Визуализация<em&gt; Пневмококк</em&gt; В сердечной микроповреждениям и последующих ремоделирования сердца

Резюме

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Аннотация

Во бактериемии пневмококк может перемещать через сосудистый эндотелий в миокард и образуют дискретные бактерий, заполненные микроскопические повреждения (микроповреждениям), которые замечательно из-за отсутствия проникновения иммунных клеток. Из-за их выпуском кардиотоксичных продуктов, S. пневмонии в микроповреждениям, как полагают, внести свой ​​вклад в сердечной недостаточности, которая часто наблюдается при гремучей инвазивной пневмококковой инфекции у взрослых. В этом свидетельствует протокол для экспериментального заражения мыши, что приводит к непередаваемы образование сердца microlesion в течение 30 часов. Обучение проводится по идентификации microlesion в гематоксилином и эозином окрашенные срезы сердца и морфологические различия между ранними и поздними микроповреждениям будут выделены. Обучение проводится по протоколу для проверки S. пневмонии в микроповреждениям с использованием антител против пневмококковой капсульного полисахарида ииммунофлуоресцентный микроскопии. Наконец, протокол для вмешательства антибиотиков, что спасает мышей, инфицированных и для выявления и оценки формирования рубцовой в сердцах выздоровления мышей предоставляется. Вместе, эти протоколы будут содействовать расследованию молекулярных механизмов, лежащих в основе пневмококковой сердца вторжение кардиомиоцитов смерть, ремоделирования сердца в результате воздействия S. пневмонии, а иммунный ответ на пневмококков в центре.

Введение

Госпитализация взрослых внебольничной пневмонией (ВП) осуществляет документально риск неблагоприятных сердечных событий, которые являются причиной смертности ^1-4. В недавнем исследовании, проведенном Корралес-Медина и др. Сердечно-сосудистых осложнений, оказались связаны с и / или ответственность за 27% от пневмонией смерти, связанных ^3. Пневмококк (пневмококк), наиболее распространенной причиной CAP и сепсиса ^5, была непосредственно связана с неблагоприятными сердечно-сосудистых событий в целых 19% допущенных взрослых пациентов ^6. Неблагоприятные сердечные события, связанные с пневмонией включают новые или ухудшение сердечной недостаточности, аритмии и инфаркта миокарда в порядке убывания частоты ^6.

В недавней статье PLoS патогенов Коричневый и др., S.pneumoniae, было установлено, что способен транслокации через сердечной сосудистого эндотелия, вступления в myocardiuм, и формирование дискретных негнойный микроскопических повреждений (микроповреждениям), заполненных бактерий в желудочки во время инвазивной пневмококковой инфекции (IPD) ^7. Данные образования сердечной microlesion наблюдалось в сердечных пробах приматов и людей, которые умерли от пневмококковой инфекции. Кроме того, экспериментально инфицированных мышей воспроизводимо разработан сердца микроповреждениям. У мышей, размер microlesion и номер был положительно коррелирует с длительностью и тяжестью бактериемии, уровни сердечного тропонина в сыворотке и аномальным сердечной электрофизиологии. Бактериальной транслокации в сердце был обнаружен с помощью тех же механизмов, ответственных за транслокацию пневмококка через гематоэнцефалический барьер и развития пневмококковой менингита, то есть, холин-связывающий белок опосредованной инвазии эндотелиальных клеток сосудов в рецептора ламинина и тромбоцитов -activating рецептора фактора зависит способ ^8. Microlesформирование ионного также требуется пневмококковой порообразующий токсина пневмолизин, который был найден, чтобы убить кардиомиоцитов ^7.

Пневмококковые сердца микроповреждениям отличаются от гнойного мягких тканей и сердечной абсцессов, вызываемых другими грамположительных бактерий, включая золотистый стафилококк. Они характеризуются одним очагов бактерий в окружении нейтрофилов и осаждения фибрин ^9,10. Микроповреждениям формируется S. пневмонии меньше по размеру, распределенной по всей пораженной сердце, и не хватает инфильтраты иммунных клеток. На ранних стадиях инфекции, микроповреждениям, вызванного S. пневмонии появляются как области поврежденной или воспаленной ткани, напоминающей патологических признаков кардиомиопатии. Некоторые моноциты можно наблюдать в течение этого времени, однако их присутствие недолго и быстро стал поражения некротических по внешнему виду и заполнены бактерий, одновременно продолжая GRой по размеру до смерти животного или антимикробной вмешательства. Важно отметить, что в течение 3 дней вмешательства антибиотиков, обильное проникновение иммунных клеток наблюдается на месте бывшего поражения, и это сопровождается надежной отложения коллагена. Подобно сердечной ремоделирование, как сообщалось, происходит следующее миокарда наряду с длительностью последствий от сердечной функции ^11-15. Таким образом, микроповреждениям являются потенциальное объяснение для неблагоприятных сердечных событий, которые происходят во время ИПД и, возможно, увеличение случаев сердечной смертности, связанной в выздоравливающих людей, которые пережили эпизод заболевания.

При этом инструкция предусмотрен на экспериментальной модели мыши IPD и формирования повреждения сердца и визуализации сердца микроповреждениям на ранних и поздних стадиях инфекции. Протокол для обнаружения отложения коллагена у животных, которые были сохранены антибактериальной вмешательства продемонстрировали. Цель этой статьи заключается в Facilitate исследования других исследователей по этой важной и новой пневмококковой патологии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментах на мышах были рассмотрены и одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетов в университете Техаса Научного центра здоровья в Сан-Антонио (протокол # 13032-34-01C). Уход за животными и экспериментальные протоколы придерживались закона 89-544 общественной (Закон Animal Welfare) и поправок к нему, общественных принципов здравоохранение, а также руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Департамент здравоохранения и социальных служб).

1. Инфекция

1. Получить BALB / C мышей обоих полов в возрасте 10-12 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С. пневмонии серотипа 4 штамма TIGR4 является вирулентным клинический изолят, который был последовательность ^16.
2. растут TIGR4 в Тодд Хьюитт-бульоне при 37 ° С в 5% СО ₂ до достижения оптической плотности (OD) ₆₂₀ 0,5 (соответствует 1,0 х 10 ⁸ колониеобразующих единиц [КОЕ] / мл). Гранул пневмококковой культуры центрифугированием в течение 10 мин при 3, 500 мкг и удалить супернатант с помощью вакуумной линии. Приостановка и разбавленной бактерии стерильной фосфатно-солевом буфере (PBS) до конечной концентрации 1,0 х 10 ⁴ КОЕ / мл.
3. По индукции, камеру, обезболить мышей с 2,5% испарившегося ИФ в кислороде. Подтвердите наркозом состояние нежным ног крайнем случае с тупыми пинцетом.
   1. Проведение наркозом мыши, его загривок и в вертикальном положении с одной стороны, придать каждой мыши внутрибрюшинно (IP) с 100 мкл S. пневмонии суспензию с помощью шприца с иглой 27-30 (соответствующего вызова дозе 1,0 · 10 ³ КОЕ). Уложить мыши в клетке. Мыши, как правило, пробудить 30-40 сек после инъекции.
4. Разрешить инфекция протекать в течение, по крайней мере 24 (в начале), или 30 (Дополнительно) часов.
   1. Эвтаназии мышей CO ₂ удушья. Выполните шейки дислокации, чтобы обеспечить мышь, умер. Эвтаназия подтверждается еще и удалениясердца в стадии 1.6.
5. Лечить хвост с тампоном, смоченным спиртом и СНиП раздел 2-3 мм. Собирают 2 мкл крови и серийно разбавленной крови в 10 раз в PBS, содержащего гепарин натрий 1 Ед / мл пять раз. Пластинчатые серийные разведения на трипсином соевым агаром крови и инкубируют в течение ночи при 37 ° С в 5% СО _2. На следующий день экстраполировать подсчета колоний уровень бактериемии.
6. Зафиксировать мыши в положении лежа на спине на хирургическом платформы. Спрей груди с 70% этанола и высушите. Использование хирургические ножницы и щипцы открыть грудную полость, удалить грудную клетку, и секут диафрагму выставить сердце и легкие. С помощью ножниц вырезать кровеносные сосуды, подключенных к сердцу и слегка вырезать сердце с осторожностью, чтобы избежать синяков щипцами.
7. Промойте сердце с PBS, а затем поместить в ткани ЗАБОР кассет, таких, что корональные разделы будут получены в ходе ткани срезов. Для парафин, PLAн.э. кассеты в 10% -ном растворе в буфер формалина и на следующий день отправить на парафин.
   1. Кроме того Ледяная вспышка с помощью октября соединение в cryomold, который был помещен на сухом льду.

2. Визуализация поражения сердца и пневмококки в поражениями

1. Сократите парафиновые срезы сердца, такие, что 4 камеры сердца видны в каждой секции ткани. Сокращение слайдов при толщине 5 мкм.
2. Deparaffinize и пятен срезов гематоксилин и эозином (H & E), используя стандартные методы ^17.
3. Посмотреть H & E окрашенных сердца разделы с помощью светового микроскопа при низких (100X, 200X) и высокий (нефти погружения в воду: 400X, 1,000X) увеличениях. Определение характеристик сердца в присутствии микроповреждениям в миокарде. Здесь приобретают H & E изображения, используя Zeiss Axioskop 2 микроскопа, снабженного 100X 1,3 числовая апертура план-NEOFLUAR цели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На ранних стадиях сердечной лesions различаются по их внешнему виду окрашенных дифференциального и в некоторых случаях в присутствии иммунных клеток (моноцитов и гранулоцитов), что представляется моноциты. В продвинутой стадии заболевания, особенно такие, как в 30 часов, иммунные клетки отсутствуют и большие вакуолей, как поражения наблюдаются на своем месте. Важно отметить, что в то время как приток клеток иммунной на ранних стадиях развития повреждения сердца может происходить не по всей видимости, будет требование.

3. Иммунофлуоресцентного микроскопии для пневмококков в микроповреждениям

1. Раздел сердце в cryomolds с микротома до толщины 5 мкм секций и место на положительно заряженных стеклах. Разрешить замороженные сердца разделы таять и сухой воздух. Закрепить секции в течение 10 мин в 10% нейтральный буферный формалин (рН 6,8-7,2 при 25 ° С).
2. Промыть слайдов (3x) в PBS в течение 5 мин, проницаемыми в течение 15 мин в 0,2% Triton X-100 в PBS, затем промыть еще раз в PBS.
3. Блок тканей secti на слайдах на 10% козьей сывороткой в ​​PBS в течение 1 часа.
4. Промыть слайды с PBS, и инкубировали крышки сердечных секции с кроличьей анти-серотипа 4 пневмококка антисыворотки 1: 1000 в PBS с 10% козьей сывороткой в ​​течение 2 ч при 37 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для отрицательных контролей следователи должны использовать наивный кроличьей антисыворотки
5. После промывки PBS, и инкубировали крышки секции с 10% козьей сывороткой в ​​PBS-козы против кролика FITC конъюгированных антител в 1: 2000 в течение 30 мин при 37 ° С.
6. После инструкцией изготовителя, использовать DAPI (4 ', 6 диамидино-2-фенилиндол) в 5 мг / мл для визуализации эукариотических ядер. Вымойте и смонтировать разделы ткани с FluorSave.
7. Приобретать флуоресцентные изображения с помощью конфокальной системы микроскопа при низких, так и высоких увеличения. Регулировка числовую апертуру, соответственно, чтобы получить оптимальные результаты. Здесь, приобретать флуоресцентные изображения с помощью конфокальной системы с 60X 1,42 численного цели апертуры.

"> 4. Антибиотик Rescue септического мышей

1. Начните с мышей, инфицированных IP с 1,0 х 10 ³ КОЕ TIGR4 как указывалось ранее в шаге 1.
2. Начиная с 30 ч после инфекции, администрирование фармацевтического качества ампициллину IP (80 мг / кг массы тела) в 100 мкл физиологического раствора каждые 12 ч в течение 36 ч. Сбор сердца в нужной точке времени и процесс, как описано в стадии 1,6 для парафин и ткани, секционирования.

5. Коллаген осаждения обнаружения

1. Использование ксилол и градуированные моет спирта с деионизированной водой, deparaffinize и гидрата срезах ткани с помощью стандартных методов ^17. Treat секции с водным 0,2% фосфорно-молибденовой кислоты в течение 5 мин и промывают деионизированной водой в течение 5 мин.
2. Пятно секции с 0,1% Sirius Red в пикриновой кислоты в течение 2 ч при комнатной температуре.
3. Промыть секции в 0,01 Н хлористоводородной кислотой в течение 3 мин и промыть с использованием 70% этанола в течение 1 мин.
4. Dehydraт.е секции с помощью идентичной, но в обратном порядке стирок в том, что изложенные в 5,1, обезвоживают сердечных секции в увеличении и переменной концентрации этанола, то ксилол.
5. Гора ткани участки с решение для монтажа микроскопическом исследовании.
6. Для идентификации областей отложения коллагена, изучить окрашенные срезы ткани для районов глубокого окрашивания читать под низким и высоким увеличением с помощью светового микроскопа. Любой район, в желудочках сердца, которое есть красный область, где коллаген был сдан на хранение. Области без этого красного пятна сайты здоровой ткани, лишенные отложение коллагена. При этом приобрести Picro Сириус Красные окрашенные изображения с помощью микроскопа, снабженного 20X 0,5 численного цели апертуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: атриуме пятна красные в здоровых тканях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Визуализация микроповреждениям Н & Е

Сердечные микроповреждениям наблюдались в желудочках H & E окрашенных сердечной секции из мышей с IPD следующие их ИС вызов с TIGR4. Рисунок 1 демонстрирует увеличение размера этих поражений между 24 и 30 ч после инфекции (?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом докладе, высоко воспроизводимым методом, чтобы вызвать С. пневмонии -опосредованной сердца микроповреждениям у мышей при ИПД и методы их визуализации демонстрируется. Мыши заражены дозы бактерий, который превосходит порог иммунной системы для оформления, что приводит к вы?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum	Statens Serum Institut	16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
phosphomolybdic acid 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0.01 N hydrochloric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscope Slides	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	unspeciified		Standard