の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

要約

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

要約

菌血症の間、 肺炎球菌は、心筋に血管内皮間で移行して起因する免疫細胞浸潤が存在しない場合に顕著である離散細菌で満たされた顕微鏡的病変（microlesions）を形成することができる。心臓毒性製品の彼らのリリース、Sに起因するmicrolesions内ニューモニエは、しばしば成人における劇症侵襲性肺炎球菌疾患の間に観察される心不全に寄与すると考えられる。本明細書中に30時間以内に心臓の微細病変形成の再現性につながる実験的マウス感染のためのプロトコルを示している。命令はヘマトキシリン​​＆エオシン染色心臓切片で微細病変の同定に提供され、初期および後期microlesions間の形態学的な区別が強調表示されます。命令はSの検証のためのプロトコル上に設けられている肺炎球菌莢膜多糖に対する抗体を用いてmicrolesions内ニューモニエ及び免疫蛍光顕微鏡。最後に、感染したマウスの検出および回復期のマウスの心臓における瘢痕形成を評価するために救助抗生物質の介入のためのプロトコルが提供される。一緒に、これらのプロトコルは、Sへの曝露の結果として肺炎球菌心臓侵略、心筋細胞死、心臓リモデリングの基礎となる分子メカニズムの研究を促進する、肺炎 、心臓における肺炎球菌に対する免疫応答。

概要

市中肺炎（CAP）のための大人の入院は死亡率^1-4に貢献する有害心イベントのために文書化されたリスクを運ぶ。 、心臓の合併症が関連付けられていることが判明、および/ ​​または肺炎に関連した死亡例³の27％を担当した。コラレス·メディナらによる最近の研究では。 肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）、CAPと敗血症⁵の最も一般的な原因直接入院成人患者⁶のような多くの19％ほどで有害心イベントと関連していた。肺炎に関連した有害心イベントは、周波数^6を減少させるために、新規または悪化うっ血性心不全、不整脈、および心筋梗塞を含む。

Brown らによる最近のPLoSの病原記事で。、肺炎球菌は myocardiuへの参入、心臓の血管内皮を通じて転座が可能であることが判明したmであり、侵襲性肺炎球菌疾患^（IPD）7時の心室中の細菌で満たされた離散非化膿性顕微鏡的病変（microlesions）の形成。心臓の微細病変形成の証拠は、肺炎球菌感染症に屈していたヒト以外の霊長類および個人からの心臓の試料で観察された。同様に、実験的に感染させたマウスは、再現性の心臓microlesionsを開発しました。マウスでは、微細病変の大きさと数は積極的に持続し、菌血症、血清中の心筋トロポニンのレベルの重症度、および異常な心臓電気生理学と相関していた。心臓への細菌転移は、血液脳関門および肺炎球菌性髄膜炎の発症、ラミニン受容体および血小板の血管内皮細胞の、すなわち 、コリン結合タンパク質A媒介浸潤横切る肺炎球菌の転座に関与する同じメカニズムを介して起こることが見出された-activating因子受容体依存的に^8。 Microlesイオン形成はまた心筋細胞^7を殺すことが判明した肺炎球菌孔形成毒素ニューモリシンを必要とした。

肺炎球菌心臓microlesionsは、 黄色ブドウ球菌を含む、他のグラム陽性菌によって引き起こされる化膿性軟部組織および心膿瘍とは区別される。これらは、好中球およびフィブリン沈着^9,10により囲まれた細菌の単一の病巣によって特徴付けられる。 S.によって形成されたMicrolesions 肺炎連鎖球菌は 、サイズが小さく、影響を受けた心臓全体に分散、および免疫細胞浸潤を欠いている。感染の初期段階で、microlesionsはS.によって引き起こさ肺炎心筋症の病理学的徴候を彷彿とさせる、損傷または炎症を起こした組織の領域として表示されます。いくつかの単球が、この期間中に観察することができると同時にグラムを継続しながら、しかし、それらの存在は短命であり、病変は急速に外観壊死および細菌で満たさ動物または抗菌介入の死までのサイズでOW。重要なことには、抗生物質の介入の3日以内に、多量の免疫細胞の浸潤は、前者損傷部位で観察され、これは強固なコラーゲン沈着を伴う。同様心臓リモデリングは、心臓機能^11-15上の永続的な影響に加えて、以下の梗塞を発生することが報告されています。したがって、microlesionsはIPD中に発生する有害心イベント、おそらく病気のエピソードを生き残った回復期の個体における心臓関連の死亡の発生率の増加のための潜在的な説明である。

ここで、命令は、感染の初期および後期段階でIPD心臓病変形成および心臓microlesionsの可視化の実験的マウスモデルに設けられている。抗菌介入によって保存された動物におけるコラーゲン沈着の検出のためのプロトコルが示されている。この記事の目的は、Fにあるこの重要かつ新規な肺炎球菌病理上の他の研究者の研究をacilitate。

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プロトコル

注：すべてのマウス実験は、サンアントニオ（プロトコル＃の13032-34-01C）でのテキサス大学健康科学センターで施設内動物管理使用委員会によって審査され、承認された。動物のケアと公法89から544（動物福祉法）とその改正、公衆衛生サービスガイドライン、および実験動物の管理と使用に関する指針（ヘルス＆ヒューマンサービスの米国務省）に付着した実験プロトコル。

1.感染

1. 生後10〜12週齢の間に男女両方のBALB / cマウスを入手します。
   注：S. ·ニューモニエ血清型4株をTIGR4は^16を配列決定されている毒性の臨床分離株である。
2. 光学密度（OD）0.5の_620に達するまで、5％CO ₂中37℃でトッド-ヒューイットブロス中TIGR4を成長（1.0×10 ⁸コロニー形成単位[CFU] / mlに相当する）。 3で10分間遠心分離することにより肺炎球菌文化をペレット、500 XG及び真空ラインを用いて上清を除去します。サスペンドおよび1.0×10 ⁴ CFU / mlの最終濃度に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細菌を希釈する。
3. 誘導チャンバーを用いて、酸素中の2.5％イソフルラン気化を有するマウスを麻酔。鈍ピンセットで穏やかな足指のピンチで麻酔状態を確認してください。
   1. その首筋により麻酔マウスを保持し、片手で直立、Sの100μlの腹腔内（IP）を各マウスを注入ニューモニエ懸濁液 （1.0×10 ³ CFUのチャレンジ用量に相当する）27〜30ゲージ針で注射器を使用して。バックそのケージにマウスを置きます。マウスは、通常、注射後30〜40秒を目覚めさせる。
4. 感染が少なくとも24（早期）または30（高度な）時間進行させる。
   1. CO ₂窒息によりマウスを安楽死させる。マウスが死亡していることを確認するために頸椎脱臼を行います。安楽死は、さらに除去することによって確認されるステップ1.6で心の。
5. アルコール綿棒で尾を消毒2-3 mmのセクションを切り取る。血の2μlのを収集し、連続的に1 U / mlの5回ヘパリンナトリウムを含むPBS中の血液10倍に希釈する。トリプシン大豆血液寒天プレート上にプレート連続希釈し、5％、37℃で一晩インキュベートするコロニーから次の日の外挿_2. COは菌血症のレベルをカウントします。
6. 外科プラットフォーム上で仰臥位でマウスを固定化。 70％エタノールとパットの乾燥と胸をスプレーしてください。外科用ハサミとピンセットを使用すると、胸腔を開き、胸郭を削除し、心臓や肺を露出するダイアフラムを横断する。ハサミを使用すると、心臓に接続され、血管をカットし、静かにピンセットであざないように注意して心を切り出す。
7. PBSで心を洗い流してから冠状切片が組織切片中に得られるであろうような組織検体採取カセットに入れる。パラフィン包埋、ナンプラーのためにCE 10％緩衝ホルマリン液と次の日におけるカセットは、パラフィン包埋のために送る。
   1. あるいは、ドライアイス上に置かれたクリオモールド内のOCT化合物を用いたフラッシュ凍結。

心臓病変および病変内の肺炎球菌の2可視化

1. 心臓の4室はそれぞれの組織切片に表示されているようなパラフィン包埋心臓切片を切り倒し。 5μmの厚さでスライドをカット。
2. 標準的な方法^17を用いて、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）を用いて脱パラフィン化し、染色スライド。
3. 倍率：ビューH＆Eは、低（100X、200X）と高（400X、1,000倍油浸）で光顕微鏡を用いて心臓の部分を染色した。心筋におけるmicrolesionsの存在を心を特徴づける。ここでは、100X 1.3の開口数を計画-NEOFLUARの目標を装備したツァイスAxioskopを2顕微鏡を用いて、H＆E画像を取得する。
   注：初期の段階では、心臓のLesionsは、免疫細胞、単球のように見えるもの（単球および顆粒球）の存在下でそれらの差に着色外観によって、場合によっては区別される。進行した病変、30時間で見られる特にでは、免疫細胞が存在せず、大液胞様病変は、その場所で観察されているされている。これは、心臓の病変発生の初期段階での免疫細胞の流入が起こることができるが、それは必要条件ではないように注意することが重要である。

Microlesions内肺炎球菌3.免疫蛍光顕微鏡

1. 正に荷電したガラススライド上に5μmのと場所セクションの厚さにミクロトームとcryomoldsのセクション心。凍結された心臓の項では、解凍し、空気乾燥することができます。 10％中性緩衝ホルマリン（25℃でのpHは6.8〜7.2）で10分間のセクションを修正。
2. PBS中0.2％トリトンX-100で15分間透過化、5分間、PBS中のスライド（3×）で洗浄し、次にPBSで再び洗浄する。
3. ブロック組織secti 1時間、PBS中10％ヤギ血清を含むスライド上に。
4. PBSでスライドをすすぎ、カバーと1でウサギ抗血清型4肺炎球菌抗血清を用いて心臓のセクションをインキュベート：PBS中で千37℃で2時間、10％ヤギ血清で。
   注：ネガティブコントロールのために研究者らは、ナイーブウサギ抗血清を使用する必要があります
5. 37℃で30分間、2000：1で、ヤギ抗ウサギFITCコンジュゲート抗体を、10％ヤギ血清をPBSで切片をPBS、カバーで洗浄し、インキュベートした。
6. 製造業者の指示に続いて、真核生物の核の​​可視化のために5mg / mlのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を使用する。 FluorSaveで組織切片を洗浄し、マウントします。
7. 低及び高の両方の倍率で共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光画像を取得する。最適な結果を得るために、それに応じて開口数を調整します。ここでは、60X 1.42開口数の対物レンズで共焦点システムを用いた蛍光画像を取得する。

敗血症のマウスの "> 4。抗生物質レスキュー

1. マウスで始まる以前に、ステップ1で示したようにTIGR4の1.0×10 ³ CFU を腹腔に感染。
2. 30時間感染後で開始し、100μlの生理食塩水に36時間ごとに12時間を医薬品グレードのアンピシリンIP（80 mg / kg体重）を管理。パラフィン包埋組織、切片のためのステップ1.6で説明したように所望の時点とプロセスでの心を収集します。

5.コラーゲン沈着の検出

1. キシレンを使用して、標準的な方法^17を使用して、脱イオン水、脱パラフィンおよび水和物組織切片をアルコールでの洗浄を段階的。 5分間、水、0.2％リンモリブデン酸とのセクションを治療し、5分間脱イオン水ですすいでください。
2. 室温で2時間、ピクリン酸中の0.1％シリウスレッドによる染色切片。
3. 3分間の0.01 N塩酸のセクションを洗浄し、1分間、70％エタノールを用いてすすぐ。
4. Dehydra次いで、キシレンを使用して、同一のセクションをteのが、5.1に概説されたものに洗浄の順序を逆にする、エタノールの濃度を増加させ、段階的に、心臓切片を脱水する。
5. 顕微鏡的評価のためのマウントソリューションでマウント組織切片。
6. コラーゲン沈着の領域を同定するために、光学顕微鏡を用いて、低域と高倍率で深い読み取り染色の領域について染色した組織切片を調べる。赤である心臓の心室内の任意の領域は、コラーゲンが堆積された領域である。この赤い染みのない領域はコラーゲン沈着を欠いている健康な組織のサイトです。本明細書において、Picroシリウスレッドを取得するには、20X 0.5開口数の対物レンズを備えた顕微鏡を用いて画像を染色した。
   注：健常組織における赤アトリウムの汚れ。

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結果

H＆EでMicrolesionsの可視化

心臓microlesionsはTIGR4との腹腔内チャレンジ以下IPDを有するマウスからの心臓の切片をH＆E染色の心室で観察された。 図1は、ヘマトキシリンより多くて、24及び30時間感染後（hpiの）との間のこれらの病変の大きさの増加を示している病変内に見える-stained（ すなわち 、紫-青）肺炎球菌。 Microlesionsは液胞様の形態、密度の...

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ディスカッション

本報告書では、再現性の高い方法は、Sを誘導する肺炎連鎖球菌は、IPD中に、マウスにおける心臓microlesionsを媒介し、その可視化するための技術が実証されている。マウスは、ヒトの敗血症の間に生じ、心筋内に最終的に細菌のトランスロケーションをもたらすものと同様の高品位菌血症に至るクリアランス免疫系の閾値を超えた細菌の投与量で感染させる。まだ未知の理由のた...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum	Statens Serum Institut	16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
phosphomolybdic acid 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0.01 N hydrochloric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscope Slides	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	unspeciified		Standard