La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

Resumen

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Resumen

Uno de los procesos cardinales de la inflamación es la infiltración de células inmunes desde el lumen del vaso sanguíneo en el tejido circundante. Esto ocurre cuando las células endoteliales, que revisten los vasos sanguíneos, se convierten adhesivo a células inmunes circulantes tales como monocitos. In vitro medición de este adhesividad ha sido hasta ahora hecho mediante la cuantificación de la cantidad total de los monocitos que se adhieren a una capa endotelial ya sea como un recuento directo o por medición indirecta de la fluorescencia de los monocitos adherentes. Aunque tales medidas hacen indicar la adhesividad media de la población de células endoteliales, que son confundidos por una serie de factores, como el número de células, y no revelan la proporción de células endoteliales que son realmente adhesivo. Aquí describimos y demostrar un método que permite la enumeración de las células adhesivas dentro de una población probado de monocapa endotelial. Las células endoteliales se cultivan en cubreobjetos de vidrio y siguientes deseadastratamiento son desafiados con monocitos (que pueden ser etiquetados con fluorescencia). Después de la incubación, un procedimiento de enjuague, que implica múltiples rondas de inmersión y de drenaje, las células se fijan. Células endoteliales adhesivas, que están rodeados por los monocitos son fácilmente identificados y enumerados, dando un índice de adhesión que revela la proporción real de células endoteliales dentro de la población que son adhesivo.

Introducción

La infiltración de células inmunes tales como monocitos a través de la capa de células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos es un paso importante en el proceso de inflamación ^1. Esto permite que el homing de las células inmunes (inmunocitos) a un sitio de la lesión. En otros casos y ubicaciones tales como la arteria coronaria y la arteria carótida, la infiltración de monocitos a través de la capa endotelial puede conducir a la indeseable residencia a largo plazo de estas células en la pared de la arteria, que puede conducir a la formación de placas ^2. En todos los casos de infiltración de inmunocitos, el primer paso implica la activación de las células endoteliales en una región localizada del vaso sanguíneo. Las células endoteliales se activan por las citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α e IL-6 para aumentar la expresión de proteínas de superficie celular tales como VCAM, ICAM y E-selectina que facilitan el reclutamiento y la fijación de los inmunocitos sobre la superficie de las células endoteliales ^{3- 6.}

Inicialmente, la medición de la adhesión de células endoteliales se llevó a cabo mediante el recuento de monocitos que se adhirieron a la monocapa endotelial ^7. Las limitaciones de este método en términos de precisión llevado a la utilización de linfocitos radio-marcado o monocitos, seguido por cuantificación de material radiactivo que corresponde a los linfocitos o monocitos adhesión ^4. Este método fue eventualmente reemplazado por un método basado en la fluorescencia, lo cual inmunocitos de interés se marcaron con colorante fluorescente y se sometieron al mismo procedimiento que el anterior con la diferencia de que en lugar de fluorescencia de la radiactividad se mide ^8. Actualmente este método se ha convertido en la más conveniente y se vende en forma de kit por varios proveedores comerciales. Mientras que este ensayo puede medir los niveles relativos de adhesividad entre los controles y las muestras experimentales, que no revela si un cambio en la fluorescencia es debido a un cambio uniforme en adhesividad a través de todo el correopoblación de células ndothelial o si el cambio es debido a una diferencia de adhesividad dentro de una sub-población de células. También es evidente que la rigurosidad de lavado ejerce un profundo efecto en el resultado, y más importante, la uniformidad de enjuagar monocitos no unidos entre diferentes monocapas de células endoteliales será de gran impacto en la cercanía de los resultados de repeticiones y la reproducibilidad de los resultados entre las muestras . Más recientemente, se han utilizado varios sistemas que bombean los monocitos en los medios de comunicación a través de una monocapa de células endoteliales para abordar este problema ^9. Además, estos sistemas de flujo también recapitulan el efecto de la fuerza de cizallamiento sobre las células endoteliales. Mientras que las ventajas de tales sistemas son claros y muy atractivo, también es importante darse cuenta de que mientras que la adhesividad de las células endoteliales puede ser enormemente aumentada, como es el caso en la inflamación aguda, por factores tales como TNFa, algunos otros activadores, tales como la radiación ionizante ¹⁰ elicit cambia tsombrero no se detectan fácilmente dentro de marcos de tiempo in vitro por estos sistemas experimentales muy estrictas. Mientras que tales cambios minutos de la adhesividad de las células endoteliales son fácilmente perdidas o despedidos in vitro, no es necesariamente benigna in vivo, donde tales cambios pequeños dentro de un tiempo de vida, que es característica de la inflamación crónica, pueden ejercer resultados muy significativos. Por lo tanto un método robusto, pero sensible y específica para detectar y medir es necesaria adhesividad de las células endoteliales.

Aquí, se presenta un método para medir la adherencia de las células endoteliales directamente. Este método no se basa en la medición de fluorescencia como un indicador sustituto indirecta de la adhesividad de las células endoteliales. Revela si los cambios en la adherencia se deben a un cambio uniforme en todas las células o confinado a una subpoblación. Además, permite co-tinción de las células endoteliales con marcadores tales como beta-galactosidasa asociada a la senescencia, mar viabilidad celularker, calcien AM y anticuerpos contra la superficie celular y las proteínas intracelulares, lo que permite la asociación de las células endoteliales adhesivas individuales para ciertos estados celulares o expresión de proteínas específicas.

Protocolo

1. Preparación de cubreobjetos de vidrio

1. Esterilizar 12 mm de diámetro ronda cubreobjetos de vidrio por inmersión en etanol al 70% durante al menos 10 min con agitación ocasional para asegurar una exposición total de todos los cubreobjetos a la de etanol. Verter cubreobjetos de vidrio y el etanol en una placa de cultivo celular estéril (ya sea 6 cm o 10 cm de diámetro).
2. Con un par de finas 5B pinzas estériles, recoger y colocar cada cubreobjetos individuo en un pocillo de una placa de racimo 24. Tener cuidado para asegurar que los cubreobjetos no tocan las paredes del pozo y son aproximadamente en el centro del pozo.
3. Deje la placa de clúster no-cubierta 24 con cubreobjetos de vidrio a secar en la campana de flujo. Esto tarda unos 10 min
4. Durante este período, preparar la mezcla de revestimiento diluyendo 10 mg / ml de fibronectina humana en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 0,1 mg / ml.
5. Cuando los cubreobjetos son secos, pipeta 100 l de solución de recubrimiento sobre cada co vidrioverslip lo que la solución cubre sólo el vidrio sin la puesta en común alrededor del exterior del pozo. Coloque la placa de 24 pocillos clúster cubierto en una incubadora de cultivo celular durante al menos una hora.
6. Justo antes de su uso, retire la solución de revestimiento. La misma solución de recubrimiento puede ser transferida a un tubo estéril y se utilizó hasta tres veces sin pérdida visible de eficacia.

2. Preparación de monocapa de células endoteliales

1. Cultura células endoteliales coronarias humanas de la arteria (CE) en medio a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5%.
2. Aspirar fuera medios de cultivo y enjuague monocapa CE con 10 ml de HBSS
3. Aspirar HBSS y añadir 2 ml de 0,5% de tripsina, EDTA 0,2%. Incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min.
4. Cuando CE puede ser desalojado por un grifo para el lado del matraz, añadir 5 ml de inhibidor de tripsina de soja y con pipeta chorree la superficie del matraz para desalojar aún más las células.
5. La transferencia de células en un tubo de 15 ml y centrifugar el tuboa 200 xg durante 5 min.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet CE en 5 ml de medios de comunicación. Contar las células con un hemocitómetro y ajustar la concentración de células a 50.000 CE por ml de medios de comunicación CE.
7. Dispensar 1 ml de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de 24 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio recubiertos. Se incuban las células O / N en cultivo celular incubadora a 37 ° C, más dióxido de carbono al 5%.
8. Las células están listas para su uso en experimentos cuando se forma una monocapa confluente, dentro de 3 días.

3. Preparación de los monocitos

1. Transferencia HL-60 células que son cultivadas en RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal, como cultivo en suspensión, en un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min.
2. Retire las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio y ajustar la concentración de células con medios de comunicación a 2 millones de células / ml. Si se desea etiquetado de fluorescencia de la HL-60, resuspender las células en RPMI sin suero y proceed como se describe en la sección 4.
3. Añadir 0,5 ml de HL-60 suspensión de células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos clúster que contiene monocapa CE y se incuba la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5% durante un período fijo de tiempo elegido entre 1 y 3 hora Se observa poca diferencia entre 1 hora y 3 horas de duración punto, donde se alcanza la saturación vinculante.
4. Prepárese para celular lavado / recolección: Llenar un tubo de 120 ml con 100 ml de HBSS. Dispensar 1 ml de formalina en cada pocillo de una placa de 24 fresco.
5. Después del período de incubación, utilice un par de pinzas afiladas y recoger el cubreobjetos del pozo y mantenga el cubreobjetos vertical y aplique el borde del cubreobjetos en un pedazo de tejido en el banquillo durante 3 segundos, teniendo cuidado de no tocar el superficie de la célula cubierta del cubreobjetos con el tejido.
6. Sosteniendo firmemente el cubreobjetos con un par de pinzas, clavada en el cubreobjetos y fuera de los HBSS cinco veces.
7. Después de la quinta volcadaen HBSS, aplique el borde del cubreobjetos sobre el tejido durante 3 s.
8. Repita los procedimientos dunking y secándose descritos en 3.6 y 3.7, lo que hace un total de tres series de 5 mates seguidos de un lenguado.
9. Transferir el cubreobjetos en un pozo que contiene 10% de formalina para fijar las células a TA. El cubreobjetos está listo para la enumeración, para el almacenamiento a largo plazo o ser sometido a otros procedimientos descritos a continuación.

4. Etiquetado de HL-60 células con Rastreador Móvil (opcional)

1. Contar y transferir cantidad apropiada de células HL-60 (por ejemplo, 10 millones) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las células HL-60 a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
2. Resuspender el sedimento celular en Rastreador Celular en medios RPMI sin suero a una concentración de 1 millón de células / ml. Se incuban las células en cultivo celular incubadora durante 1 hr.
3. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en medios a una concentración de 2 millones de canas / ml.
4. Añadir 0,5 ml de la etiqueta-Tracker celular HL-60 en cada pocillo que contiene células endoteliales cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Continuar en el 3,3.

5. enumeración de células endoteliales Adhesive

1. Monte cubreobjetos en portaobjetos con DAPI contra-tinción para identificar células individuales.
2. Utilizando un microscopio invertido con un objetivo 4X o 10X, adquirir imágenes de varios campos (por ejemplo, 5 campos) y contar el mayor número de monocitos que se agregan en las células endoteliales un-irradiado (Esto normalmente debería ser 3-5).
3. Establecer dos veces este número como el umbral de monocitos en una célula endotelial que se define como que un clúster. Si es necesario, un criterio diferente se puede utilizar para definir un clúster dependiendo de la naturaleza del experimento.
4. Cuente el número de grupos y el número de células endoteliales en el campo. Dividir la primera por la segunda para obtener el porcentaje de células endoteliales adhesivas. Puntuaciónnumerosos campos para obtener un promedio y desviación estándar de los condes.

6. contratinción con anticuerpos

1. Después de que el ensayo de adhesión y las células en el cubreobjetos se han fijado en formalina al 10% durante 15 min a RT, someter los cubreobjetos a inmunofluorescencia utilizando un procedimiento estándar ¹⁰ y anticuerpos de elección.
2. Añadir y eliminar las diversas soluciones muy suavemente para evitar que se desprenda monocitos que se unen a las células endoteliales.

7. Counterstaining de senescencia asociada a beta-galactosidasa actividad

1. Después del ensayo de adhesión y las células en el cubreobjetos se han fijado en formalina durante 15 minutos, la mancha para la actividad beta-galactosidasa senescencia asociada como se describe en las instrucciones que acompañan el kit de tinción. Añadir y eliminar las diversas soluciones muy suavemente para evitar que se desprenda monocitos que se unen a las células endoteliales.

Resultados

Este método permite la detección de células endoteliales adhesivas individuales dentro de una población. Por ejemplo, mientras que una monocapa de células endoteliales un-irradiado retuvo unos esporádicos HL-60 monocitos después de la incubación y el lavado, monocapa endotelial a los 7 días posteriores a 10 Gy de irradiación antes de la incubación con monocitos fueron obligados por los monocitos en grupos alrededor de las células endoteliales individuales ( Figura 1). Aunque este fenómeno es fácilmente observable bajo microscopía de contraste de fase, microscopía de fluorescencia revela una imagen aún más clara de los racimos de monocitos.

Después de realizar el ensayo de adhesión descrito, es posible proceder a la tinción de las células para la membrana, citoplasma o nuclear (Figura 2) las proteínas usando anticuerpos apropiados con métodos de inmunofluorescencia estándar. Además, el ensayo a base de enzimas tales como beta-galactosidasa asociada a la senescencia (Figura 3) también puede ser performed.

Dado que cada grupo de monocitos corresponde a una célula endotelial individual, la enumeración de los grupos revelará el número real de células endoteliales de adhesivo dentro de la monocapa (Figura 4), ​​y por lo tanto el porcentaje de células endoteliales de adhesivo dentro de la población (Tabla 1, Figura 6) . Este es el único método que permite que hasta la fecha tal cuantificación de la adhesividad de las células endoteliales. Es de destacar que las células endoteliales utilizadas en los experimentos aquí son el contacto inhibido y no aumentan en número después de alcanzar la confluencia. Esto elimina la complejidad potencial planteado por el aumento del número de células endoteliales en momentos posteriores. Si se desea, los monocitos unidos a monocapas endoteliales pueden ser desalojados por la solución de tripsina-EDTA 0,2% 0,5% (en lugar de la fijación en 3.9) y su fluorescencia miden usando un lector de placas, como es el caso en métodos contemporáneos (Figura 5).

Figura 1. La adhesión de los monocitos en monocapa de células endoteliales. En las células endoteliales un-irradiado, los monocitos se adhirieron como células individuales en una manera esporádica y aleatoria (paneles de la izquierda) y en grupos en las células endoteliales individuales de los 7 días post-10 Gy irradiados monocapa (paneles de la derecha). Paneles inferiores son imágenes de fluorescencia de los paneles superiores, lo que confirma que las células esféricas pequeñas y brillantes visibles bajo contraste de fase son de hecho los monocitos que fueron pre-etiquetados con Cell-Tracker Verde. Algunos de los racimos de monocitos se indican mediante flechas blancas. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 10X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Tinción de las células endoteliales para el ensayo de proteínas post-adhesión. Después de realizar el ensayo de adhesión descrito, las células en los cubreobjetos de vidrio se sometieron a inmunofluorescencia para la detección de (A) proteína de la membrana (CD44), b) proteína citoplasmática (tubulina) o c) la proteína nuclear (γ-H2AX). Paneles de la izquierda de (A) y (B) (visto con objetivo 20X) muestran monocitos pre-etiquetados con Cell Rastreador verde y la imagen similar sobre los paneles de la derecha muestran CD44 y los microtúbulos (rojo) y los núcleos teñidos con DAPI (azul). Flechas blancas en (C) Punto de núcleos de células endoteliales irradiados que se tiñeron con anticuerpos contra γ-H2AX. Núcleos de monocitos que se tiñe de un azul más brillante por DAPI se distinguen fácilmente de los núcleos de forma ovalada de las células endoteliales. Las imágenes fueron tomadas con el objetivo 20X. jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. asociada a la senescencia tinción beta-galactosidasa de las células endoteliales. Después de ensayo de adhesión, las células en cubreobjetos fueron sometidos a tinción para beta-galactosidasa asociada a la senescencia que hace que los lisosomas de las células senescentes para vuelven azules, como es evidente en la célula endotelial que se une selectivamente por numerosos monocitos, que son fácilmente identificados debido a su pequeño tamaño y la forma esférica. Imagen vista a través objetivo 20X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Enumeración de racimos de monocitos en las células endoteliales individuales. Después de ensayo de adhesión, las imágenes de las células fueron tomadas de varias posiciones diferentes y racimos de monocitos identificados y rodeó (en verde). Un grupo se definió como una aglomeración de 10 o más monocitos en una célula endotelial. Se contó el número de grupos de monocitos y número de células endoteliales 12 días post-irradiados (punteada en rojo) en la imagen y el porcentaje de células endoteliales adherentes calculados como se muestra en la Tabla 1. Imagen tomada a través objetivo de 10X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 5. La cuantificación de la fluorescencia de los monocitos adherentes. Siguiendo adhe Sion ensayo, las células en cubreobjetos de vidrio se tripsinizaron y la fluorescencia de los monocitos pre-marcado con verde CellTracker se midió, usando un lector de placas de fluorescencia, como un indicador indirecto de la adhesividad de la monocapa endotelial. Los resultados de estas mediciones en días indicados después de la irradiación se obtuvieron y entretejieron en el gráfico anterior.

Figura 6. Representación de las puntuaciones de ensayo de adhesión de la Tabla 1. Las células endoteliales adhesivas en cinco lugares diferentes en tres cubreobjetos de vidrio se puntuaron como se describe en la Figura 4 y los resultados tabulados anteriormente que demuestra que 12 días después de 10 Gy de irradiación, de 8 a 10 por ciento de irradiado células endoteliales se convirtieron adhesivo.

Porcentaje de adhesivo
células endoteliales

	Disco 1	Disco 2	Disco 3
Campo 1	8.65	8.29	8.21
Campo 2	10.44	7.27	7.21
El campo 3	9.63	9.05	8.33
El campo 4	11.11	7.09	8.41
Campo 5	10.55	9.4	11.61
Promedio	10.07	8.22	8.75

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Tabla 1. Adherencia puntajes de ensayo. Células endoteliales adhesivas en cinco lugares diferentes en tres cubreobjetos de vidrio se calificaron como se describe en Figura 4 y los resultados tabulados anteriormente que demuestra que 12 días después de 10 Gy de irradiación, de 8 a 10 por ciento de las células endoteliales irradiados se convirtió en adhesivo.

Discusión

El ensayo de adhesión de monocitos descrito anteriormente fue utilizado con éxito en experimentos diseñados para estudiar los efectos biológicos de las radiaciones ionizantes en monocapas endoteliales ^10. Aunque este no es el único método disponible para evaluar la adhesividad de una monocapa endotelial, que es el único método que permite la cuantificación de la proporción o porcentaje de células endoteliales dentro de una monocapa que es adhesivo. Esta es una distinción importante como un cambio cuantitativo global en la adhesión de los monocitos, tal como se mide por otros métodos pueden atribuirse o bien a un aumento general de la adhesividad de todas las células de la monocapa endotelial o al aumento de la adhesividad de una sub-población de células endoteliales dentro de la monocapa, como se muestra en el ejemplo anterior. El valor de tener esta información se ejemplifica por el hecho de que la capacidad de cuantificar el porcentaje de células endoteliales que exhiben una mayor adhesividad después de la irradiación condujo a los inesconclusión capaz que este efecto no es debido a la mutación genética de un gen en particular como el porcentaje de células que eran adhesivo eran muy por encima (más de 1000 veces más) que la que cabría esperar de mutación aleatoria de un gen por la radiación X a esa dosis .

El factor que permite una buena reproducibilidad de los resultados es el régimen de lavado. Como el procedimiento de lavado implica la inmersión de la cubreobjetos de vidrio en el tampón de lavado seguido por secándose en un tejido, se evita la variabilidad en la turbulencia tampón que inevitablemente surge desde el viejo método de pipeteado de la solución tampón de lavado en un pozo. De hecho, fue la observación de la variabilidad excesiva entre las réplicas obtenidas utilizando el método de pipeteado que nos obligó a idear un procedimiento de lavado que elimina el elemento de la variabilidad de la etapa de lavado.

Es cierto que las limitaciones de esta mentira de ensayo en la necesidad de llevar a cabo el recuento manual de los racimos de monocitos, que hacer not permita que se puede adaptar para los análisis de alto rendimiento. En segundo lugar, la decisión sobre el número de monocitos constituyen un grupo tiene que ser determinada semi-arbitrariamente y el nivel puede ser demasiado alto y dar lugar a la exclusión de algunos grupos genuinos. La falta de fuerza de cizallamiento en este método también puede ser visto como una limitación en experimentos en los que se induce groseramente mejorada adhesividad de las células endoteliales (por ejemplo, TNF +). En otras situaciones, sin embargo, la falta de fuerza de cizallamiento es una ventaja ya que permite la detección de aumento de menos exagerada de adhesividad. Modesto aumento de la adhesividad de los monocitos puede ser particularmente importante y relevante. In vivo, no (en un tiempo típico experimental) se espera que los monocitos a adjuntar en gran número a las células endoteliales con modesto aumento de la adhesividad, en gran parte debido a la fuerza de cizallamiento. En vez sin embargo, algunos monocitos probablemente haría, y esto es más probable a representar el entorno de inflamación crónica. Como tal,la ausencia de fuerza de cizallamiento puede ser una ventaja, ya que proporciona la oportunidad para que pequeños aumentos de la adhesividad de las células endoteliales para ser revelada en marcos de tiempo experimentales que son típicamente corto y posiblemente demasiado fugaz para permitir modesto aumento en la adhesividad a ser observado bajo tensión de cizallamiento.

La capacidad de someter a las células después de este ensayo para otros análisis tales como ensayo de la senescencia y la tinción de inmunofluorescencia aumenta la utilidad de este método, ya que permite la asociación de la adhesividad de las células endoteliales específicas a determinadas proteínas celulares o estados celulares como se demostró anteriormente, una característica que No está disponible con los ensayos de adhesión mayores.

Este método ha sido utilizado con células coronarias humanas Est2-inmortalizado endoteliales y resultados similares se obtuvieron también con las células endoteliales coronarias humanas primarias ^10, demostrando que no es específica para sólo una línea celular particular. Además, el ruido y pocasption de este método de ensayo de adhesividad de las células endoteliales no se oponen a someter a las mismas células para el ensayo de adhesión estándar que mide la fluorescencia de inmunocitos etiquetados. En conjunto, este informe demuestra que este método es muy versátil, incluyente y ofrece mucha más información que el ensayo de adhesión estándar.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)	Sigma	H6648
Glass coverslips Round 12 mm Diameter	Menzel-Glaser	CB00120RA1
24-well cluster plate	Costar	3526
Meso-Endo Cell media	Cell Applications	212-500
Trypsin-EDTA	Sigma	T4174
Soybean trypsin inhibitor	Life Technologies	17075-029
Cell Tracker Green	Life Technologies	C7025
RPMI	Sigma	R8758
Foetal Calf Serum	Life Technologies	10500064
Beta glasctosidase Assay kit	CellSignaling	9860
Fibronectin	Sigma	F0895