JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта рукопись описывает обнаружение SUMOylation и убиквитинирование кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в многообещающий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE.

Аннотация

Посттрансляционных модификаций (PTMs), такие как фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, убиквитинирования и SUMOylation, регулируют клеточную функцию многих белков. PTMs из кинетохорных белков, которые связывают с центромерной ДНК посредником верный сегрегации хромосом для поддержания стабильности генома. Биохимические подходы, такие как масс-спектрометрии и западной блот-анализа наиболее часто используется для идентификации PTMs. Здесь способ очистки белка описано, что позволяет обнаруживать как SUMOylation и убиквитинирования из кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в Saccharomyces CEREVISIAE. Штамм, который выражает полигистидином Флаг-тегами Smt3 (ВЧ-Smt3) и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80 был построен и используется для наших исследований. Для обнаружения SUMOylation, мы разработали протокол аффинной очистки His-меткой sumoylated белки с помощью никелевых шарики и используется Вестерн-блоттинга с анти-Myc антитела для выявления sumoylated Ndc10 Aй Ndc80. Для обнаружения убиквитинирования, мы разработали протокол для иммунопреципитации Мус-меченных белков и используется Вестерн-блоттинга с анти-Ub антитела, чтобы показать, что Ndc10 и Ndc80 которые убиквитинируется. Наши результаты показывают, что эпитоп тегами интерес белок в Его-Flag помечены штамм Smt3 облегчает обнаружение нескольких PTMs. Будущие исследования должны позволить эксплуатации этой техники, чтобы определить и охарактеризовать белковые взаимодействия, которые зависят от конкретного ПТМ.

Введение

Убиквитинирование и сумоилирования позволяют сопряжение убиквитином и Малый Убиквитин-как модификатора (SUMO; Smt3 в S.cerevisiae, 1) к белку-мишени, соответственно. PTMs из кинетохорных белков влияют на их клеточном уровнях и белок-белковых взаимодействий на различных этапах клеточного цикла, чтобы обеспечить точное сегрегации хромосом. Например, сотовые уровни Cse4 / CENP-A и внешний белка кинетохор Dsn1 регулируются убиквитин-опосредованной протеолиза для обеспечения стабильности генома 2-5. Дестабилизация неправильных кинетохорных микротрубочек вложений требует B киназы Ipl1 / Aurora, который фосфорилирует Dam1 и Ndc80 комплексы, которые непосредственно взаимодействуют с микротрубочками 6-8. Несмотря на выявление более семидесяти кинетохорных белков, существует очень мало исследований, которые исследуют изменения этих белков с PTMs, например, убиквитином и сумо. Основным ограничением является способность сохранять PTMс во время очистки и нехваткой таможенных антител для обнаружения PTMs, таких как SUMOylation, фосфорилирования, метилирования, и другие. Характеристика sumoylated кинетохорных белков Ndc10, Cep3, Bir1 и Ndc80 используется пользовательский антитела 9. Кроме того, Ndc10 был вовлечен в качестве субстрата для убиквитинирования 10. Человек Hec1 (Ndc80 в S.cerevisiae,) также субстратом для убиквитинирования, регулируется APC / C-hCdh1 E3 лигазы 11. Таким образом, Ndc10 и Ndc80 являются хорошими кандидатами для оптимизации протокола для выявления как SUMOylation и убиквитинирование в S. Cerevisiae.

Для облегчения идентификации SUMOylation, мы построили штаммов, которые выражают HF-Smt3 и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80. Использование эпитопные метки (HF: His6-Flag) сводит к минимуму фон из-за перекрестной реактивности, что часто наблюдается в поликлональной сывороткой, выработанном против белок-кандидат. Мы разработали протокол к близостиочистить ВЧ-Smt3 конъюгатов, а затем использовали коммерческий анти-Flag и анти-Myc антитела для обнаружения присутствия sumolyated Ndc10 и Ndc80 в очищенный препарат Smt3. Для убиквитинирования, мы разработали модифицированный протокол иммунопреципитации, который сохраняет убиквитинирование из Мус-меченых белков кинетохорных и осуществляется вестерн-блот анализ с коммерческой анти-Ub антитела для выявления убиквитинирование Ndc10 и Ndc80.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Рост клеток дрожжей

  1. Посев клеток дрожжей в 30 мл YPD (таблица 1) в небольшую колбу. Выдержите на 30 ° С в течение ночи при встряхивании.
  2. Развести клетки к оптической плотности 0,2 при 600 нм (OD 600 = 0,2) в 50 мл YPD и инкубируют при 30 ° C при встряхивании.
  3. Выращивают культуру до оптической плотности 1,0 при 600 нм (OD 600 = 1,0).
  4. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 2000 мкг и отбросить супернатант.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 40 мл стерильной воды и центрифуги в течение 5 мин при 2000 мкг мыть клетки. Жидкость над осадком сливают и хранят осадок клеток при -20 ° С.

2. Добыча белков

  1. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл охлажденного льдом буфера гуанидина (таблица 1) для выпадающего анализе с использованием Ni-NTA Superflow шарики или буфер А (таблица 1) для иммунопреципитации. Держите труб на льду во все времена.
  2. Трансфер до 2 мл винтовой крышкой трубки.
  3. Добавить такой же объем стеклянных шариков (Таблица материалов).
  4. Бисера-бить клеток в мини борта колотушки (табл материалов) в течение 2 мин при комнатной температуре, затем поместить на льду в течение 2-3 мин. Повторите это три раза.
  5. Вихревой на высокой скорости при 4 ° С в течение 30-60 мин. Проверка клетки от визуализации под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки лизируют.
    Примечание: лизированных клеток будет выглядеть как темные призраки и отсутствие границу или определенную форму. Оптимально, по меньшей мере 80% клеток должны быть лизированы.
  6. Прокол отверстие в нижней части трубы с помощью канцелярской кнопки и место в коллекции 15 мл коническую трубку (винтовая крышка должна быть свободной).
  7. Центрифуга при 1000 х г в течение 1 мин, чтобы собрать лизата.
  8. Передача лизата в микро трубки центрифуги.
  9. Центрифуга при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для сбора извлеченные белки.
  10. Измерить концентрацию извлеченных белков с использованием белка ASSAу комплект (Таблица материалов) и нормализуют все экстракты содержат одинаковое количество белка. Довести общий объем до 1 мл соответствующего буфера.
    Примечание: Около 5 мг общего белка получают из 50 OD 600 клеток.
  11. Сохранить 50 мкл (250 мкг белка, если общий белок экстрагируют из шаг 2.10 составляет 5 мг) в виде экстракта цельных клеток (WCE). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца (Таблица 1) и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).

3. Очистка ВЧ-Smt3 конъюгатов

  1. Получите Superflow бусы Ni-NTA (табл материалов), необходимых для экспериментов (100 мкл из бисера на пробу) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 мкг в) в течение 1 мин. Удалить супернатант.
  2. Бисер Вымойте 5x 1 мл PBS (табл материалов): Обратить топ-over-Нижняя, пока шарики не ресуспендировали, собирать шарики от низкой скорости центрифугирования и удаления супернатанта.
  3. Приостановка бусины в 1 мл буфера гуанидина (Таблица 1) и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Соберите бусы низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант. Смешайте бисер также путем обращения топ-над нижней.
    Примечание: Смешайте бисер также путем обращения топ-над дном.
  4. Для каждого образца, добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 100 мкл Ni-NTA Superflow бисера.
  5. Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение по меньшей мере 4 ч или в течение ночи.
  6. Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
  7. Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (раздел 5: Вестерн-блот анальныйлиз).
  8. Бусины Промывают один раз 1 мл буфера гуанидина в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
  9. Бусины Wash 5x 1 мл буфера нарушение (таблица 1) в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
  10. Ресуспендируют бусины в 90 мкл 2x буфера Лэммли образца.
  11. Добавьте 10 мкл 1 М имидазола.
    Примечание: Имидазол помогает отделить Его-меченый белок из бисера Ni-NTA-за конкурирующего взаимодействия между имидазола и бисером.
  12. Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
  13. Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
  14. Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
    Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.

4. Иммунопреципитация Мус-меченых белков кинетохор

  1. Получить анти-с-Myc агарозном геле сродства апtibody (табл материалов), необходимых для экспериментов (25 мкл смолы на образце) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 XG). Удалить супернатант.
  2. Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
  3. Приостановка смолы в 1 мл буфера А и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Сбор смолы с низкой скоростью центрифугирования и удаления супернатанта.
    Примечание: Смешайте смолу и обращением топ-над-дно.
  4. Добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 25 мкл смолы.
  5. Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение ночи.
  6. Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
  7. Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Вотобъявления по 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
  8. Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
  9. Ресуспендируют смолы в 100 мкл образца буфера SUMEB (Таблица 1).
    Примечание: образец SUMEB буфер содержит 8 M мочевину и 1% SDS (сильное условие денатурации).
  10. Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
  11. Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
  12. Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
    Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.

5. Вестерн-блот анализ

  1. Загрузите белковых экстрактов на 4-12% Бис-Трис гели (табл материалов) и перфорацияORM электрофорез при 120 V в течение 90 мин (Запуск буфер: Таблица материалов).
  2. Передача белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (табл материалов) с использованием аппарата переноса при 30 В в течение 90 мин (буфер передачи: Таблица материалов).
  3. Блок мембраны в 5% молоке / TBST 1x (Table1) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Инкубируйте мембрану с первичными антителами (таблица материалов) в 5% молоке / TBST 1x в течение ночи при 4 ° C. Для первичных антител, использовать разведение 1: 1000 (анти-Flag и анти-UB антитела) или 1: 5000 (анти-Мус антител).
  5. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
  6. Инкубируйте мембраны с вторичным антителом (таблица материалов) в 5% молока / 1x TBST в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте в разведении 1: 5000 вторичных антител.
  7. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
  8. Выдержите мембраны с ECL WorkiРаствор нг (табл материалов) в течение 5 мин.
  9. Expose мембрану к синему чувствительной рентгеновской пленки (табл материалов) и развивать с помощью автоматического разработчика (табл материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для обнаружения SUMOylation из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10, штаммы с ВЧ-Smt3 и Мус-меченых белков кинетохорных (Ndc80 или Ndc10) были построены (таблица 2), как описано ранее 9,12. ВЧ-Smt3 конъюгаты очищали с использованием аффинной бусы Ni-NTA. Вестерн-блот-анализ очищенного HF-Smt3 с анти-Flag антите...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эпитоп теги, такие как HA, Мус, флаг, и GST широко используются для биохимического анализа белков. Строительство штаммов с HF-Smt3 и Мус-меченных кинетохорных белков, таких как Ndc10 и Ndc80, облегчает обнаружение PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. ВЧ-Smt3 снести анализа позволяет выявлять sumoylate...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass beadsBioSpec Products110791050.5 mm diameter
Mini beadbeaterBioSpec Products#6938 cell disrupter
Ni-NTA superflowQiagen30430100 ml
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP82151 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbitSigma-AldrichA74701 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouseSigma-AldrichF1804Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-789Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10CovanceMMS-150PPrimary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibodyCovanceMMS-258RPrimary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole AbGE Healthcare Life SciencesNA934VSecondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole AbGE Healthcare Life SciencesNA931VSecondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assayBio-Rad500-0116
Nitrocellulose membraneNovexLC20010.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsNovexNP0321BOX1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running BufferNovexNP000220x
NuPAGE Transfer BufferNovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
Blue sensitive X-Ray filmDbioDBOF30003
Automatic developerKodakM35AX-OMAT
NocodazoleSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck ChemicalsS261925 mg

Ссылки

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216(2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158(2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

99Saccharomyces CerevisiaeNdc10Ndc80SUMOylation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены