).

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Resultados

Para detectar sumoilação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10, estirpes com HF-Smt3 e proteínas cinetócoro marcada com myc (Ndc80 ou Ndc10) foram calculados (Tabela 2), como anteriormente descrito ^9,12. HF-Smt3 conjugados foram purificados por afinidade utilizando esferas de Ni-NTA. A análise de Western blot de HF purificado-Smt3 com um anticorpo anti-Flag permitiu a detecção de formas sumoylated de substratos SUMO que estavam ausentes na estirpe de controlo, sem HF-Smt3 (Fi...

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Discussão

Marcadores de epitopo HA, tais como, Myc, Bandeira, e GST são amplamente utilizados para análise bioquímica de proteínas. Construção de estirpes com IC-Smt3 e proteínas cinetócoro Myc-tag, como Ndc10 e Ndc80, facilita a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. HF-Smt3 puxar para baixo ensaio permite a detecção de proteínas cinetócoro sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). O protocolo de purificação por afinidade e análise Western blot utilizando anticorpo anti-Flag estabelec...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass beads	BioSpec Products	11079105	0.5 mm diameter
Mini beadbeater	BioSpec Products	#693	8 cell disrupter
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody	Covance	MMS-258R	Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay	Bio-Rad	500-0116
Nitrocellulose membrane	Novex	LC2001	0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Blue sensitive X-Ray film	Dbio	DBOF30003
Automatic developer	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg