Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

Resumen

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Resumen

Las células cancerosas responden a matriz de rigidez mecánica de una manera compleja usando un sistema coordinado, jerárquica mecano-químico compuesto de receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares ^{1, 2.} Mecanosensibilidad de las diferentes células cancerosas in vitro son investigado principalmente con las líneas celulares inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias. Por lo tanto, se sabe poco acerca de la mecanosensibilidad de células de cáncer de colon humanas primarias in vitro. Aquí, un protocolo optimizado se desarrolla que describe el aislamiento de las células del colon humanos primarios a partir de muestras de tejidos humanos quirúrgicos sanos y cancerosos. Las células del colon aislados son entonces cultivadas con éxito en sustratos funcionalizados por una matriz extracelular blando (2 kPa rigidez) y rígido (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida y poliestireno rígido (~ 3,6 GPa rigidez) (fibronectinaen este caso). Microperlas fluorescentes están incrustados en geles suaves cerca de la superficie de cultivo de células, y el ensayo de tracción se lleva a cabo para evaluar las tensiones contráctiles celulares utilizando software de acceso libre y gratuito. Además, la microscopía de inmunofluorescencia en diferentes sustratos de rigidez proporciona información útil sobre la morfología celular primaria, la organización del citoesqueleto y vinculina que contiene adhesiones focales como una función de la rigidez del sustrato.

Introducción

En los últimos años se ha convertido en cada vez más evidente que mecánica micro-entorno, además de los factores bio-químicas, juega un papel importante en la regulación de las funciones celulares. Las células pueden detectar y responder a la rigidez sustrato sobre el que se adhieren a (como en la cultura 2D) o rodeados por (como en cultivo 3D) ^3-7. Al hacerlo, las células pueden modular su diferenciación ^{3, 4} morfología, migración / motilidad ^5, las propiedades biofísicas ^{6, 7} crecimiento, y otros procesos.

Las células cancerosas también responden a la rigidez de la matriz 2D y 3D utilizando una coordinada, combinación jerárquica mecano-químico de los receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares ^{1, 2.} Por ejemplo, las células epiteliales mamarias (MECs) formar parénquima normal acinar cuando se cultiva en sustratos 150 Pa que es similar a la rigidezde tejido mamario sano. Curiosamente, exhiben las características de un tumor en desarrollo, tanto estructurales como la transcripción, cuando se cultivan en sustratos rígidos (> 5000 Pa) que imitan la rigidez de un estroma tumoral ^8. Además, otro experimento muestra que la tumorigénesis de mama se acompaña de reticulación de colágeno y ECM de refuerzo ^9. Experimentos recientes muestran que (HCT-8) células de carcinoma de colon humano muestran metástasis como fenotipo (MLP) cuando se cultivan en sustratos 2D tienen rigidez fisiológicamente relevante (20-47 kPa), pero no en muy rígido (3.6 GPa) sustratos ^{10- 12} .Estos células primero forman grupos de células tumorales y luego se disocian el uno del otro, a partir de la periferia. Como este epitelial a redondeadas morfológica (E a ​​R transición) se produce el cambio, proliferan, reducir célula-célula y célula-ECM adherencia, y convertirse migratoria. HCT-8 células cultivadas sobre sustratos de poliestireno muy duras, que no presentan estosrasgos malignos. Así, se ha planteado la hipótesis de que HCT-8 células se vuelven metastásico debido a su exposición a las micro-entorno adecuado. Vale la pena señalar que estos experimentos se llevan a cabo con las líneas celulares de cáncer inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias.

Un estudio reciente propone que la tensión de tracción celular aumentada se puede utilizar como un potencial biofísico firma para las células metastásicas ¹³ .El estudio implica la medición de la fuerza de tracción para diferentes líneas celulares de cáncer humano en geles de poliacrilamida. Se encuentra que las células cancerosas metastásicas pueden ejercer significativamente mayor esfuerzo de tracción en comparación con las células no metastásicas en todos los casos ^13. Sin embargo, estos resultados contradicen directamente los resultados publicados anteriormente en murino líneas celulares derivadas de cáncer de mama ^14. Además, un estudio reciente pone de manifiesto diferencias notables entre las células humanas inmortalizadas y primaria en su pro remodelación del citoesqueletoperfiles de proteína y la supervivencia celular expresión de la proteína ^15. Por lo tanto, es importante volver a visitar muchos de los ensayos biofísicos incluyendo tracción para las células cancerosas humanas primarias. Esto se abordará la cuestión de si las células primarias recapitulan inmortalizada líneas celulares de cáncer tendencia tracción.

El protocolo descrito aquí está optimizado para el aislamiento de células primarias humanas de colon (tanto sanas y cancerosas), y para el cultivo de ellos en sustratos blandos (hidrogeles de poliacrilamida), así como en placas de Petri. El protocolo se basa en la digestión y la consiguiente disociación enzimática de muestra de tejido quirúrgico en suspensión de células individuales ^16. Para nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de cultivo aislado tumor de colon primario y las células normales directamente sobre sustratos de hidrogel blandas con microperlas fluorescentes embebidos para citometría de tracción. Sustratos gel transparente también permiten inmunotinción. Este ensayo reveló diferencias en la organización F-actina yadherencias focales en las células del colon humanas primarias como cambios de rigidez del sustrato. Esta plataforma de cultivo celular se abre la posibilidad de explorar diversas propiedades biofísicas de células humanas primarias tales como rigidez celular y la tracción como parámetros para pronósticos de cáncer.

Protocolo

El protocolo se describe a continuación sigue las directrices de UIUC comité de ética de la investigación humana.

1. Recogida y digestión de Tejidos quirúrgico Muestra

1. Recoger la muestra de tejido del tumor después de la resección de colon derecho (Figura 1A y 1B). Recoger el tejido de un sitio sano adyacente también.
2. Transferir el tejido inmediatamente a un vial de 15 ml que contiene 12 ml de solución de HBSS. Conservar el vial en el hielo dentro de una caja de la espuma aislante.
3. Transporte el tejido que contiene vial a una campana de cultivo de tejidos para su posterior procesamiento en 45 min. Conservar el vial en un bloque de hielo en el interior de la campana.
4. Vierta el tejido suministrado en una placa de 6 pocillos que contiene 6-7 ml de solución de HBSS usando una pipeta.
   Nota: La cantidad de tejido por pozo no es crítica en esta etapa de aclarado.
5. Mantenga la placa de 6 pocillos en un bloque de hielo. Enjuague el tejido en solución HBSS dos veces.
6. Cortar el tejido limpiamente en secciones separadas con LIC estérilessor. Tejido Pique en secciones más pequeñas no mayor de 1-2 mm ³ en tamaño, con una hoja de bisturí estéril.
7. Pesar un vial tripsina 0,1% marcada (que contiene 1 ml de 0,1% de solución de tripsina) antes de transferir el tejido. Transferencia de ~ 20 mg de tejido en cada uno de los viales de 0,1% de tripsina con una pipeta.
8. Trate de minimizar la transferencia de HBSS en el vial tripsina para evitar una mayor dilución de tripsina.
9. Pesar los viales de tripsina después de la transferencia de tejidos; documentar la diferencia como la masa de tejido.
10. Verter ~ 20 mg de tejido y 1 ml de tripsina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
11. Ponga la placa de 24 pocillos en un agitador en la nevera a 4 ° C durante 16-20 horas. Durante este período de espera o en un momento anterior, preparar sustratos de gel de poliacrilamida y funcionalizar con proteínas ECM como se describe en la sección 3.

2. La disociación enzimática de la muestra de tejido en suspensión individual de células y el cultivo de células aisladas en el ECM funcionalizado elástico Substrates y platos de poliestireno rígido

1. Después de 16-20 horas de incubación en tripsina bien a 4 ° C en un agitador, transferir tejido de 4 ° C tripsina a 4 ° C vial medio de crecimiento completo (que contiene 2-3 ml de medio de crecimiento completo) usando una pipeta. Asegúrese de transferencia mínima de tripsina en medio de crecimiento.
   Nota: formulación completa medios de crecimiento es como sigue: RPMI 1640 medio base suplementado con suero de caballo a una concentración final de 10% y penicilina-estreptomicina al 1% de la solución total.
2. Coloque el tejido que contiene vial medios de comunicación en un baño de agua caliente a 37 ° C durante 12-15 min.
3. Transferir el tejido a un vial de 15 ml que contiene la solución HBSS usando una pipeta, agite suavemente.
4. Repita 2.3.
5. Retire el tejido de la solución HBSS y traslado al 0,1% solución de colagenasa (en HBSS) vial que contiene 1 ml de solución. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C y 5% CO ₂ ambiente en una incubadora de cultivo celular humidificado. Durante el período de espera, growt calienteh medios de comunicación en un vial de 15 ml a 37 ° C en baño de agua.
6. Saque todos los fragmentos de tejido en minimización pipeta colagenasa arrastre. Expulsar sólo los fragmentos de tejido en viales de medios de cultivo pre-calentado.
7. Colocar un filtro bien inserto de 40 micras en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Humedecer el filtro con 1 ml de medio de cultivo celular.
8. Se tritura el tejido en los medios de comunicación con una pipeta de vidrio de 10 ml varias veces hasta que el tejido está completamente disociado.
9. Mantener la punta de pipeta lo más cerca posible a la base del vial.
10. Depositar la solución sobre el filtro para eliminar los residuos y las partes no disociadas.
11. Centrifugar la suspensión celular se filtró en los medios de comunicación a 150 xg durante 5 min a TA.
12. Eliminar el sobrenadante y resuspender después sedimento celular con 2 ml de medio de cultivo fresco.
13. Contar las células utilizando un hemocitómetro (si es necesario). Aislado Seed células primarias en matriz extracelular (ECM) geles funcionalizados y platos de poliestireno en concentración deseada.

3. Preparación y funcionalización de diferentes Rigidez poliacrilamida (PA) Geles y poliestireno Sustratos

Nota: Para la demostración visual de la Sección 3, los espectadores / lectores son referidos a un reciente Diario de experimentos visualizados (Jove) del artículo ^17.

1. La adopción de los protocolos publicados ^{18, 19,} 12 mm activan ² cubierta de cristal se desliza químicamente para asegurar la unión del hidrogel covalente.
   1. En primer lugar, la cubierta de cristal regalo desliza con 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) durante 7 minutos a temperatura ambiente.
   2. Retire el ATS completamente con enjuague de agua DI y tratar cubierta se desliza con 0,5% glutaraldehído (diluido en PBS a partir de solución de glutaraldehído social 70%) solución durante 30 minutos.
2. Obtener 2 soluciones de gel kPa mediante la mezcla de 5% w solución de acrilamida v / y 0,05% -methylenebisacrylamide solución de (bis) N 'en solución salina tamponada con HEPES 10 mM ²⁰ N,. Utilice 8% w / v de acrilamida y 0,13% N, -methylenebisacrylamide solución (bis) N '10 en solución salina tamponada con HEPES mM de gel de 10 kPa ^20.
   1. En ambos casos, usar 1: 200 persulfato de amonio (10% w / v) y 1: 2.000 N, N, N ', N' -tetrametiletilendiamina (TEMED) como iniciador y catalizador para el proceso de polimerización, respectivamente.
   2. Además, añadir 100 l perlas fluorescentes a 2 solución de gel kPa como marcadores fiduciarios ^{21, 22.}
3. Depositar una gota de 20 l de pre-polímero de solución de gel de PA en el 12 ^mm2 activado hoja de la cubierta de cristal. Coloque otra 12 mm ² regulares hoja de la cubierta de cristal en la caída. Asegúrese de que la caída de los diferenciales entre los cubreobjetos por capilaridad. Invierta el sándwich para 2 geles kPa para asegurar que la mayoría de las perlas vienen cerca de la superficie de cultivo de células.
4. Curar el gel de PA durante 45 min a RT.
5. Despegar la hoja de la cubierta superior utilizando una sola máquina de afeitar borde.
   Nota: Durante el pelado, desprendimiento procede de uno de los bordesdel sándwich. El gel permanece adherida a la lámina de vidrio activado.
6. Almacene los geles en solución de PBS antes de su uso.
7. Funcionalizar geles y cristal con las moléculas de ECM, la fibronectina humana PA a una concentración de 50 g / ml métodos siguientes publicados ^23.
   1. En pocas palabras, incubar sustratos con 2 ml puro hidrato de hidrazina O / N.
   2. Retire hidrato de hidrazina y enjuague los sustratos a fondo con agua DI.
   3. Lavar los sustratos con ácido acético al 5% durante 30 min.
   4. Retire ácido acético y enjuague los sustratos a fondo con agua DI.
   5. Mantenga los sustratos sumergidos en agua DI durante 30 min.
   6. Incubar los sustratos con fibronectina oxidado durante 35 min a una concentración de 50 mg / ml.
   7. Enjuague los sustratos con PBS en agitador a bajas rpm durante 10 min.
   8. Incubar todos los sustratos a 37 ° C en 2-3 ml de medio de cultivo durante 30 minutos antes de la galjanoplastia de las células.
      Nota: las células de la placa en un poblar escasamented forma (1.000-3.000 células / cm ^2). Cada hoja de vidrio gel cubierta necesita ser contenido en un 35 mm placa de Petri. Permitir que las células se adhieran completamente antes de cualquier microscopía (al menos O / N).

4. Tracción microscopía de fuerza y ​​de inmunofluorescencia microscopía ensayos

1. Ensayo de Tracción Microscopía de Fuerza
   1. Cálido tripsina-EDTA / solución de 0.25% 10% SDS a 37 ° C en un baño de agua durante 10 minutos antes de comenzar los experimentos de tracción.
   2. Retire un gel de la incubadora de cultivo celular a la vez y colocar en la platina del microscopio fluorescente invertido (magnificación 32X).
   3. Encuentra una sola célula en el campo de visión. Retire la tapa del plato de Petri.
   4. Tome una imagen de contraste de fase de la célula (por ejemplo, la Figura 3).
   5. Cambie el modo de imágenes de fluorescencia y seleccione el filtro apropiado. No mueva la platina del microscopio o de la muestra durante este tiempo.
   6. Tome una imagen del displac perlas fluorescentescado por la tracción celular (Figura 4C).
   7. Añadir 1 ml de tripsina / solución de SDS al plato de Petri para separar la célula de gel. No mueva la platina del microscopio o de la muestra durante este tiempo. Además, tomar una imagen de control de la célula para asegurar la eliminación completa de gel.
   8. Tome una imagen de referencia (fuerza null) de las perlas después se retira de la célula.
   9. Repita los pasos 4.1.2-4.1.8 para el resto de geles.
   10. Hacer una pila de imágenes usando ImageJ de las dos imágenes obtenidas en el paso 4.1.6 y 4.1.8 para cada caso. Para generar la pila de imagen, utilice siguiente secuencia de comandos en ImageJ después de abrir las imágenes: Imagen → Pilas → Imágenes para apilar.
   11. Para obtener el campo de desplazamiento y tracción, usar plugins ImageJ siguientes métodos publicados ^{21, 22} Obtener los códigos y tutoriales detallados para estos plugins utilizando el siguiente enlace:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
       1. Alinear las imágenes de la pila utilizando el plugin 'Matching plantilla'. Uso siguiente secuencia de comandos en ImageJ después de abrir la pila imagen generada en el paso 4.1.10: Plugins → Matching Plantilla → Alinear Rebanadas de Pila → Aceptar. Guarde la pila de imágenes en consecuencia. Use esta nueva pila de imágenes en los siguientes pasos.
       2. Obtenga el campo de desplazamiento mediante el PIV (partícula imagen velocimetría) plugin (Figura 4D). Uso siguiente secuencia de comandos después de abrir la pila imagen guardada en el paso 4.1.11.1: Plugins → → PIV iterativo PIV (Básico) → Aceptar → Aceptar este PIV y la salida → Ok. Guarde la salida de PIV en el mismo directorio que en la pila imagen original. Use esto como entrada en el siguiente paso.
       3. Por último, el uso de FTTC (transformada de Fourier de tracción citometría) plugin para obtener el mapa de tracción (Figura 4E). Uso siguiente secuencia de comandos: Plugins → → FTTC Inspropiedades de los materiales ert, es decir, el módulo de Young y la relación entre PA gel → Aceptar → de Poisson Seleccione el archivo de salida PIV guardado en el paso 4.1.11.2 → Aceptar. Guardar FTTC resulta en el mismo directorio que en la pila de imagen y salida de PIV.
2. Inmunofluorescencia microscopía ensayos
   1. Tomar los sustratos a inmunotinción a la campana laminar y eliminar los medios de cultivo.
   2. Enjuagar los sustratos con PBS y fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min a TA.
   3. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez). En consecuencia, se incuban los sustratos con potenciador de señal de 500 l durante 30 minutos y enjuagar con PBS.
   4. Se incuban las células con anticuerpo monoclonal anti-vinculina en una dilución 1: 250 en PBS durante 45 min a TA. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez).
   5. Incubar las muestras con anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 de IgG de cabra anti-ratón en una dilución 1: 200en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez).
   6. Para visualizar la estructura F-actina, incubar las células con TRITC faloidina conjugados a una concentración 50 mg / ml durante 45 min a RT. Lavar los sustratos con PBS durante 3 veces (5 min cada vez).
   7. Imagen de las muestras mediante microscopio láser confocal de barrido (Figura 5A - 5D).

Resultados

El protocolo descrito anteriormente se emplea con éxito para múltiples muestras de tejido (n = 12) de cuatro pacientes diferentes según las directrices de la junta de revisión institucional. La figura 1A ilustra un tumor colorrectal representante de la derecha después de la cirugía de la que se obtienen los cortes de tejido para cultivos celulares. Una sección de tejido típico en solución HBSS después de la transferencia a la campana laminar para su posterior procesamiento se muestra en

Discusión

La tensión de tracción celular ha surgido recientemente como un potencial indicador biofísico del estado metastásico ^13. Sin embargo, no existen datos tracción experimental con células tumorales primarias en la literatura hasta la fecha. Además, el cultivo de las células del colon directamente aislados primaria en diferentes geles de poliacrilamida rigidez no se informa todavía. Por lo tanto, establecemos un colon primaria optimizadas las condiciones de cultivo de células en geles y poliestireno

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
HBSS	Life technologies	14175-095
PBS	Lonza	17-516F
Trypsin	Worthington	LS003736
Collagenese	Worthington	LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)	Sigma-Aldrich	281778
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	01201-5
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
N- methylenebisacrylamide (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	161-0801
Human fibronectin	BD biosciences	354008
Hydrazine hydrate	Sigma-Aldrich	18412	Hazardous
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT15710
Signal enhancer	Life technologies	I36933
Monoclonal anti vinculin antibody	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life technologies	A11001
TRITC phalloidin conjugates	Sigma-Aldrich	P1951
0.1 µm fluroscent beads	Life technologies	F8801
0.25% Trypsin-EDTA	Life technologies	25200-056
			Materials
12 mm2 glass cover slips	Corning	2865-12