Method Article
An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Glicopolímeros sintéticos son herramientas instrumentales y versátiles usados en varios campos de investigación bioquímica y biomédica. Un ejemplo de una síntesis fácil y eficiente de glicopolímeros estadísticos fluorescentes bien controlados utilizando adición-fragmentación de transferencia de cadena reversible (RAFT) polimerización basado se demuestra. La síntesis comienza con la preparación de metacrilamida glycomonomer 2-lactobionamidoethyl que contiene β-galactosa obtenido por reacción de lactobionolactona y N - (2-aminoetil) metacrilamida (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metacrilamida (Gaema) se utiliza como un análogo estructural que carece de una β-galactósido terminal. La siguiente reacción de copolimerización de RAFT mediada implica tres monómeros diferentes: N - (2-hidroxietil) acrilamida como espaciador, AEMA como objetivo para su posterior etiquetado de fluorescencia, y los glycomonomers. Tolerante de sistemas acuosos, el agente de RAFT usado en la reacción es (ácido 4-cianopentanoico) -4-ditiobenzoato.Se observaron dispersities Bajos (≤1.32), composiciones de copolímero predecibles, y una alta reproducibilidad de las polimerizaciones entre los productos. Polímeros fluorescentes se obtienen mediante la modificación de los glicopolímeros con carboxifluoresceína succinimidil éster dirigidos a los grupos funcionales de amina primaria en AEMA. Especificidades de unión a lectina de los glicopolímeros resultantes se verificaron mediante pruebas con perlas de agarosa correspondientes recubiertas con lectinas glycoepitope reconocer específicos. Debido a la facilidad de la síntesis, el control estricto de las composiciones de productos y la buena reproducibilidad de la reacción, este protocolo se pueden traducir hacia preparación de otros glicopolímeros a base de balsa con estructuras y composiciones específicas, según se desee.
En las últimas dos décadas, las investigaciones con glicopolímeros sintéticos han experimentado un desarrollo lento pero continuo, lo que demuestra un potencial significativo en el examen de los mecanismos infecciosos que incluyen la investigación que se centra en el reconocimiento de lectina procesa 1-3. Desde glicopolímeros sintéticos que poseen restos de azúcar multivalentes presentan eficacias de unión a lectina mucho más altos, en comparación con los hidratos de carbono monovalentes, son de gran demanda en el campo de la glicobiología 3. De particular interés en la investigación clínica es el uso de glicopolímeros fluorescentes para caracterizar la unión con hidratos de carbono disponibles en las superficies celulares respiratorios humanos y glicoproteína mucosa bacteriana lectina mediada. Temprano en estudios in vitro empleado glicopolímeros basado en poliacrilamida disponibles comercialmente en las pruebas de unión bacterianas. Varias de estas sondas mostraron resultados prometedores, pero expresaron su preocupación respecto, varianzas fácil obtención, y muchos-a-muchos, tanto en polYmer peso molecular y contenido glycoepitope. Un protocolo económica en el laboratorio fue desarrollado que proporcionaría un control satisfactorio de contenido de la estructura, el tamaño, y la pureza de glicopolímeros sintéticos dirigidos lectinas bacterianas.
En búsqueda de un enfoque sintético adecuado para glicopolímeros, una técnica relativamente nueva polimerización fue probada usando un tipo de polimerización radical controlada que emplea adición-fragmentación de transferencia de cadena reversible (RAFT) agentes 4. Tales reactivos BALSA Recientemente se han utilizado en algunas preparaciones glycopolymer 5-7. En comparación con otros protocolos de preparación glycopolymer, polimerizaciones RAFT mediada demuestran varias ventajas, incluyendo la tolerancia a una variedad de estructuras de monómeros y condiciones de reacción, el potencial de compatibilidad con las soluciones acuosas, y baja dispersidad tamaño de los productos poliméricos deseados 8,9. De notable interés son protocolos para la preparación de BALSA-baSED-tri componente glicopolímeros, permitiendo el control de las composiciones de monómeros diferentes, cada uno de los cuales pueden tener funciones distintas 10-13. Sin embargo, la mayoría de los esfuerzos de investigación anteriores o bien carecían de hidratos de carbono anoméricos colgante 10, o emplear intensificaron polimerizaciones resultantes en copolímeros de tri-bloque, que consisten en homopolímeros unidos covalentemente, que a menudo sirven para diferentes propósitos que los polímeros estadísticos que son copolímeros en los que la secuencia de monómero residuos siguen una regla estadística 9-13.
Recientemente, empleando el compuesto de RAFT tiocarboniltio (ácido 4-cianopentanoico) -4-ditiobenzoato en un entorno acuoso, la preparación de un grupo de balsa basa glicopolímeros estadísticos tri-componente lineales que contienen azúcares colgantes específicas y su aplicación en la lectina de unión mediada bacteriana pruebas se informó 14. El objetivo general de este método, presentado de una manera visual, es preparar a los tri-componenteglicopolímeros fluorescentes estadísticos a través de copolimerización controlada por balsa. Debido a la facilidad del protocolo de polimerización de un solo paso, el control fino sobre la longitud del polímero y composiciones, y la alta reproducibilidad de la reacción, este protocolo puede aplicarse fácilmente a otras síntesis basado en la balsa de glicopolímeros con estructuras deseadas.
1. Síntesis de Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl metacrilamida
2. Síntesis de monómero 2-Gluconamidoethyl metacrilamida
Nota: La preparación de metacrilamida 2-gluconamidoethyl (Gaema), que no posee un azúcar colgante, es una adaptación de un método publicado 15.
3. BALSA Glycopolymer Síntesis
Nota: La estadística resultante poli-metacrilamida / acrilamida (PMA) copolímeros que contienen colgante 4- O -β-D-galactopiranosil-D-gluconamida (lactobionamida) (de la Etapa 3.2) o D-gluconamida (del Paso 3.3), respectivamente, son obtenido. Por conveniencia de la discusión, estos dos glicopolímeros se abrevian como PMA-LAEMA y PMA-Gaema, respectivamente.
4. Post-modificación de glicopolímeros con fluoróforos
Nota: Después de la liofilización, glicopolímeros fluorescentes PMA-LAEMA-fluoresceína y PMA-Gaema-fluoresceína, respectivamente, se obtienen.
5. Caracterización de la Glycopolímeros
6. Los ensayos de unión de los glicopolímeros sintéticos con lectina-revestidos perlas de agarosa
Síntesis de glycomonomer
Ácido lactobiónico se usa en este documento como un ejemplo para la preparación de glycomonomers. El uso de métodos en el informe inicial sobre la síntesis de LAEMA 11, se observaron diversas rendimientos en la preparación con la pureza insatisfactoria. El método de purificación modificado usando resinas de intercambio catiónico y aniónico para eliminar el material de partida sin reaccionar ofrecido rendimiento de producto estable y de alta pureza, que se confirma por 1 H y 13 C RMN espectroscopia (Figura 1).
BALSA síntesis glycopolymer y después de la modificación de glicopolímeros con fluoróforos
En contraste con los bloques-glicopolímeros preparados a través de polimerizaciones RAFT escalonadas, este protocolo copolimerización de un solo paso proporciona una distribución uniforme en todo el glycomonomer cadena principal del polímero. Los glicopolímeros muestran aquí contienen 20% en moles de glycomonomer, 77% en moles de HEAA como un espaciador, y 3% en moles de AEMA como un objetivo para la post-modificaciones (véase la Figura 2). 1 H y 13 C-espectroscopía de RMN confirman las estructuras de PMA-LAEMA y PMA-Gaema (Figuras 3 y 4). Como se muestra en la Figura 5, cuando representa frente a los perfiles de elución de GPC de la glycopolymer sintetizado sin balsa, tanto PMA-LAEMA y PMA-Gaema tienen dispersities bajas, lo que demuestra la eficacia del enfoque de balsa. Como era de esperar, PMA-Gaema tiene un M n menor que el de PMA-LAEMA debido a la falta de un azúcar colgante de PMA-Gaema. Análisis de los hidratos de carbono y grupos funcionales de amina primaria contenido de los glicopolímeros RAFT reveló que la relación de monómeros en los glicopolímeros de productos es coherente con la relación estequiométrica de los monómeros de partida empleados en la reacción de polimerización de RAFT mediada (Tabla 1). Esto significa un control estricto de la compositio monómerons en los glicopolímeros sintetizados, tal como fue diseñado.
Reacción de los grupos funcionales amina primaria con fluoróforos activados es una técnica ampliamente utilizada en el etiquetado de proteínas. Esta técnica se emplea aquí para etiquetar glicopolímeros purificadas con carboxifluoresceína. Después de post-modificación, se obtuvieron polímeros fluorescentes (Figura 6). No hay degradación de los polímeros marcados con fluoresceína en la reacción se detectó por análisis GPC (datos no mostrados).
La unión de las pruebas glicopolímeros sintéticos con perlas de agarosa lectina recubierto
Para evaluar la especificidad de unión de lectina de las glicopolímeros sintetizados, se utilizaron perlas de agarosa-lectina recubierto con especificidad de unión a carbohidratos conocida. Lectina Erythrina crista-galli (ECL), empleado en los experimentos, tiene una especificidad de unión hacia β-D-galactósido. Figura 7A demuestra claramente que PMA-LAEMA-Fluoresceína, que contiene β-D-galactósido como un carbohidrato colgante, exhibió fuerte unión con la lectina ECL. En contraste, la unión a la ECL de la glycopolymer PMA-Gaema-fluoresceína, que no posee un azúcar colgante negativa, se muestra en la Figura 7B. Este resultado ejemplifica la eficacia de unión y afinidad de la glycopolymer fluorescente sintetizada.
Figura 1. Asignado 1 H- (a) y 13 C-RMN (b) los espectros (D 2 O) para LAEMA. (Esta cifra se ha modificado de Wang et al. 14) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ilustración esquemática de la síntesis de glycopolymer fluorescente PMA-LAEMA contiene β-galactosidasa como azúcar colgante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Asignado 1 H- (A) y 13 C-RMN (B) espectros (D 2 O) para glycopolymer PMA-LAEMA. (Esta cifra se ha modificado de Wang et al. 14) SúplicaSe Haz clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Asignado 1 H- (A) y 13 C-RMN (B) espectros (D 2 O) para el PMA-Gaema. (Esta cifra se ha modificado de Wang et al. 14) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 5. Gel rastros de cromatografía de permeación de sede en BALSA PMA-Gaema y PMA-LAEMA preparan con y sin utilizar agente BALSA. En contraste con el PMA-LAEMA preparado sin BALSA agente (azul), RAFT- PMA-LAEMA basado (verde) tiene una dispersidad mucho menor (M w / M n). Basado en BALSA PMA-Gaema (rojo) y PMA-LAEMA tener perfiles GPC similares, pero el primero tiene un M más pequeño n debido a la ausencia de azúcares colgantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. PMA-LAEMA antes y después del post-modificación con fluoróforo. (A) En comparación con el blanco no marcado glycopolymer (tubo de la izquierda), marcado con fluoresceína PMA-LAEMA muestra un color amarillo fuerte (tubo de la derecha). (B) Bajo los rayos UV, no marcado PMA-LAEMA (tubo izquierdo, 1 mg / ml en PBS) es oscuro y presenta sin fluorescencia, mientras PMA-LAEMA-fluoresceína marcado (trompa derecha, 1 mg / ml en PBS) espectáculos fuerte fluorescencia verde.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Erythrina crista-galli lectina (ECL) perlas de agarosa recubiertas unen-D-galactosidasa β contiene glicopolímeros, y no aquellos que no posean un azúcar colgante. (A) PMA-LAEMA-fluoresceína (3 mg) demostraron unión fuerte con ECL , mientras que en (B) PMA-Gaema-fluoresceína, que posee ningún residuo colgante de β-D-galactósido, no mostró unión con las perlas recubiertas de lectina. Barra de escala = 100 micras.
Tabla 1. Valores dirigidas a un de los parámetros de síntesis y composiciones reales de los glicopolímeros. A) los valores de orientación, valores queestán deseada de los productos; b) DP, el grado de polimerización; c) NA, no está disponible. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
DP b | Dispersidad | Contenido real de glycomonomers mol% | Contenido real de amina primaria mol% | |
Los valores de orientación | 100 | <1.3 | 20 | 3 |
PMA-LAEMA | 99 | 1.26 | 19 | 3.2 |
PMA-GAEMA | 89 | 1.32 | NA c | 2.7 |
Un protocolo de fácil y eficiente para glicopolímeros fluorescentes tri-componente basado en balsa, con y sin un carbohidrato colgante, y su uso en un ensayo de unión a lectina, se demuestra en este informe. El protocolo comienza con la preparación de glycomonomers LAEMA y Gaema. A través de una copolimerización balsa controlada de un solo paso, glicopolímeros con rendimiento reproducible, composición de monómeros predecible y baja dispersidad, se obtienen. Después de post-modificación de glicopolímeros con carboxifluoresceína succinimidil éster, la unión de la respectiva glycopolymer marcado fluorescente resultante es fácilmente comprobable por su especificidad de unión de lectina.
En los pasos de preparación iniciales de los glycomonomers que se van a emplear en la síntesis glycopolymer posteriores, se utilizaron ácido lactobiónico fácilmente disponibles y gluconolactona. En teoría, los hidratos de carbono de interés, de monosacáridos a oligosacáridos complejos, pueden ser converted para glycomonomers conjugando el azúcar blanco en el grupo hidroxilo primario en C6 de la glucosa. Después de la oxidación del residuo de glucosa reductor, y su posterior deshidratación de una lactona, el producto puede entonces hacerse reaccionar con la amina primaria en AEMA para formar el correspondiente glycomonomer fácilmente. Otros ejemplos de esta ruta se pueden ver en un informe reciente 14. Cabe señalar que antes de iniciar cualquier etapa de polimerización, MEHQ, un potente inhibidor de la polimerización, se debe quitar de todas las preparaciones de monómero y glycomonomer justo antes del uso. Esto se consigue fácilmente mediante el uso de la cantidad mínima de metanol para disolver el glycomonomer que posee MEHQ después tratar inmediatamente con acetona a -20 ° C para precipitar el producto libre de inhibidores con alto rendimiento.
Imprescindible en cualquier esquema de polimerización de radicales, se hizo hincapié en la atención al detalle y monómero purezas. Como es típico de un sistema de polimerización balsa, que consiste enuna fuente de radicales, un reactivo de balsa, un monómero y disolvente. En esta presentación visualizado, un sistema de polimerización de RAFT de un solo paso se describe que se centra en la producción de copolímeros estadísticos generados a partir de una mezcla de reacción que posee tres monómeros diferentes en una solución acuosa. Dos reacciones RAFT mediada separados se presentan en la que uno utiliza un glycomonomer que posee un colgante, no reductor terminal de hidratos de carbono (es decir, β-D-galactosa), y el otro, que posee un poliol con ningún residuo de hidratos de carbono enlazado. Común a ambas reacciones RAFT mediada eran monómeros que poseen un grupo hidroxilo singular que sirve como una molécula espaciadora, y otro que posee una amina libre para la post-modificación con un fluoróforo-amino reactiva.
Dado que la presencia de oxígeno en la mezcla de reacción y el medio ambiente es perjudicial para la polimerización mediada BALSA, su retirada de rastrear los niveles se realiza fácilmente a través de varias de congelación-evaciclos cuate-descongelación mientras se mantiene el recipiente de reacción tubo Schlenk bajo alto vacío.
Cabe señalar que la relación molar de monómeros diferentes en la reacción se puede ajustar según sea necesario. También, mediante la variación de la cantidad de agente de RAFT utilizado, la longitud de los polímeros resultantes se puede controlar 18. Sin embargo, la relación molar del agente de RAFT a iniciador debe ser siempre mayor que dos para asegurar la baja dispersidad del producto. En estas condiciones, la evolución de la copolimerización es constante, y la reproducibilidad de la reacción es muy alta. Dicho esto, es poco probable que se obtiene una distribución totalmente uniforme de todos los monómeros que participan dentro de un copolímero estadístico, debido a sus diferentes velocidades de polimerización. Caracterización de la distribución de los diferentes monómeros en el polímero es todavía muy difícil.
El método posterior a la modificación, que aquí se presenta, es a la vez simple y más amenable para el uso de una selección más amplia de marcadores fluorescentes, en comparación con otros protocolos aplicados a glicopolímeros etiqueta 2,11. Estos incluyen muchos de los fluoróforos de amina reactiva solubles en agua, los puntos cuánticos, biotinas, y otros. Las especificidades de unión de los sintetizados, glicopolímeros marcados son fácilmente verificable utilizando lectinas con afinidades de unión conocidos. PMA-Gaema poseer sin azúcar colgante es un control negativo apropiado. Glicopolímeros con diferentes etiquetas fluorescentes preparados a través de esta ruta se han utilizado con éxito en las investigaciones de lectina mediada por la unión bacteriana 14. Tal como se presenta, esta preparación fácil y eficiente de glicopolímeros fluorescentes estadísticos debe proporcionar un gran potencial para una amplia variedad de investigaciones glycobiological.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratories | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 ml | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Bruker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80 °C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoThis article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados