시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

요약

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

초록

균혈증 동안 폐렴 구균은 심근에 혈관 내피 세포에서 이동시키다 및 이산 박테리아 채워진 미세한 병변으로 인해 면역 세포 침투의 부재로 주목받는 (microlesions)를 형성 할 수있다. 때문에 심독성 제품의 석방, S.에 microlesions 내 폐렴이 자주 성인의 뇌 산염 침습성 폐렴 구균 질환 동안 관찰되는 심부전에 기여하는 것으로 생각된다. 여기에서 30 시간 내에 심장 microlesion 형성을 재현하기 위해 리드 실험 마우스 감염에 대한 프로토콜을 설명된다. 명령이 헤 마톡 실린 및 스테인드 마음 섹션과 초기와 후기 microlesions의 형태 학적 차이를 에오신에 microlesion 식별에 제공된다 강조 표시됩니다. 명령은 S. 검증을위한 프로토콜에 제공되고 폐렴 구균 캡슐 다당류에 대한 항체를 사용하여 microlesions 내 폐렴면역 형광 현미경. 마지막으로, 감염된 마우스 및 검색 및 회복기 마우스의 마음의 흉터 형성의 평가를 구출 항생제 개입을위한 프로토콜을 제공한다. 함께, 이러한 프로토콜은 S. 노출의 결과로서 심근 침윤 폐렴, 심근 사망, 심근 개형 기본 분자 메커니즘의 연구를 촉진 할 것이다 폐렴과 심장의 폐렴 구균에 대한 면역 반응.

서문

지역 사회 획득 폐렴 (CAP)에 대한 성인의 입원 사망률 ^1-4에 기여 심장 관련 부작용에 대한 문서화 된 위험을 운반합니다. 코랄 레스 - 메디나 등의 등의 최근 연구에서. 심장 합병증과 및 / 또는 책임 폐렴 관련 사망 ^3의 27 %에 대해 관련이있는 것으로 밝혀졌다. 폐렴 구균 (폐렴), CAP 패혈증 ^5의 가장 흔한 원인, 직접 인정 성인 환자 ⁶ 많은 19 % 정도에서 심장 관련 부작용과 관련이있다. 폐렴과 관련된 심장 관련 부작용은 주파수 ^{(6)의 내림차순} 신규 또는 악화 울혈 성 심부전, 부정맥, 심근 경색 등이 있습니다.

브라운 등의 등의 최근 PLoS의 병원체 글에서., S. 폐렴은 myocardiu에 심장 혈관 내피 세포, 항목을 통해 전위 할 수있는 것으로 밝혀졌다m, 및 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD) ^7시 심실의 박테리아로 가득 이산 비 화농성 미세한 병변 (microlesions)의 형성. 심장 microlesion 형성의 증거는 폐렴 구균 감염에 굴복 한 인간이 아닌 영장류와 사람에서 심장 샘플에서 관찰되었다. 마찬가지로, 실험적으로 감염된 마우스는 재현성 심장 microlesions을 개발했다. 마우스에서 microlesion의 크기와 수는 긍정적 기간 및 균혈증, 혈청 심장 트로포 닌 수준의 심각도 및 비정상적인 심장 전기 생리학과의 상관 관계를 보였다. 마음에 세균 전좌는 혈액 - 뇌 장벽 및 폐렴 구균 성 수막염의 개발, 라미닌 수용체 혈소판, 혈관 내피 세포, 즉 콜린 결합 단백질 매개 내습 걸쳐 폐렴 전좌에 대한 책임 동일한 메커니즘을 통해 발생하는 것으로 밝혀졌다 활성화시키는 인자 수용체 의존적 ^8. Microles이온 형성은 심근 ^{7 죽일} 발견 된 폐렴 구균 기공 형성 독소 뉴 몰리이 필요합니다.

폐렴 구균 심장 microlesions은 황색 포도상 구균을 포함한 다른 그람 양성 세균에 의해 발생하는 화농성 연부 조직 및 심장 농양에서 구별된다. 이들은 호중구와 섬유소 침착 ^9,10 의해 둘러싸여 박테리아 단일 초점을 특징으로한다. Microlesions S.에 의해 형성 폐렴은 영향을받는 심장에 분포 크기, 작은, 그리고 면역 세포 침윤이 부족하다. 감염의 초기 단계 동안, microlesions는 S. 의한 폐렴은 심근 병증의 병적 징후를 연상 손상되거나 염증 조직의 영역으로 나타납니다. 일부 단핵구 그러나 그들의 존재는 수명이 짧고 병변은 빠른 속도로 동시에 GR 계속하면서 모양이 괴사되고 박테리아로 가득,이 시간 동안 관찰 할 수있다동물이나 항균 개입의 죽음까지 크기 아야. 중요한 항생제 개입 3 일 이내에, 넘치 면역 세포 침윤은 전 병변 부위에서 관찰이 강력한 콜라겐 침착을 수반한다. 유사 심장 리모델링은 심장 기능 ^11-15에 영향을 지속과 함께 경색에 따라 발생하는 것으로보고되었습니다. 따라서, microlesions 질병 에피소드에서 살아남은 회복기 개인의 심장 관련 사망의 발생률이 증가 IPD 동안 가능성이 발생하는 심장 관련 부작용에 ​​대한 잠재적 인 설명이다.

여기서, 명령은 감염의 초기와 후기 단계에서 IPD 심장 병변 형성 및 심장 microlesions의 가시화 실험 마우스 모델에 제공된다. 항균 개입하여 저장 한 동물에서 콜라겐 침착의 검출을위한 프로토콜이 설명된다. 이 문서의 목적은 F이다이 중요하고 새로운 폐렴 구균 병리에 다른 연구자의 연구를 acilitate.

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프로토콜

참고 : 모든 마우스 실험을 검토하고 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학 (프로토콜 # 1 13032-34-01C)에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물 관리 및 공법 89-544 (동물 복지 법) 및 그 수정, 보건 서비스 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서 (보건 복지부의 미국학과)에 부착 된 실험 프로토콜을 지원합니다.

1. 감염

1. 10-12 주 나이에 세 사이의 남성과 여성 모두의 BALB / c 마우스를 가져옵니다.
   참고 : S. 폐렴 구균 혈청 형 4 변형 TIGR4 ^{16 염기} 서열 된 악성 임상 격리입니다.
2. 광학 밀도 (OD) 0.5 _{(620)에 도달} 할 때까지 5 % CO _2에서 37 ° C에서 토드 - 휴이 국물 TIGR4 성장 (1.0 × ¹⁰⁸ 콜로니 형성 단위 [CFU] / ㎖에 상응 함). (3)에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 펠렛 배양 폐렴500 XG 및 진공 라인을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 일시 및 1.0 × ¹⁰⁴ CFU / ml의 최종 농도로 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 된 세균.
3. 유도 챔버를 사용하여, 산소 2.5 % 증발 이소 플루 란과 쥐를 마취. 무딘 핀셋과 부드러운 발가락 핀치 마취 상태를 확인합니다.
   1. 한 손으로는 목덜미에 의해 마취 마우스를 잡고 똑바로하면, S. 100 ㎕와 각 마우스 복강 (IP)을 주입 (1.0 × ¹⁰³ CFU의 도전 량에 해당) 27 ~ 30 게이지 바늘과 주사기를 사용 폐렴 서스펜션. 케이지에서 마우스 다시 놓습니다. 마우스는 일반적으로 주사 후 30 ~ 40 초 각성.
4. 감염이 적어도 (초) 24 또는 30 (고급) 시간 동안 할 수있게합니다.
   1. CO ₂ 질식하여 쥐를 안락사. 마우스를 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행하는 사망했다. 안락사는 더 제거에 의해 확인단계 1.6의 마음.
5. 알코올 면봉으로 꼬리를 소독하고 2-3 밀리미터 부분을 싹둑. 혈액의 2 μl를 수집하고 직렬 나트륨 헤파린 1 U / ml의 다섯 배를 포함하는 PBS에 혈액을 10 배 희석. 플레이트 직렬 트립신 간장 혈액 한천 플레이트에 희석과 식민지에서 다음날 추정 해 균혈증의 수준을 계산 CO ₂ 5 %에서 37 ° C에서 밤새 품어.
6. 수술 플랫폼에서 부정사 위치에 마우스를 고정. 70 % 에탄올과 팻 건조와 가슴 스프레이. 수술 가위와 집게가 흉강을 열고 사용, 갈비뼈를 제거하고 심장과 폐를 노출하는 격막을 가로로 쪼개다. 사용 가위은 심장에 연결된 혈관을 잘라 부드럽게 집게와 멍 않도록주의 마음을 절제.
7. PBS과 마음을 씻어 후 관상 섹션 조직 절편 동안 획득 될 수 있도록 조직 표본 수집 카세트에 배치합니다. 파라핀 삽입, 놀이터 용파라핀 임베딩 보내 10 % 완충 포르말린 용액과 다음 날에 카세트 CE.
   1. 또한 드라이 아이스에 배치 된 cryomold 내에서의 OCT 화합물을 이용하여 플래시 동결.

심장 병변 및 병변 내 폐렴 구균 2. 시각화

1. 마음의 4 챔버는 각 조직 섹션에서 볼 수 있도록 파라핀 심장 부분을 잘라. 5 μm의 두께에 슬라이드를 잘라.
2. 표준 방법 ^(17)를 사용하여 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 Deparaffinize와 얼룩 슬라이드.
3. 배율 :보기 H & E는 낮은 (100X, 200X) 및 높은 (400 배, 1000 배 기름 침지)에서 광학 현미경을 사용하여 심장 섹션 스테인드. 심근에 microlesions의 존재에 대해 마음을 특성화. 여기에, 100X 1.3 개구 계획-NEOFLUAR 목표를 장착 한 자이스 Axioskop이 현미경을 사용하여 H & E 이미지를 수집.
   참고 : 조기 심장 리터 스테이지esions는 면역 세포, 단핵구 것으로 보인다 무엇 (단핵구와 과립구)의 존재 자신의 차 색깔 모양으로 어떤 경우에 차별된다. 특히 30 시간에서 본 고급 병변에서 면역 세포가 발견하고 큰 공포 병변이 자신의 자리에서 관찰되어 있습니다. 이것은 심장 병변 개발 초기 단계 면역 세포의 유입이 발생하면서 요구 것으로 나타나지 않음에 유의하는 것이 중요하다.

Microlesions 내 폐렴 구균 3. 면역 형광 현미경

1. 양으로 대전 된 유리 슬라이드 위에 5 μm의 장소 섹션의 두께로 마이크로톰와 cryomolds에 제 마음입니다. 얼어 붙은 심장 섹션 해동 자연 건조하도록 허용합니다. (25 ° C에서의 pH 6.8-7.2) 10 분 ~ 10 % 중성 포르말린에 대한 부분을 수정합니다.
2. 다음 PBS로 다시 씻어, PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100에서 15 분 동안 Permeabilize 하시려면, 5 분 동안 PBS에서 슬라이드 (3 배)를 씻으십시오.
3. 차단 티슈 섹션에 ì 1 시간 동안 PBS에서 10 % 염소 혈청과 슬라이드에.
4. PBS, 커버 슬라이드를 씻어 1 토끼 항 혈청 형 4 폐렴 구균 항혈청과 심장 부분을 품어 : 1,000 PBS에서 10 % 염소 혈청과 2 시간 동안 37 ° C에서.
   참고 : 음성 대조군의 경우 연구자들은 순진한 토끼 항혈청을 사용한다
5. 37 ° C에서 30 분 동안 2,000 : 1 염소 항 - 토끼 FITC 결합 된 항체와 10 % 염소 혈청 PBS로 섹션을 PBS, 커버로 세척하고 배양 한 후.
6. 제조업체의 지시에 따라, 진핵 세포의 핵의 시각화를 위해 5 ㎎ / ㎖에서 DAPI (4 ', 6 Diamidino -2- 페닐 인돌)를 사용합니다. 씻고 FluorSave과 조직 섹션을 탑재합니다.
7. 낮고 높은 배율에서 모두 공 촛점 현미경 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득. 최적의 결과를 수득하는데 따라 개구를 조정한다. 여기서, 60X 1.42 개구 수 대물와 촛점 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득.

정화조 마우스의 "> 4. 항생제 구조

1. 이전에 1 단계에 표시된대로 TIGR4 1.0 × ¹⁰³ CFU 쥐에 감염 IP를 시작합니다.
2. 30 시간의 감염 후에서 시작하여, 36 시간 동안 100 ㎕의 생리 식염수에 12 시간마다 약제 학적 등급을 암피실린 IP 하였다 (80 mg / kg 체중)을 투여. 파라핀 삽입 및 조직 절편에 대한 단계 1.6에 설명 된대로 원하는 시점과 과정에서 마음을 수집합니다.

5. 콜라겐 증착 검출

1. 표준 방법 ^(17)를 사용하여 탈 이온수, deparaffinize 및 수화물 조직 섹션과 자일 렌 등급 알코올 세척을 사용. 5 분 동안 수성 0.2 % 인 몰리브덴 산으로 섹션을 처리하고, 5 분 동안 탈 이온수로 씻어냅니다.
2. 실온에서 2 시간 동안 피크르산 0.1 %와 시리우스 레드 염색 섹션.
3. 3 분 동안 0.01 N 염산 부분을 세척하고 1 분 동안 70 % 에탄올을 사용하여 씻어.
4. Dehydra동일한를 사용하여 섹션을 테하지만 5.1에 설명 된 것과 세척의 순서를 반대로, 자일 렌 증가에 심장 섹션을 탈수 한 후 에탄올의 농도를 등급.
5. 현미경 평가를위한 설치 솔루션 마운트 조직 섹션.
6. 콜라겐 침착의 영역을 식별하기 위해 광학 현미경을 사용하여 낮은과 높은 배율에서 깊이 읽기 염색 분야 스테인드 조직 섹션을 확인합니다. 빨간색 심장의 심실 내 모든 지역은 콜라겐이 증착 된 영역입니다. 이 붉은 얼룩없이 지역은 콜라겐 침착 부족 건강한 조직의 사이트입니다. 여기서, 0.5 20X 대물 개구를 구비 한 현미경을 사용 Picro 시리우스 레드 염색 이미지를 획득.
   참고 : 건강한 조직에 빨간색 아트리움 얼룩.

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결과

H & E에 의해 Microlesions의 시각화

심장 microlesions 그림 1. TIGR4와 해당 IP의 반칙으로 IPD와 마우스의 심장 부분을 염색 H & E의 심실에서 관찰 헤 마톡 실린의 더 많은 수의 24 및 30 시간 게시물 감염 (HPI) 사이의 이러한 병변의 크기의 증가를 보여줍니다했다 병변 내에서 볼 수 -stained (즉, 보라색 블루) 폐렴 구균. Microlesions는 액포 같은 형태, 밀도 에?...

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토론

이 보고서에서, 재현성이 높은 방법을 유도 S. 폐렴은 IPD 동안 생쥐의 심장 microlesions을 매개 성 및 시각화를위한 기술이 시연된다. 마우스는 인간 패혈증 동안 발생하고, 심근 궁극적으로 세균 전좌 리드 유사한 고급 균혈증, 선도, 클리어런스에 대한 면역 시스템의 임계치를 능가 박테리아의 투여로 감염된다. S., 아직 알 수없는 이유 마음에 폐렴는 호스트 면역 반응에 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum	Statens Serum Institut	16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
phosphomolybdic acid 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0.01 N hydrochloric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscope Slides	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	unspeciified		Standard