Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Résumé

Ce manuscrit décrit la détection de la sumoylation de protéines et ubiquitination kinétochoriens, Ndc10 Ndc80 et, dans le bourgeonnement levure Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

Les modifications post-traductionnelles (PTM), tels que la phosphorylation, la méthylation, l'acétylation, l'ubiquitination, et sumoylation, régulent la fonction cellulaire de nombreuses protéines. PTM de protéines kinétochoriens qui associent avec l'ADN centromérique médiation ségrégation des chromosomes fidèle à maintenir la stabilité du génome. Approches biochimiques telles que la spectrométrie de masse et analyse western blot sont les plus couramment utilisés pour l'identification des PTM. Ici, un procédé de purification des protéines est décrite qui permet la détection à la fois de la sumoylation et ubiquitination des protéines kinétochoriens, Ndc10 et Ndc80, dans Saccharomyces cerevisiae. Une souche qui exprime polyhistidine-marquage Flag Smt3 (HF-Smt3) et marqué par myc Ndc10 ou Ndc80 a été construit et utilisé pour nos études. Pour la détection de la sumoylation, nous avons conçu un protocole pour purifier par affinité les protéines His-étiqueté sumoylated à l'aide de billes de nickel et utilisé une analyse western blot avec un anticorps anti-Myc pour détecter une sumoylated Ndc10e Ndc80. Pour la détection de l'ubiquitination, nous avons élaboré un protocole pour l'immunoprécipitation des protéines Myc-marqués et utilisé l'analyse de western blot avec l'anticorps anti-Ub pour montrer que Ndc10 et Ndc80 sont ubiquitinées. Nos résultats montrent que l'épitope protéine marquée de l'intérêt pour l'His-Drapeau étiqueté souche Smt3 facilite la détection de plusieurs PTM. Les études futures devraient permettre une exploitation de cette technique pour identifier et caractériser les interactions entre protéines qui sont tributaires d'un PTM spécifique.

Introduction

L'ubiquitination et sumoylation permettent la conjugaison de l'ubiquitine et le modificateur de petite ubiquitine (SUMO; Smt3 dans S. cerevisiae ¹⁾ à une protéine cible, respectivement. PTM de protéines kinétochoriens affectent leurs niveaux cellulaires et des interactions protéine-protéine au cours des différentes phases du cycle cellulaire afin d'assurer la ségrégation des chromosomes fidèle. Par exemple, les niveaux cellulaires de CSE4 / CENP-A et la protéine de kinetochore extérieure DSN1 sont réglementés par protéolyse ubiquitine pour assurer la stabilité du génome ^2-5. La déstabilisation de équipements kinétochoriens-microtubules incorrectes nécessite la kinase B IPL1 / Aurora, qui phosphoryle et complexes Dam1 Ndc80 qui interagissent directement avec les microtubules ^8.6. Malgré l'identification de plus de soixante-dix protéines kinétochoriens, il ya très peu d'études qui examinent les modifications de ces protéines avec PTM, par exemple, l'ubiquitine et SUMO. Une limitation importante est la capacité à préserver la PTMs pendant la purification et la rareté des anticorps sur mesure pour la détection de la sumoylation PTM tels que, la phosphorylation, la méthylation, et d'autres. Caractérisation des protéines kinétochoriens sumoylated Ndc10, CEP3, BIR1 et Ndc80 utilisé un anticorps personnalisé ^9. En outre, Ndc10 a été impliquée en tant que substrat pour l'ubiquitination ^10. HEC1 humain (Ndc80 chez S. cerevisiae) est également substrat pour ubiquitination, réglementé par APC / C-hCdh1 ligase E3 ^11. Par conséquent, Ndc10 et Ndc80 sont de bons candidats pour l'optimisation du protocole de détecter à la fois la sumoylation et ubiquitination en S. cerevisiae.

Pour faciliter l'identification de la sumoylation, nous avons construit des souches qui expriment HF-Smt3 et Myc-tagged Ndc10 ou Ndc80. L'utilisation de marqueurs d'epitope (HF: His6-Flag) minimise le bruit de fond dû à la réactivité croisée qui est fréquemment observé dans le sérum polyclonal dirigé contre une protéine candidate. Nous avons élaboré un protocole d'affinitépurifier les conjugués HF-SMT3 commercial et ensuite utilisé des anticorps anti-Myc et anti-Flag pour détecter la présence de sumolyated Ndc10 et Ndc80 dans la préparation purifiée Smt3. Pour ubiquitination, nous avons conçu un protocole d'immunoprécipitation modifiée qui conserve ubiquitination des protéines kinétochoriens marqué par myc et effectué une analyse western blot avec un anticorps commercial anti-Ub pour détecter ubiquitination de Ndc10 et Ndc80.

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Protocole

1. Croissance de cellules de levure

1. Ensemencer les cellules de levure dans 30 ml de YPD (tableau 1) dans un petit flacon. Incuber à 30 ° C pendant la nuit avec agitation.
2. Diluer les cellules à une densité optique de 0,2 à 600 nm (DO ₆₀₀ = 0,2) dans 50 ml de YPD et incuber à 30 ° C avec agitation par secousses.
3. Cultiver la culture jusqu'à une densité optique de 1,0 à 600 nm (DO ₆₀₀ = 1,0).
4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 2000 xg et jeter le surnageant.
5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 40 ml d'eau stérile et centrifuger pendant 5 min à 2000 x g pour laver les cellules. Jeter le surnageant et stocker le culot cellulaire à -20 ° C.

2. Extraction des protéines

1. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de tampon guanidine glacée (tableau 1) pour le dosage d'excursion basse à l'aide de Ni-NTA Superflow ou des billes de tampon A (tableau 1) pour immunoprécipitation. Garder les tubes sur la glace en tout temps.
2. Transfert à 2 ml tube de bouchon à vis.
3. Ajouter le même volume de billes de verre (Table des Matières).
4. Bead-a battu les cellules dans un mini cordon batteur (Table des Matières) pendant 2 min à température ambiante, puis le placer sur la glace pendant 2-3 min. Répétez cette opération trois fois.
5. Vortex à haute vitesse à 4 ° C pendant 30-60 min. Vérifier les cellules par visualisation au microscope à faire en sorte que les cellules sont lysées.
   Remarque: Les cellules lysées apparaîtront fantômes sombres et manquent une frontière ou une forme définie. De façon optimale au moins 80% des cellules doivent être lysées.
6. Percer un trou dans le fond du tube à l'aide d'une tige de poussée et le lieu dans une collection de 15 ml tube conique (bouchon à vis doit être lâche).
7. Centrifuger à 1000 g pendant 1 min à recueillir le lysat.
8. Transférer le lysat dans un tube de centrifugeuse micro.
9. Centrifuger à 15 000 g pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer les protéines extraites.
10. Mesurer la concentration des protéines extraites à l'aide de la protéine assakit y (Table des matières) et de normaliser tous les extraits à contiennent la même quantité de protéines. Porter le volume total à 1 ml avec un tampon approprié.
    Note: Dans la région de 5 mg de protéine totale est obtenue à partir de 50 OD ₆₀₀ cellules.
11. Enregistrer 50 ul (250 pg de protéine si la protéine totale extraite de l'étape 5 est 2,10 mg) sous forme d'extrait de cellules entières (WCE). Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x (tableau 1) et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Charge 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).

3. Purification de HF SMT3 conjugués

1. Obtenir des billes de Ni-NTA Superflow (Table des Matières) nécessaires pour les expériences (100 ul de billes par exemple) par centrifugation à basse vitesse (800-1,500 xg) pendant 1 min. Retirer le surnageant.
2. Laver les perles 5x avec 1 ml de PBS (Table des Matières): Inverser haut-sur-bas jusqu'à ce que les billes sont remises en suspension, de recueillir les perles par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
3. Suspension de billes dans 1 ml de tampon guanidine (tableau 1) et les aliquoter dans le nombre de tubes qui correspondent à des échantillons à traiter. Recueillir des perles par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. Mélanger les perles bien en inversant haut sur le bas.
   Remarque: Mélanger perles bien en inversant bottom top-over.
4. Pour chaque échantillon, ajouter 950 ul de la WCE restant (de l'étape 2.11: Extraction de protéines) à 100 ul de billes de Ni-NTA Superflow de.
5. Incuber sur une plate-forme à bascule à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou toute la nuit.
6. Centrifugeuse à 800-1,500 g pendant 1 min à 4 ° C.
7. Économisez 50 pi comme surnageant (SUP). Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Charge 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: anal Western blotana-).
8. Laver les perles une fois avec 1 ml de tampon de guanidine pour 5-10 minutes sur une plate-forme à bascule.
9. Laver les perles 5x avec 1 ml de tampon de rupture (tableau 1) pendant 5-10 minutes sur une plate-forme à bascule.
10. perles de remettre en suspension dans 90 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x.
11. Ajouter 10 pl de 1 M d'imidazole.
    Note: Imidazole aide à dissocier la protéine marquée par His des Ni-NTA beads due à l'interaction entre concurrence imidazole et les perles.
12. Incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 3-5 min.
13. Vortex, puis centrifuger à 13 000 g pendant 30 sec. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
14. Charge 10-20 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).
    Remarque: ul 10-20 correspond à 0,5-1,0 mg de l'entrée, si 5 mg de WCE est utilisé.

4. Immunoprécipitation des protéines kinétochoriens marqué par myc

1. Obtenez-c-Myc lutte contre affinité gel d'agarose untibody (Table des Matières) nécessaire pour les expériences (25 ul par échantillon de résine) par centrifugation à basse vitesse (800-1,500 xg). Retirer le surnageant.
2. Laver 5x de résine avec 1 ml de tampon A: Inverser haut-over-bas jusqu'à ce que la résine est remis en suspension, recueillent résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
3. Suspension de résine dans 1 ml de tampon A et les aliquoter dans le nombre de tubes qui correspondent à des échantillons à traiter. Recueillir résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
   Remarque: Mélanger la résine et en inversant haut-over-bas.
4. Ajouter 950 ul de la WCE restant (de l'étape 2.11: Extraction de protéines) à 25 ul de résine.
5. Incuber sur un agitateur oscillant à 4 ° C pendant une nuit.
6. Centrifugeuse à 800-1,500 g pendant 1 min à 4 ° C.
7. Économisez 50 pi comme surnageant (SUP). Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Loannonce 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).
8. Laver 5x de résine avec 1 ml de tampon A: Inverser haut-over-bas jusqu'à ce que la résine est remis en suspension, recueillent résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
9. Remettre en suspension la résine dans 100 ul de tampon d'échantillon de SUMEB (tableau 1).
   Remarque: un tampon d'échantillon de SUMEB contient 8 M d'urée et 1% de SDS (état dénaturant fort).
10. Incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 3-5 min.
11. Vortex, puis centrifuger à 13 000 g pendant 30 sec. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
12. Charge 10-20 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).
    Remarque: ul 10-20 correspond à 0,5-1,0 mg de l'entrée, si 5 mg de WCE est utilisé.

5. Analyse Western Blot

1. Charger les extraits de protéines de 4-12% de gels Bis-Tris (Table des Matières) et perfélectrophorèse ORM à 120 V pendant 90 min (tampon de marche: Table des matières).
2. Transfert de protéines à partir de gel sur une membrane de nitrocellulose (Table des Matières) en utilisant un appareil de transfert à 30 V pendant 90 minutes (tampon de transfert: Table des Matières).
3. Bloquer la membrane dans 5% de lait / 1x TBST (tableau 1) pendant 1 heure à température ambiante.
4. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire (Table des Matières) dans 5% de lait / 1x TBST nuit à 4 ° C. Pour les anticorps primaires, en utilisant une dilution de 1: 1000 (anticorps anti-Flag et anti-Ub) ou 1: 5 000 (anticorps anti-Myc).
5. Laver 3x de la membrane pendant 10 min chacun avec 1x TBST.
6. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire (Table des Matières) dans 5% de lait / 1x TBST pendant 1 heure à température ambiante. Utiliser une dilution 1: 5000 d'anticorps secondaire.
7. Laver 3x de la membrane pendant 10 min chacun avec 1x TBST.
8. Incuber membrane avec ECL workisolution ng (Table des Matières) pendant 5 min.
9. Exposer la membrane sensible au bleu le film X-Ray (Table des matières) et de développer l'aide d'un développeur automatique (Table des matières).

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Résultats

Pour détecter sumoylation de protéines kinétochoriens Ndc80 et Ndc10, les souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc (Ndc80 ou Ndc10) ont été construits (tableau 2), comme décrit précédemment ^9,12. Conjugués HF-SMT3 ont été purifiés par affinité en utilisant des billes de Ni-NTA. Analyse par Western blot purifié HF-Smt3 avec un anticorps anti-Flag a permis la détection de formes sumoylated de substrats SUMO qui étaient absentes dans la souche de contrô...

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Discussion

marqueurs d'épitopes tels que HA, Myc, Drapeau, et la TPS sont largement utilisés pour l'analyse biochimique des protéines. Construction de souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc, comme Ndc10 et Ndc80, facilite la détection des PTM tels que la sumoylation et ubiquitination. HF-Smt3 déroulant test permet la détection de protéines kinétochoriens sumoylated, Ndc10 et Ndc80 (Figure 1). Le protocole de purification par affinité et analyse western blot en utilisant...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass beads	BioSpec Products	11079105	0.5 mm diameter
Mini beadbeater	BioSpec Products	#693	8 cell disrupter
Ni-NTA superflow	Qiagen	30430	100 ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8215	1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	A7470	1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14)	Santa Cruz Biotechnology	sc-789	Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10	Covance	MMS-150P	Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody	Covance	MMS-258R	Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA934V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab	GE Healthcare Life Sciences	NA931V	Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay	Bio-Rad	500-0116
Nitrocellulose membrane	Novex	LC2001	0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Novex	NP0321BOX	1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Novex	NP0002	20x
NuPAGE Transfer Buffer	Novex	NP0006-1	20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34078
10x PBS pH7.4	GIBCO	70011-044
Blue sensitive X-Ray film	Dbio	DBOF30003
Automatic developer	Kodak	M35AX-OMAT
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404	50 mg
MG-132	Selleck Chemicals	S2619	25 mg