Simple y asistida por ordenador de pruebas olfativas para Ratones

Resumen

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Resumen

El olfato está altamente conservada entre las especies y se requiere para la reproducción y la supervivencia.

En los seres humanos, el olfato es también uno de los sentidos que se ve afectado con el envejecimiento y es un fuerte predictor de enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, las pruebas de olfato se utiliza como un método de diagnóstico no invasivo para detectar déficits neurológicos desde el principio. Con el fin de comprender los mecanismos subyacentes de sensibilidad olfativa red, la investigación olfativa en roedores ha cobrado impulso en la última década.

A continuación, presentamos un método muy simple, eficiente en tiempo y reproducible prueba olfativa de innata percepción del olor y la sensibilidad en los ratones sin la necesidad de cualquier restricción de alimentos o agua antes. Las pruebas se realizan en un ambiente familiar a los ratones, requieren sólo los olores y una sesión de 2 minutos de exposición odorante. Se lleva a cabo el análisis, post-hoc, utilizando comandos asistida por ordenador en ImageJ y puede ser, por lo tanto,, Llevado a cabo de principio a fin por un investigador.

Este protocolo no requiere ningún hardware o configuración especial y está indicado para cualquier laboratorio interesado en probar la percepción olfativa y sensibilidad.

Introducción

El olfato es una de las funciones sensoriales más desarrollados e importantes en los mamíferos. Cualquier alteración en la actividad olfativa puede afectar la ingesta de alimentos, el comportamiento social y, en el peor de los casos, incluso la supervivencia. En los seres humanos, el deterioro del olfato es dependiente ^{de 1 año} y es considerado un fuerte predictor de trastornos neurológicos ^2-6. La prueba de identificación del olfato desarrollado por la Universidad de Pennsylvania representa actualmente una de las pruebas más utilizadas, no invasivos y cuantificables, de diagnóstico que pueden evaluar los déficits neurológicos primeros ⁷ y predecir con alta probabilidad la progresión de la demencia ^8,9.

La accesibilidad del sistema olfativo y la prominencia del olfato en los roedores, ha desatado una intensa línea de investigación frente a los mecanismos de las funciones olfativas subyacentes ^10. Hemos demostrado anteriormente que la pérdida de la función del recept señalizacióno Notch1 afecta evitar olfativa ^11. En este protocolo que utilizamos ratones que carecen del ligando de señalización, Jagged1, en neuronas o células gliales para estudiar el rendimiento olfativo.

Olfato innato se define por tres parámetros como la percepción, la discriminación entre los olores y la sensibilidad olfativa ^4. Pruebas olfativas en roedores se puede hacer en una variedad de maneras y algunos estudios de comportamiento hacer uso de olfatómetros, que proporcionan el olor al animal en un concentraciones de vapor específicas y en un marco de tiempo precisa ^{12 - 14.} Sin embargo, esta instrumentación es caro y puede estar disponible sólo en instalaciones especializadas. En nuestro trabajo, ofrecemos un protocolo de prueba olfativa simple, rápida y reproducible, que se lleva a cabo utilizando aromas volátiles. Las pruebas descritas percepción medida para un atrayente o un olor repelente y evaluar la discriminación entre el olor y ^11,15,16 agua. Usando la misma configuración, wE también puede medir la sensibilidad a un olor a diferentes concentraciones ^16,17. El procesamiento post-hoc asistida por ordenador de vídeo, inspirado en la obra de la página y sus colegas ^18, ofrece resultados sin la necesidad de cegamiento experimental y permitiendo una sola persona para llevar a cabo todo el experimento.

Este protocolo está destinado a proporcionar un punto de partida para estudiar el comportamiento olfativo en ratones.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales están en conformidad con la Directiva de la UE 2010/63 / UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y son aprobados por el Comité local de Cuidado de Animales (Cantón de Friburgo, Suiza).

1. Preparación Animal

1. Los animales experimentales
   1. Realizar experimentos sobre tipo salvaje adulto de sexo masculino y de ratones transgénicos (C57BL / 6 de fondo) de 3-5 meses de edad. Los tres grupos de ratones corresponden a los controles de tipo salvaje (littermate grupo A, Jagged1 flox / flox ¹⁹⁾ y dos líneas condicionales de ratón KO (grupo B, C y Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
   2. Los ratones en condiciones de laboratorio estándar en una habitación ventilada, con un ciclo de oscuridad / luz controlada 12 horas y proporcionan alimento y agua ad libitum.

2. Configuración Experimental

1. Arena Experimental
   1. Para el ámbito experimental, utilizar una jaula ratón esterilizada limpia (36 cm largo x 20.5 cm de ancho x 13.5 cm de altura) (Figura 1).
   2. Asigne a cada ratón a una jaula numerada con ropa de cama fresca, 3 cm de alto. Si se vuelven a utilizar jaulas, como en la prueba de sensibilidad al olor, tome las siguientes medidas para evitar la contaminación cruzada entre los olores y ratones.
      1. Marque el lado del agua.
      2. Limpiar las paredes estrechas de las jaulas con dos papeles de seda rociadas con 70% de etanol, uno para cada lado.
      3. Apilar las jaulas de acuerdo con el genotipo de los ratones y almacenar temporalmente bajo una campana laminar.
2. Cámara
   1. Montar una cámara en un trípode personalizada con el objetivo a 58 cm de la parte inferior de la jaula (Figura 1A). Fijar la posición del trípode y la jaula y delimitar con marcas para permitir que la cámara se centra en la parte superior de la jaula.
   2. Grabar videos en 320 píxeles x 240 píxeles, 15,08 fotogramas por segundo como archivos MOV.
3. Olores
   1. Resuspender el scents, cuando se indique, en el disolvente en el que son solubles.
   2. Para la prueba de preferencia de uso de mantequilla de maní. Resuspender la mantequilla de cacahuete en aceite de cacahuete (10% w / v).
   3. Para la utilización prueba de evitación puro 2-metilbutírico (2-MB) ácido (98%).
   4. Para la prueba de sensibilidad, utilizar orina femenina de la misma colonia ratón y de fondo (C57BL / 6).
      1. Por conveniencia recoger la orina 1-2 días antes de la prueba olfativa. Restringir y mantenga pulsado el ratón debajo de la capilla con su vientre encima de la rejilla de la jaula. Bajo la rejilla jaula colocar una placa de Petri de plástico para recoger las gotas de orina.
      2. Recoger la orina de cada mujer en un tubo de 1,5 ml y mezclar todas las muestras de orina para normalizar la variabilidad entre animales. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
      3. En el día del experimento, descongelar la orina y realizar 4 diluciones en agua doblemente destilada a un factor de dilución de 10 (1:10, 1: 100, 1: 1.000; 1: 10.000).

3. Las pruebas olfativas

Nota: En este protocolo olores han sido elegidos deliberadamente que se perciben como atrayentes fuertes (mantequilla de maní y orina femenina) o repelente fuerte (ácido 2-MB) ^15. Es importante para llevar a cabo la preferencia y las pruebas de sensibilidad a los olores agradables antes de la prueba de evitación para eliminar la posibilidad de cualquier interferencia con el comportamiento olfativo. Sin embargo, en aras de la simplicidad, en este trabajo, prueba de preferencia y la evitación será tanto se describe en la prueba de percepción. Cada sesión de comportamiento comienza con una fase de habituación.

1. La habituación fase
   1. Colocar el animal en la jaula asignado limpia y se deja explorar durante 5 min (Figura 1B). Desde el entorno de la jaula experimental es familiar a la jaula de alojamiento, este corto período de tiempo es suficiente para permitir la habituación.
   2. Si se completa la prueba de sensibilidad en un solo día, realice habituación sólo una vez antes de la application de la más alta olor diluido. Si la prueba de sensibilidad se lleva a cabo en diferentes días, en cada día se necesita una fase de habituación en una nueva jaula limpia.
2. Prueba de Percepción
   1. Después de la habituación, activar la cámara e inmediatamente pipetear 60 l de la agradable aroma (mantequilla de maní) y 60 l de la olor neutro (agua del grifo) sobre las paredes opuestas de la jaula en alrededor de 10 cm desde la parte inferior (Figura 1C).
   2. Deje que el ratón explorar los olores durante 2 min (Figura 1D). A partir de entonces, apague la cámara.
   3. En este punto, continúe con la próxima ratón a partir de la fase de habituación. Realizar la prueba de evitación exactamente de la misma manera mediante la aplicación de 60 l de la olor repelente (ácido 2-MB) y 60 l de agua.
3. Prueba de sensibilidad
   1. Evaluar el umbral de atracción de ratones macho a concentraciones crecientes de orina femenina en el siguiente orden: 1: 10.000; 1: 1.000; 1: 100; 1:10 y en la orina pura.
   2. Después de la habituación, exponer cada ratón para la mayor dilución pipeta por el experimentador como se describe anteriormente en 3.2.1.
   3. Registre el comportamiento exploratorio de la orina frente de agua, dentro de un plazo de 2 minutos en una cámara de vídeo. Después de todas las cohortes ratones son la prueba de la mayor dilución (1: 10.000), exponerlo a una mayor concentración de la orina, como se indicó anteriormente.

4. Post-hoc de análisis de datos

Nota: Todas las pruebas de comportamiento descritos se procesan post hoc siguiendo las instrucciones de análisis de datos.

1. Abrir archivos MOV en ImageJ para sistemas Windows
   1. Instalar Quick Time para Java usando la configuración personalizada de http://www.apple.com/quicktime/download.
   2. Instale el plugin de Quick Time desde el sitio web ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. Importe el QTJava.zip (C: Archivos de programa QuickTime QTSystem) en las extens bibliotecaión de ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
   4. Copiar también el QTJava.zip en la carpeta plugins y cambiarle el nombre como QTJava.jar.
   5. Instale los seis guiones adjuntos en la carpeta Macros (ImageJ plugins Macros).
   6. Abrir ImageJ y compilar y ejecutar el plugin de Quick Time, a partir de entonces cerca ImageJ.
   7. Reabrir ImageJ y abra el archivo MOV utilizando Archivo> Importar> usando Quick Time.
2. Ajuste de vídeo
   1. Una vez que el archivo de vídeo se abre en ImageJ, cortar el vídeo con el fin de obtener una constante exploración 2 min desde el momento en que el experimentador ha pipetearon los odorantes en la jaula (T0). Identificar la estructura correspondiente al T0 y quitar los marcos anteriores utilizando incrementos de 1 (ImageJ imagen Pilas ToolsSlice removedor). Utilice el mismo comando para eliminar todas las tramas que superan la exploración 2 min.
   2. Asegúrese de que la jaula está centrado y si es necesario, utilice la Imagen> Transformar> comando Rotar para alinearlo.
3. Véaseo Procesamiento
   Nota: El procesamiento de vídeo es totalmente asistida por ordenador y usa comandos macros que acompañan este documento.
   1. Con el fin de restringir el área en la jaula de un 127 píxeles x 218 píxeles Tamaño de ejecutar el Paso 1 macro desde el Plugin> Macros> Ejecutar comando. Mueva el rectángulo fijo sobre la jaula (Figura 2, Paso 1).
   2. Recortar el área de la jaula en la región de interés (ROI) con el Paso 2 macro (Figura 2, Paso 2).
   3. Utilice la macro Paso 3 para extraer la imagen del ratón del fondo mediante la asignación de una señal de umbral, eliminación de puntos y el filtrado de la varianza de la señal. Los valores de salida en la trama eje Z indican los valores de gris medio, correspondiente a la intensidad de la sombra del ratón en movimiento dentro de la ROI de la "cámara de agua" durante la exploración 2 min. Copie los resultados en una hoja de cálculo denominada según el retorno de la inversión en un archivo de hoja de cálculo (Figura 2, Paso 3).
   4. Utilice el Paso 4 macro paraextraer los valores medios de grises el ratón en la ROI "cámara de olor". Copie los resultados en una hoja de cálculo denominada según el retorno de la inversión en la misma hoja de cálculo como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 4).
   5. Con el fin de restringir aún más el análisis del movimiento del ratón en el retorno de la inversión "perímetro agua" utilizar el Paso 5 macro. Copie el resultado en la hoja de cálculo llamado según el retorno de la inversión en la misma hoja de cálculo como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 5).
   6. Para restringir el análisis del movimiento del ratón en el retorno de la inversión "olor perímetro" utilizar el Paso 6 macro. Copie el resultado en la hoja de cálculo llamado de acuerdo con el archivo de hoja de cálculo de retorno de la inversión como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 6).
   7. Procesar todos los vídeos y comprobar la consistencia en el número de fotogramas por animales. Aquí, registrar todos los animales de 1810 tramas correspondientes a una sesión de exploración de 2 min.
   8. Para cada animal y para cada tipo de ROI con marcos va de gris mediolues mayor que 0. Divide el número de fotogramas por los valores correspondientes a 1 segundo y obtener los segundos transcurridos en cada retorno de la inversión.

5. Análisis estadístico

1. Para cada prueba verificar la homogeneidad de la varianza dentro de grupos / genotipos mediante la prueba de Bartlett utilizando la fórmula disponible en http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
2. En la prueba de la atracción y evitación, realizar comparaciones entre los tiempos pasados ​​con agua frente olor dentro de un grupo utilizando la prueba t de Student no direccional asumiendo varianzas iguales o desiguales en función de los resultados de la prueba de Bartlett. Compare los tiempos pasados ​​con los olores restados por el tiempo que pasa con el agua entre los genotipos mediante un modelo lineal con la prueba post-hoc de Bonferroni.
3. En la prueba de sensibilidad a analizar las comparaciones del tiempo pasado con el olor restado del tiempo pasado con finalesr entre los grupos en un diluciones específicas de la orina por un modelo lineal con la prueba post-hoc de Bonferroni. Comparar la sensibilidad entre los grupos a las concentraciones crecientes de olor en un 2-Way ANOVA con repeticiones con test post-hoc de Bonferroni.
4. La interacción entre genotipos y tratamientos en la prueba de la atracción y la evasión son investigados por 2 vías ANOVA con test post-hoc de Bonferroni.

Resultados

La prueba mide la percepción de la atracción a la mantequilla de maní y la evitación de ácido 2-MB. Tres grupos de ratones se prueban y el tiempo pasado en el "olor perímetro" se cuantifican en comparación con agua. En la prueba de preferencia, el grupo de control A muestra preferencia significativa al olor en comparación con agua ₍₈ t = 2,52, p <0,05). Por otra parte, el grupo B no muestra ningún interés significativo para la mantequilla de maní y pasa más tiempo con agua (t ₆

Discusión

Las pruebas que se proponen en este protocolo permiten evaluar diferentes aspectos del comportamiento olfativo innata en ratones: la percepción de los olores, la discriminación entre los olores frente a agua y la sensibilidad a los olores. Este protocolo se puede aplicar a cualquier olor de acuerdo con la preferencia y la escala de evitación previamente demostrado ^15. Dado que el protocolo se basa en la actividad exploratoria es importante que los ratones no muestran ningún deterioro motor o la ansiedad q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis