Visualización de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

Resumen

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Resumen

Durante bacteriemia Streptococcus pneumoniae puede trasladar a través del endotelio vascular en el miocardio y formar bacterias llenos discretas lesiones microscópicas (microlesiones) que son notable debido a la ausencia de la infiltración de células inmunes. Debido a su liberación de productos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesiones se cree que contribuyen a la insuficiencia cardíaca que se observa con frecuencia durante la enfermedad neumocócica invasiva fulminante en adultos. En esto se demuestra un protocolo para la infección experimental de ratón que lleva a la formación reproducible microlesión cardíaco dentro de 30 horas. La instrucción es proporcionada en la identificación microlesión en hematoxilina y eosina secciones de corazón de colores y las distinciones morfológicas entre microlesiones principios y finales se destacan. La instrucción es proporcionada en un protocolo para la verificación de S. pneumoniae dentro microlesiones utilizando anticuerpos contra el polisacárido capsular de neumococo ymicroscopía de inmunofluorescencia. Por último, se proporciona un protocolo de intervención antibiótico que rescata los ratones infectados y para la detección y evaluación de la formación de cicatrices en los corazones de los ratones convalecientes. Juntos, estos protocolos facilitar la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la invasión cardiaca neumocócica, muerte de los cardiomiocitos, la remodelación cardiaca como resultado de la exposición a S. pneumoniae, y la respuesta inmune a los neumococos en el corazón.

Introducción

La hospitalización de adultos para la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) conlleva un riesgo documentado de eventos cardiacos adversos que contribuyen a la mortalidad ^1-4. En un estudio reciente de Corrales-Medina et al. Se encontraron complicaciones cardíacas que se asocia con y / o responsable del 27% de las muertes por neumonía asociada a ^3. Streptococcus pneumoniae (neumococo), la causa más común de la PAC y la sepsis ^5, se ha asociado directamente con eventos cardíacos adversos en hasta el 19% de los pacientes adultos ingresados ^​​6. Eventos cardíacos adversos asociados con la neumonía son la insuficiencia nuevo o empeorado cardíaca congestiva, arritmias, infarto de miocardio y en orden decreciente de frecuencia ^6.

En un reciente artículo de PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae se encontró que era capaz de traslocación a través del endotelio vascular cardíaco, la entrada en el myocardium, y la formación de lesiones microscópicas no purulentas discretas (microlesiones) llenos de bacterias en los ventrículos durante la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) ^7. Se observó evidencia de formación microlesión cardiaca en muestras cardíacas de los primates no humanos y personas que habían sucumbido a la infección neumocócica. Asimismo, los ratones infectados experimentalmente desarrollaron de manera reproducible microlesiones cardíacas. En los ratones, el tamaño y el número microlesión se correlacionó positivamente con la duración y la gravedad de la bacteriemia, los niveles de troponina cardíaca en el suero, y la electrofisiología cardiaca aberrante. La translocación bacteriana en el corazón se encontró que se produzca a través de los mismos mecanismos responsables de la translocación del neumococo través de la barrera sangre-cerebro y el desarrollo de la meningitis neumocócica, es decir, la proteína de unión a colina-A mediada por invasión de células endoteliales vasculares en un receptor de laminina y de plaquetas receptor del factor de -activating manera dependiente de ^8. Microlesformación de iones también requiere la neumolisina neumocócica toxina formadora de poros que se encontró para matar a los cardiomiocitos ^7.

Microlesiones cardíacos neumocócicas son distintos del purulenta de partes blandas y abscesos cardíacas que son causadas por otras bacterias Gram-positivas, incluido el Staphylococcus aureus. Estos se caracterizan por una sola focos de bacterias rodeadas por los neutrófilos y ^9,10 deposición de fibrina. Microlesiones formado por S. pneumoniae son de menor tamaño, distribuidos a lo largo de un corazón afectado, y carecen de infiltrados de células inmunes. Durante las primeras etapas de la infección, microlesiones causadas por S. pneumoniae aparecen como áreas de tejido dañado o inflamado evocador de las muestras patológicas de la cardiomiopatía. Algunos monocitos se pueden observar durante este tiempo, sin embargo, su presencia es de corta duración y las lesiones se convierten rápidamente necrótico en apariencia y llena de bacterias, mientras que al mismo tiempo continuar a GRujo de tamaño hasta la muerte del animal o la intervención antimicrobiana. Es importante destacar que, en el plazo de 3 días de la intervención a los antibióticos, profusa infiltración de células inmunes se observa en el antiguo sitio de la lesión y esto va acompañado de robusto depósito de colágeno. La remodelación cardiaca similar se ha reportado que ocurre después de un infarto junto con consecuencias duraderas sobre la función cardíaca ^11-15. Por lo tanto, microlesiones son una posible explicación para los eventos cardíacos adversos que ocurren durante el IPD y, posiblemente, el aumento de la incidencia de la mortalidad relacionada con el corazón en personas convalecientes que han sobrevivido al episodio de la enfermedad.

En este documento, se proporciona la instrucción en el modelo experimental de ratón de IPD y formación de la lesión cardiaca y la visualización de microlesiones cardíacos en las primeras y últimas etapas de la infección. El protocolo para la detección de la deposición de colágeno en los animales que han sido salvados por la intervención antimicrobiana se demuestra. El objetivo de este artículo es facilitar la investigación de otros investigadores sobre este importante y novedoso patología neumocócica.

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Protocolo

NOTA: Todos los experimentos con ratones fueron revisados ​​y aprobados por los Comités Use y Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio (protocolo # 13032-34-01C). Cuidado de los animales y los protocolos experimentales se adhirieron a la Ley Pública 89-544 (Ley de Protección de los Animales) y sus modificaciones, directrices servicios de salud pública, y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos).

1. Infección

1. Obtener ratones BALB / c de ambos sexos entre las edades de 10 a 12 semanas de edad.
   NOTA: S. pneumoniae serotipo 4 cepa TIGR4 es un aislado clínico virulento que ha sido secuenciado ^16.
2. Crecer TIGR4 en caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C en 5% de CO ₂ hasta alcanzar una densidad óptica (OD) ₆₂₀ de 0,5 (correspondiente a 1,0 x 10 ⁸ unidades formadoras de colonias [CFU / ml)]. Sedimentar la cultura neumocócica por centrifugación durante 10 min a 3, 500 xg y eliminar el sobrenadante usando una línea de vacío. Suspender y bacterias con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) se diluye hasta una concentración final de 1,0 x 10 ⁴ CFU / ml.
3. El uso de una cámara de inducción, anestesiar a los ratones con 2,5% de isoflurano vaporizado en oxígeno. Confirme estado anestesiado por pizca dedo del pie suave con pinzas romas.
   1. Sosteniendo el ratón anestesiado por su pescuezo y en posición vertical con una mano, se inyectan cada ratón por vía intraperitoneal (ip) con 100 l de la S. pneumoniae suspensión con una jeringa con una aguja de calibre 27-30 (correspondiente a una dosis de prueba de 1,0 x 10 ³ CFU). Coloque la parte posterior del ratón en su jaula. Los ratones normalmente despiertan 30-40 segundos después de la inyección.
4. Deje que la infección de proceder por lo menos 24 (anticipada) o 30 (avanzado) hr.
   1. La eutanasia a los ratones por asfixia de CO _2. Realizar dislocación cervical para garantizar ratón ha fallecido. La eutanasia se ve confirmado por la eliminacióndel corazón en el paso 1.6.
5. Desinfectar la cola con un algodón con alcohol y cortar una sección de 2.3 mm. Recoger 2 l de sangre en serie y diluir la sangre de 10 veces en PBS que contenía heparina sódica 1 U / ml cinco veces. Placa de diluciones en serie en una placa de agar sangre de soja tríptico y se incuba durante la noche a 37 ° C en 5% de CO _2. El siguiente extrapolar días de la colonia cuenta el nivel de bacteriemia.
6. Inmovilizar el ratón en una posición supina sobre una plataforma quirúrgica. Rocíe el pecho con etanol al 70% y secar. Con unas tijeras quirúrgicas y pinzas abren la cavidad torácica, retire la caja torácica, y seccionar el diafragma para exponer el corazón y los pulmones. Con unas tijeras cortan los vasos sanguíneos conectados al corazón y los impuestos especiales suavemente el corazón con cuidado para evitar hematomas con fórceps.
7. Enjuague el corazón con PBS y luego se coloca en casetes de recogida de muestras de tejido tal que las secciones coronales se obtendrían durante el corte del tejido. Para la inclusión en parafina, place los cassettes en 10% de solución amortiguadora de formalina y al día siguiente para enviar inclusión en parafina.
   1. Alternativamente congelación ultrarrápida usando Compuesto OCT dentro de un criomolde que se ha colocado en hielo seco.

2. La visualización de las lesiones cardiacas y neumococos dentro de las lesiones

1. Reduzca secciones cardíacos incluidos en parafina de tal manera que las 4 cámaras del corazón son visibles en cada sección de tejido. Cortar las diapositivas en espesor de 5 micras.
2. Desparafinar y mancha diapositivas con hematoxilina y eosina (H & E) utilizando métodos estándar ^17.
3. Ver H & E manchadas secciones cardiacas utilizando un microscopio de luz a baja (100X, 200X) y alta (aceite de inmersión: 400X, 1.000X) aumentos. Caracterizar corazones la presencia de microlesiones en el miocardio. En este caso, la adquisición de H & E imágenes utilizando un microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con un 100X 1.3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar.
   NOTA: en las primeras etapas l cardiacaesions son discriminados por su apariencia de color diferencial y en algunos casos la presencia de células inmunes (monocitos y granulocitos) lo que parecen ser los monocitos. En lesiones avanzadas, en particular los que se observan en 30 h, las células inmunes son lesiones vacuolas como ausentes y grandes se observan en su lugar. Es importante observar que mientras que puede ocurrir la afluencia de células inmune durante las primeras etapas del desarrollo de la lesión cardiaca no parece ser un requisito.

3. inmunofluorescencia microscopía para neumococos dentro microlesiones

1. Sección corazón en criomoldes con micrótomo hasta un espesor de 5 micras y secciones lugar en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Permitir secciones cardiacas congelados se descongelen y secar al aire. Fijar secciones durante 10 min en 10% de formalina tamponada neutra (pH 6.8 a 7.2 a 25 ° C).
2. Lavado de los portaobjetos (3x) en PBS durante 5 min, permeabilizar durante 15 min en 0,2% de Triton X-100 en PBS, luego se lava de nuevo en PBS.
3. Secti tejido Bloquear en el portaobjetos con 10% de suero de cabra en PBS durante 1 hora.
4. Se lavan los portas con PBS, tapa e incubar las secciones cardiacas con conejo anti-serotipo 4 neumococo antisuero a escala 1: 1000 en PBS con 10% de suero de cabra durante 2 horas a 37 ° C.
   NOTA: Para los controles negativos investigadores deben utilizar antisuero de conejo ingenuo
5. Después de lavar con PBS, la cubierta e incubar las secciones con 10% de suero de cabra-PBS con cabra anti-conejo FITC anticuerpo conjugado a 1: 2000 durante 30 minutos a 37 ° C.
6. Siguiendo las instrucciones del fabricante, utilice DAPI (4 ', 6- diamidino-2-fenilindol) a 5 mg / ml para la visualización de los núcleos eucariotas. Lave y montar las secciones de tejido con Fluorsave.
7. Adquirir imágenes fluorescentes utilizando un sistema de microscopía confocal, tanto en baja y alta magnificación. Ajuste la apertura numérica en consecuencia para obtener resultados óptimos. Aquí, adquirir imágenes fluorescentes utilizando un sistema confocal con un objetivo 60X apertura numérica 1,42.

"> 4. Antibiótico Rescate de ratones séptico

1. Comience con ratones infectados ip con 1,0 x 10 ³ UFC de TIGR4 como se indica anteriormente en el paso 1.
2. A partir de las 30 horas después de la infección, administrar farmacéutica ampicilina grado ip (80 mg / kg de peso corporal) en 100 l de solución salina cada 12 horas durante 36 horas. Recoge los corazones en el punto de tiempo deseado y el proceso como se describe en el paso 1.6 para la inclusión en parafina y el tejido, el corte.

5. El colágeno Detección Deposición

1. El uso de xileno y lavados de alcohol graduadas con agua, Desparafinar y tejidos hidrato secciones desionizada utilizando métodos estándar ^17. Tratar secciones con ácido acuoso 0,2% fosfomolıbdico durante 5 minutos y enjuagar con agua desionizada durante 5 min.
2. Secciones mancha con 0,1% rojo sirio en ácido pícrico durante 2 horas a temperatura ambiente.
3. Lavar las secciones en ácido clorhídrico 0,01 N durante 3 min y enjuagar el uso de etanol al 70% durante 1 min.
4. DeshidrataciónTA El secciones usando el idéntico pero el orden de lavados al descrito en 5.1 revertir, deshidratar secciones cardiacas en el aumento y la clasificación concentraciones de etanol y después xileno.
5. Secciones de tejido monte con una solución de montaje para la evaluación microscópica.
6. Para identificar las regiones del depósito de colágeno, examinar secciones de tejido teñido de áreas de tinción de lectura profunda en condiciones de baja y alta magnificación utilizando un microscopio de luz. Cualquier área dentro de los ventrículos del corazón, que es de color rojo es un área donde el colágeno se ha depositado. Áreas sin esta mancha roja son sitios de tejido sano que carecen de la deposición de colágeno. Aquí, adquirir Picro Sirius Red imágenes teñidas utilizando un microscopio equipado con un objetivo 20X apertura numérica 0.5.
   NOTA: Las manchas rojas atrio en los tejidos sanos.

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Resultados

Visualización de microlesiones por H & E

Se observaron microlesiones cardíacos en los ventrículos del H & E manchadas secciones cardíacas de ratones con IPD tras su desafío ip con TIGR4. La Figura 1 muestra el aumento en el tamaño de estas lesiones entre 24 y 30 horas después de la infección (hpi), con un mayor número de hematoxilina teñidas (es decir, púrpura-azul) neumococos visible dentro de la lesión. Microlesiones se caracterizaron ...

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Discusión

En este informe, un método altamente reproducible para inducir S. pneumoniae mediada microlesiones cardíacas en ratones durante IPD y las técnicas para su visualización se demuestra. Los ratones se infectan con una dosis de bacterias que supera el umbral del sistema inmune para el despacho, dando lugar a bacteremia de alto grado, similar a la que ocurre durante la sepsis humana, y conduce a la translocación bacteriana eventual en el miocardio. Por razones aún desconocidas, S. pneumoniae en el cor...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum	Statens Serum Institut	16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
phosphomolybdic acid 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0.01 N hydrochloric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscope Slides	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	unspeciified		Standard