Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Résumé

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Résumé

Les cellules cancéreuses réagissent à la matrice de rigidité mécanique d'une manière complexe en utilisant un hiérarchique système coordonné mécano-chimique composée de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires ^{1, 2.} mécanosensibilité de cellules cancéreuses différentes in vitro sont étudiée principalement avec des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires. Par conséquent, on en sait peu sur la mécanosensibilité de cellules de cancer du côlon humains primaires in vitro. Ici, un protocole optimisé est développé qui décrit l'isolement de cellules du colon à partir d'échantillons humains primaires saines et cancéreuses tissus humains chirurgicales. Les cellules du côlon isolés sont ensuite cultivés avec succès sur le doux (2 kPa raideur) et rigide (10 kPa raideur) hydrogels de polyacrylamide et polystyrène rigide (~ 3,6 GPa de rigidité) substrats fonctionnalisés par une matrice extracellulaire (fibronectinedans ce cas). Les microbilles fluorescentes sont incorporées dans des gels mous à proximité de la surface de culture cellulaire, et essai de traction est effectué pour évaluer les contraintes de contraction cellulaire en utilisant le logiciel d'accès ouvert libre. En outre, la microscopie d'immunofluorescence sur des substrats différents de rigidité fournit des informations utiles sur la morphologie de la cellule primaire, l'organisation du cytosquelette et la vinculine contenant adhésions focales en fonction de la rigidité substrat.

Introduction

Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus évident que les micro-environnement mécanique, en plus des facteurs biochimiques, joue un rôle important dans la régulation des fonctions cellulaires. Les cellules peuvent détecter et de répondre à la rigidité du substrat sur ​​lequel elles sont respectées (comme dans la culture 2D) ou entourées par (comme dans la culture 3D) ^7.3. En faisant cela, les cellules peuvent moduler leur différenciation ^{3, 4} morphologie, la migration / mobilité ^5, biophysiques propriétés ^{6, 7} croissance, et d'autres processus.

Les cellules cancéreuses répondent également à la rigidité de la matrice 2D et 3D en utilisant une combinaison coordonnée hiérarchique mécano-chimique de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires ^{1, 2.} Par exemple, les cellules epitheliales mammaires (CEM) former parenchyme acineuses normale lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats 150 Pa qui est similaire à la rigiditédes tissus mammaires sains. Fait intéressant, ils présentent les caractéristiques d'une tumeur en développement, à la fois structurelles et de transcription, lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats rigides (> 5000 Pa) qui imitent la rigidité d'un stroma tumoral ^8. En outre, une autre expérience montre que la tumorigenèse mammaire est accompagné par une réticulation du collagène et de raidissement ⁹ ECM. Des expériences récentes montrent que carcinome du côlon humain HCT-8 () cellules présentent des métastases phénotype (MLP) lorsqu'elles sont cultivées sur des substrats 2D ayant la rigidité physiologiquement pertinente (20-47 kPa), mais pas sur très raide (3,6 GPa) substrats ^{10- 12} .Ces premières cellules forment des amas de cellules tumorales comme dissocient et puis de l'autre, à partir de la périphérie. Comme cette épithéliale à arrondie morphologique (E à R transition) changement se produit, elles prolifèrent, réduire cellule-cellule et cellule-ECM adhérence, et devenir migratoire. HCT-8 cellules cultivées sur des substrats de polystyrène très durs ne pas exposer ceux-citraits malignes. Ainsi, il a été émis l'hypothèse que HCT-8 cellules deviennent métastatique en raison de leur exposition aux micro-environnement approprié. Il est à noter que ces expériences sont réalisées avec des lignées cellulaires de cancer immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires.

Une étude récente propose que le stress augmentée de traction cellulaire peut être utilisé comme une signature biophysique potentiel pour les cellules métastatiques ¹³ .Le étude consiste à mesurer la force de traction de différentes lignées de cellules cancéreuses humaines sur des gels de Polyacrylamide. On constate que les cellules cancéreuses métastatiques peuvent exercer une contrainte sensiblement plus élevé de traction par rapport aux cellules non métastatiques ¹³ dans tous les cas. Cependant, ces résultats contredisent directement les résultats publiés précédemment sur ​​murins lignées cellulaires dérivées du cancer du sein ^14. En outre, une étude récente met en évidence des différences notables entre les cellules humaines immortalisées et primaires dans leur remodelage du cytosquelette proprofilage protéine et la survie cellulaire expression de la protéine ^15. Par conséquent, il est important de revenir sur la plupart des tests biophysiques traction, y compris pour les cellules cancéreuses humaines primaires. Cela permettra de répondre à la question de savoir si les cellules primaires récapitulent immortalisée lignées cellulaires de cancer tendance de traction.

Le protocole décrit ici est optimisée pour l'isolement de cellules primaires humaines du côlon (à la fois saines et cancéreuses), et pour les cultiver sur des substrats mous (hydrogels de Polyacrylamide), ainsi que sur des boîtes de Pétri. Le protocole est basé sur la digestion enzymatique et dissociation consécutive de l'échantillon de tissu chirurgical en suspension de cellules individuelles ^16. A notre connaissance, ceci est la première démonstration de la culture isolée tumeur primaire du colon et de cellules normales directement sur des substrats souples d'hydrogel avec microbilles fluorescentes embarqués pour la traction cytométrie. Substrats de gel transparent permettent également immunocoloration. Cette analyse a révélé des différences dans l'organisation F-actine etadhésions focales dans les cellules du côlon humaines primaires que les changements de rigidité du substrat. Cette plate-forme de culture cellulaire ouvre la possibilité d'explorer diverses propriétés biophysiques des cellules humaines primaires telles que la rigidité des cellules et de traction en tant que paramètres de pronostic du cancer.

Protocole

Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices de l'UIUC comité d'éthique de la recherche humaine.

1. Collecte et digestion de l'échantillon de tissu chirurgical

1. Recueillir l'échantillon de tissu tumoral juste après la résection du côlon (figure 1A et 1B). Prélever des tissus sur un site sain adjacent ainsi.
2. Transférer le tissu immédiatement dans un flacon de 15 ml contenant 12 ml de solution HBSS. Conserver le flacon sur la glace à l'intérieur d'une boîte de mousse isolante.
3. Transporter le tissu contenant flacon à une culture capot de tissu pour un traitement ultérieur dans les 45 min. Conserver le flacon sur un bloc de glace à l'intérieur du capot.
4. Verser le tissu fourni dans une plaque à 6 puits contenant 6-7 ml de solution HBSS aide d'une pipette.
   Remarque: Montant de tissu par puits est pas critique dans cette étape de rinçage.
5. Conservez la plaque à 6 puits sur un bloc de glace. Rincer deux fois le tissu dans une solution HBSS.
6. Coupez le tissu proprement en sections séparées avec scis stérilessor. Mince tissu en sections plus petites ne dépassant pas 1 à 2 mm de taille ³ avec une lame de scalpel stérile.
7. Peser 0,1% de trypsine un flacon étiqueté (contenant 1 ml de solution de trypsine 0,1%) avant de transférer le tissu. Transférer ~ 20 mg de tissu dans chacune des fioles de trypsine 0,1% de avec une pipette.
8. Essayer de minimiser le transfert de HBSS dans le flacon de la trypsine afin d'éviter une dilution supplémentaire de la trypsine.
9. Peser les flacons de la trypsine après transfert de tissu; documenter la différence que la masse tissulaire.
10. Verser ~ 20 mg de tissu et de 1 ml de trypsine dans chaque puits d'une plaque à 24 puits.
11. Mettez la plaque à 24 puits sur un agitateur dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 16-20 h. Pendant cette période d'attente ou à une date antérieure, préparer polyacrylamide substrats de gel et de les fonctionnaliser avec des protéines d'ECM comme décrit dans la section 3.

2. Dissociation enzymatique de l'échantillon de tissu dans une cellule unique Suspension et culture de cellules isolées sur ECM fonctionnalisés élastique Substrates et des boîtes en polystyrène rigide

1. Après 16-20 h d'incubation dans de la trypsine et à 4 ° C sur agitateur, transférer à partir de tissu 4 ° C trypsine à 4 ° C complet flacon de milieu de croissance (contenant 3.2 ml de milieu de croissance complet) à l'aide d'une pipette. Assurer le transfert minimale de trypsine dans des milieux de croissance.
   Remarque: formulation complète de milieu de croissance est la suivante: milieu RPMI 1640 additionné de base avec du sérum de cheval à une concentration finale de 10% et de la pénicilline-streptomycine à 1% de la solution totale.
2. Placez le tissu contenant flacon de médias dans un bain d'eau chaude à 37 ° C pendant 12-15 min.
3. Transférer le tissu à un flacon de 15 ml contenant une solution HBSS aide d'une pipette, secouez doucement.
4. Répétez 2.3.
5. Retirer le tissu de la solution HBSS et transfert à 0,1% solution de collagénase (dans HBSS) flacon contenant 1 ml de solution. Incuber pendant 45 min à 37 ° C et 5% de _CO2 dans un environnement humidifié incubateur de culture cellulaire. Pendant la période d'attente, growt chaudeh médias dans un flacon de 15 ml à 37 ° C dans un bain d'eau.
6. Tirez sur tous les fragments de tissus en pipette minimisation collagénase report. Ejecter seulement les fragments de tissus dans des flacons de milieux de culture préchauffées.
7. Placer un filtre de 40 um bien insert dans chaque puits d'une plaque à 6 puits. Humidifier le filtre avec 1 ml de milieu de culture cellulaire.
8. Tissus triturer dans les médias avec une pipette de 10 ml en verre plusieurs fois jusqu'à ce que le tissu est complètement dissocié.
9. Maintenir l'embout de pipette le plus près possible de la base du flacon.
10. Déposer la solution sur le filtre pour éliminer les débris et les parties non dissociées.
11. Centrifugeuse filtré suspension de cellules dans un milieu à 150 g pendant 5 min à température ambiante.
12. Eliminer le surnageant et remettre en suspension après culot de cellules avec 2 ml de milieu de culture frais.
13. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre (si nécessaire). Graine isolé des cellules primaires sur la matrice extracellulaire (ECM) fonctionnalisés et des gels de polystyrène plats à la concentration souhaitée.

3. Préparation et fonctionnalisation des différentes raideurs de polyacrylamide (PA) Gels et polystyrène substrats

Remarque: Pour la démonstration visuelle de l'article 3, les téléspectateurs / lecteurs sont appelés à une récente Journal of Visualized Experiments (JoVE) l'article ^17.

1. L'adoption de protocoles publiés ^{18, 19,} 12 mm ² activent couvercle en verre glisse chimiquement pour assurer la liaison covalente de l'hydrogel.
   1. Tout d'abord, couvercle en verre glisse avec plaisir 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) pour 7 min à température ambiante.
   2. Retirer l'ATS complètement avec DI rinçage à l'eau et traiter couvercle glisse avec 0,5% de glutaraldéhyde (dilué dans de la solution PBS Glutaraldehyde boursier de 70%) pour 30 min.
2. Obtenir deux solutions de gel kPa en mélangeant 5% en poids / solution d'acrylamide v et 0,05% de N, -methylenebisacrylamide (bis) solution N '10 mM dans une solution saline tamponnée au HEPES ^20. Utilisation 8% p / v d'acrylamide et 0,13% N, -methylenebisacrylamide (bis) solution N 'dans 10 mM de solution saline tamponnée HEPES 10 kPa ²⁰ gel.
   1. Dans les deux cas, utiliser 1: 200 persulfate d'ammonium (10% p / v) et 1: 2000 N, N, N ', N' -tetramethylethylenediamine (TEMED) comme initiateur et de catalyseur pour le procédé de polymérisation, respectivement.
   2. En outre, ajouter 100 ul perles fluorescentes à 2 solution de gel kPa comme marqueurs fiduciaires ^{21, 22.}
3. Déposez une goutte de 20 pi de solution de gel PA pré-polymère sur le 12 mm ² activé couvercle en verre de glissement. Placez un autre 12 mm ² régulière lamelle de verre sur la chute. Assurez-vous que la baisse se propage entre les lamelles par capillarité. Inverser le sandwich à deux gels kPa afin d'assurer que la plupart des billes viennent à proximité de la surface de culture cellulaire.
4. Guérir le gel PA pendant 45 min à température ambiante.
5. Décoller la lamelle supérieure en utilisant un seul rasoir de bord.
   Remarque: Lors de l'épluchage, le détachement procède d'un borddu sandwich. Le gel reste adhérente à la lame de verre activée.
6. Stocker les gels dans une solution de PBS avant utilisation.
7. Fonctionnaliser gels PA et le verre avec des molécules d'ECM, la fibronectine humaine à une concentration de 50 pg / ml ²³ méthodes suivantes publiées.
   1. En bref, des substrats incuber avec 2 ml d'hydrazine hydrate pur O / N.
   2. Retirer l'hydrate d'hydrazine et bien rincer les substrats avec de l'eau DI.
   3. Laver les substrats avec de l'acide acétique à 5% pendant 30 min.
   4. Éliminer l'acide acétique et bien rincer les substrats avec de l'eau DI.
   5. Gardez les substrats immergés dans l'eau DI pendant 30 min.
   6. Incuber les substrats avec la fibronectine oxydé pendant 35 min à une concentration de 50 ug / ml.
   7. Rincer les substrats avec PBS sur agitateur à bas régime pendant 10 min.
   8. Incuber tous les substrats à 37 ° C dans 2-3 ml de milieu de culture pendant 30 min avant l'étalement des cellules.
      Remarque: cellules de la plaque dans un peu peuplerd manière (1.000-3.000 cellules / cm ^2). Chaque bordereau de verre gel-couvert doit être contenue dans une boîte de Pétri de 35 mm. Permettre aux cellules d'adhérer complètement avant toute microscopie (au moins O / N).

4. Traction microscopie à force et immunofluorescence Microscopie dosages

1. Traction Force Microscopy Assay
   1. Trypsine-EDTA / solution chaude de 0,25% à 10% de SDS à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 10 minutes avant le début des essais de traction.
   2. Retirer un gel de l'incubateur de culture cellulaire à un moment et placer sur la platine du microscope fluorescent inversé (grossissement 32X).
   3. Trouver une seule cellule dans le champ de vision. Retirez le couvercle plat Petri.
   4. Prenez une image de contraste de phase de cellule (par exemple, la figure 3).
   5. Changez le mode d'imagerie à fluorescence et de sélectionner un filtre approprié. Ne déplacez pas la platine du microscope ou de l'échantillon pendant ce temps.
   6. Prenez une image de l'perles fluorescentes displaced par traction cellulaire (figure 4C).
   7. Ajouter la solution / SDS 1 ml de trypsine à boîte de Pétri pour détacher la cellule de gel. Ne déplacez pas la platine du microscope ou de l'échantillon pendant ce temps. Aussi, prenez une image de contrôle de la cellule pour assurer l'élimination complète du gel.
   8. Prenez une image de référence (force nulle) des billes après la cellule est supprimée.
   9. Répétez les étapes 4.1.2-4.1.8 pour tous les autres gels.
   10. Faire une pile d'images utilisant ImageJ des deux images acquises à l'étape 4.1.6 et 4.1.8 pour chaque cas. Pour générer la pile d'images, utilisez la séquence suivante de commandes dans ImageJ après l'ouverture des images: Image → → Stacks Images à empiler.
   11. Pour obtenir le champ de déplacement et de traction, utiliser des plugins ImageJ suivante méthodes publiées ^{21, 22} Obtenir des codes et des tutoriels détaillés pour ces plugins en utilisant le lien suivant:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
       1. Alignez les images de la pile en utilisant le plugin 'Matching Template'. Utilisez la séquence suivante de commandes dans ImageJ après l'ouverture de la pile de l'image générée à l'étape 4.1.10: Plugins → Template Matching → Aligner les tranches dans Stack → OK. Enregistrer la pile de l'image en conséquence. Utilisez cette nouvelle pile d'images dans les étapes suivantes.
       2. Obtenir le champ de déplacement en utilisant la PIV (vélocimétrie par images de particules) plugin (Figure 4D). Utilisez la séquence suivante de commandes après l'ouverture de la pile de l'image sauvegardée à l'étape 4.1.11.1: Plugins → → itératif PIV PIV (de base) → OK → Accepter cette PIV et la sortie → OK. Enregistrer la sortie de PIV dans le même répertoire que dans la pile de l'image originale. Utilisez-le comme entrée à l'étape suivante.
       3. Enfin utiliser (transformée de Fourier traction cytométrie) le FTTC plug-in pour obtenir la carte de traction (figure 4E). Utilisez la séquence suivante de commandes: Plugins → → FTTC Insert les propriétés des matériaux, à savoir, le module de Young et le coefficient de Poisson de PA gel → OK → Sélectionnez le fichier de sortie de PIV enregistré à l'étape 4.1.11.2 → OK. Sauvegarder FTTC résulte dans le même répertoire que dans la pile d'image et sortie PIV.
2. Immunofluorescence Microscopie dosages
   1. Prenez les substrats à immunocolorées à la hotte laminaire et retirez le support de culture.
   2. Rincer les substrats avec du PBS et on fixe les cellules avec du paraformaldehyde à 4% dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.
   3. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois). Par conséquent, incuber les substrats avec 500 ul Amplificateur de signal pendant 30 minutes et rincer avec du PBS.
   4. Incuber les cellules avec un anticorps monoclonal anti-vinculine à une dilution de 1: 250 dans du PBS pendant 45 min à température ambiante. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois).
   5. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire Alexa Fluor 488 IgG de chèvre anti-souris à une dilution de 1: 200dans du PBS à température ambiante pendant 30 min. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois).
   6. Pour visualiser la structure F-actine, incuber les cellules avec la phalloïdine TRITC conjugués à une concentration de 50 ug / ml pendant 45 min à température ambiante. Laver les substrats avec du PBS pendant 3 fois (5 min à chaque fois).
   7. Image les échantillons en utilisant microscope confocal à balayage laser (figure 5A - 5D).

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus est utilisé avec succès pour plusieurs échantillons de tissus (n = 12) de quatre patients différents selon les lignes directrices de la commission d'examen institutionnel. Figure 1A illustre une tumeur colorectale représentant tout de suite après la chirurgie à partir de laquelle on obtient des coupes de tissus pour les cultures de cellules. Une section typique de tissu dans une solution HBSS après le transfert de la hotte laminaire pour un traitement suppléme...

Discussion

Effort de traction cellulaire a récemment émergé comme un indicateur potentiel biophysique de l'état métastatique ^13. Cependant, aucune donnée expérimentale de traction avec des cellules tumorales primaires existe dans la littérature à ce jour. En outre, la culture directement isolées les cellules du côlon primaire sur différents gels rigidité de polyacrylamide est pas encore signalé. Par conséquent, nous établissons un système optimisé côlon primaire conditions de culture cellulaire su...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
HBSS	Life technologies	14175-095
PBS	Lonza	17-516F
Trypsin	Worthington	LS003736
Collagenese	Worthington	LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)	Sigma-Aldrich	281778
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	01201-5
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
N- methylenebisacrylamide (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	161-0801
Human fibronectin	BD biosciences	354008
Hydrazine hydrate	Sigma-Aldrich	18412	Hazardous
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT15710
Signal enhancer	Life technologies	I36933
Monoclonal anti vinculin antibody	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life technologies	A11001
TRITC phalloidin conjugates	Sigma-Aldrich	P1951
0.1 µm fluroscent beads	Life technologies	F8801
0.25% Trypsin-EDTA	Life technologies	25200-056
			Materials
12 mm2 glass cover slips	Corning	2865-12