פשוט וחוש ריח בדיקה לעכברים בסיוע מחשב

Summary

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Abstract

Olfaction הוא שמור ביותר בין מינים, ודורש לרבייה והישרדות.

בבני אדם, לחוש ריח הוא גם אחד מהחושים שמושפעים עם הזדקנות והוא מנבא חזק של מחלות ניווניות. לפיכך, בדיקת חוש ריח משמשת כשיטת אבחון לא פולשני לאתר גירעונות נוירולוגיות בשלב מוקדם. כדי להבין את מנגנוני רגישות רשת חוש הריח, חוש הריח מחקר במכרסמים צבר תאוצה בעשור האחרון.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה מאוד, זמן יעילה ושחזור בדיקת חוש הריח של תפיסה מולדת ריח ורגישות בעכברים ללא הצורך של כל הגבלת מזון או מים לפני. הבדיקות מבוצעות בסביבה מוכרת לעכברים, דורש רק ריחות ומושב 2 דקות של חשיפת odorant. הניתוח מתבצע, פוסט הוק-, באמצעות פקודות בעזרת מחשב על ImageJ ויכול להיות, ולכן, ביצע מתחילתו ועד סופו על ידי חוקר אחד.

פרוטוקול זה אינו דורש כל חומרה או התקנה מיוחדת ומצוין לכל מעבדה מעוניינת בבדיקת תפיסה ורגישות חוש הריח.

Introduction

Olfaction הוא אחת מהפונקציות החושיות המפותחות והחשובות ביותר ביונקים. כל ירידת ערך בפעילות חוש הריח עלולה להשפיע על צריכת מזון, התנהגות חברתית ו, במקרה הגרוע ביותר, אפילו הישרדות. בבני אדם, הידרדרות חוש הריח הוא גיל תלוי ¹ ונחשב למנבא חזק של הפרעות נוירולוגיות ^2-6. מבחן זיהוי הריח שפותח על ידי אוניברסיטת פנסילבניה מייצג כיום אחד המבחנים הנפוצים ביותר, לא פולשנית וכימות, האבחון שיכול להעריך גירעונות נוירולוגיות מוקדם ⁷ ולחזות בהסתברות גבוהה את ההתקדמות של דימנציה ^8,9.

הנגישות של מערכת חוש הריח וחוש ריח של הגדולה במכרסמים, עוררה שורה אינטנסיבית של מחקר העוסקת במנגנוני פונקציות חוש הריח בסיסי ^10. הראינו הפסד של פונקציה של recept האיתות בעבראו Notch1 משפיע הימנעות חוש הריח ^11. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בעכברים חסרי יגנד האיתות, Jagged1, בנוירונים או גליה ללמוד ביצועי חוש הריח.

לחוש ריח מולדים מוגדר על ידי שלושה פרמטרים כתפיסה, אפליה בין ריחות ורגישות חוש הריח ^4. בדיקת חוש הריח במכרסמים יכולה להיעשות במגוון דרכים וכמה מחקרים התנהגותיים לעשות שימוש olfactometers, המספק את הריח לבעלי החיים בריכוזי אדים ספציפיים ובמסגרת זמן מדויקת ^{12 - 14.} עם זאת, מכשור זה הוא יקר ועשוי להיות זמין רק במתקנים מיוחדים. בעבודה שלנו, אנו מספקים פרוטוקול פשוט, מהיר ושחזור חוש הריח בדיקה, אשר מתבצע באמצעות ריחות נדיפים. הבדיקות מתוארות תפיסת אמצעי לattractant או ריח דוחה ולהעריך את האפליה בין הריח ^ו11,15,16 מים. שימוש באותה ההגדרה, wדואר גם יכול למדוד את הרגישות לריח בריכוזים שונים ^16,17. פוסט-הוק העיבוד בעזרת מחשב הווידאו, בהשראת עבודתו של פייג 'ועמיתי ^18, מספק תוצאות משוחדת ללא הצורך של מסנוור ניסיוני ומאפשר לאדם אחד לבצע את הניסוי כולו.

פרוטוקול זה נועד לספק נקודת התחלה ללימוד התנהגות חוש הריח בעכברים.

Protocol

כל הליכי בעלי החיים הנן בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ואושרו על ידי הוועדה המקומית טיפול בבעלי חיים (קנטון פריבורג, שוויץ).

1. הכנת בעלי החיים

1. חיות ניסוי
   1. לבצע ניסויים בסוג מבוגר זכר פראי ועכברים הטרנסגניים (C57BL / 6 רקע) של 3-5 חודשים של גיל. שלוש הקבוצות של עכברים מתאימות לבקרות littermate הסוג בר (קבוצה, Jagged1 flox / flox ¹⁹⁾ ושני קווים מותנים KO עכבר (הקבוצה B, ו- C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
   2. עכברי בית בתנאי מעבדה סטנדרטיים בחדר מאוורר, עם מחזור כהה / אור מבוקר 12 שעות ומספקים כרצונך מודעת מזון ומים.

2. הגדרת ניסוי

1. זירת ניסוי
   1. לזירת הניסוי, להשתמש בעכבר בכלוב מעוקר נקי (אורך סנטימטר 36 x 2גובה 0.5 סנטימטרים רוחב X 13.5 סנטימטרים) (איור 1 א).
   2. הקצאה כל עכבר לכלוב ממוספר עם מצעים טריים, 3 סנטימטר. אם כלובי שימוש חוזרים, כמו במבחן רגישות הריח, לנקוט בצעדים הבאים כדי למנוע זיהום צולב בין ריחות ועכברים.
      1. סמן את צד המים.
      2. נקה את הקירות צרים של הכלובים עם שני מסמכי הרקמה ריססו עם 70% אתנול, אחד לכל צד.
      3. להיערם כלובים לפי גנוטיפ של העכברים ולאחסן באופן זמני מתחת למכסת מנוע למינרית.
2. מצלמה
   1. הר מצלמה על חצובה מותאמת אישית במטרה על 58 סנטימטר מהחלק התחתון של הכלוב (איור 1 א). לתקן את המיקום של חצובה והכלוב ולתחום עם סימנים כדי לאפשר למצלמה כדי להיות מרוכזת בחלק העליון של הכלוב.
   2. קלטת קטעים וידאו ב 320 פיקסלים x 240 פיקסלים, 15.08 פריימים לשניה כקבצי MOV.
3. ריחות
   1. Resuspend scenTS, כאשר הצביעו, בממס שבו הם מסיסים.
   2. לחמאת הבוטנים שימוש מבחן העדפה. Resuspend חמאת הבוטנים בשמן בוטנים (10% w / v).
   3. לשימוש במבחן הימנעות חומצת 2-Methylbutyric (2-MB) טהורה (98%).
   4. לבדיקת הרגישות, להשתמש בשתן נקבה מאותו המושבה העכבר והרקע (C57BL / 6).
      1. לנוחיות לאסוף את השתן 1-2 ימים לפני בדיקת חוש הריח. לרסן והחזק את העכבר מתחת למכסת המנוע עם הבטן שלה מעל לרשת הכלוב. תחת רשת כלוב מקום בצלחת פטרי פלסטיק כדי לאסוף את הטיפות של שתן.
      2. לאסוף את השתן מכל נשים בצינור 1.5 מ"ל ומערבבים את כל דגימות השתן לנרמל לשונות בין בעלי החיים. חנות ב -20 ° C עד שימוש.
      3. ביום של הניסוי, להפשיר את השתן ולבצע 4 דילולים במים מזוקקים פעמיים בגורם לדילול של 10 (01:10, 1: 100; 1: 1,000; 1: 10,000).

3. בדיקת חוש הריח

הערה: בריחות זה פרוטוקול שנבחרו במכוון שנתפסים כמשיכה חזקה (חמאת בוטנים ושתן נקבה) או דוחה חזק (חומצת 2-MB) ^15. חשוב לבצע את ההעדפה ומבחני רגישות לריחות נעימים לפני בדיקת ההימנעות כדי לשלול את האפשרות של התערבות בהתנהגות חוש הריח. עם זאת, למען הפשטות, בנייר, מבחן העדפה והימנעות זו תהיה גם תאר במבחן את התפיסה. כל מפגש מתחיל בהתנהגות שלב התרגלות.

1. שלב התרגלות
   1. מניחים את החיה בכלוב שהוקצה הנקי ולתת לו לחקור במשך 5 דקות (איור 1). כיוון שהסביבה של הכלוב הניסיוני מוכרת לכלוב בבית, זמן קצר זה מספיק כדי לאפשר להתרגלות.
   2. אם בדיקת הרגישות הושלמה ביום אחד, לבצע הרגלה רק פעם אחת לפני האפליקציותn של הריח המדולל הגבוה ביותר. אם בדיקת הרגישות מתבצעת בימים שונים, בכל יום יש צורך בשלב התרגלות על כלוב נקי חדש.
2. מבחן תפיסה
   1. אחרי ההתרגלות, להפעיל את המצלמה ופיפטה מייד 60 μl של הריח נעים (חמאת בוטנים) ו -60 μl של ריח הניטרלי (מי ברז) על הקירות נגדיים של הכלוב בכ -10 סנטימטר מהחלק התחתון (איור 1 ג).
   2. בואו העכבר לחקור את הריחות למשך 2 דקות (1D איור). לאחר מכן, כבה את המצלמה.
   3. בשלב זה, להמשיך במתחיל את העכבר הבא מהשלב ההתרגלות. בצע את בדיקת ההימנעות בדיוק באותו אופן על ידי יישום 60 μl של הריח הדוחה (חומצת 2-MB) ו -60 μl של מים.
3. מבחן רגישות
   1. להעריך את סף המשיכה של עכברי זכרים להגדלת ריכוזים של שתן נקבה לפי הסדר הבא: 1: 10,000; 1: 1,000; 1: 100; 1:10 ושתן טהור.
   2. אחרי ההתרגלות, לחשוף כל עכבר לדילול הגבוה ביותר pipetted על ידי הנסיין כפי שתואר לעיל ב3.2.1.
   3. רשום את התנהגות הגישוש של שתן לעומת מים, בתוך מסגרת זמן 2 דקות במצלמת וידאו. אחרי כל שנתוני העכברים נבדקים לדילול הגבוה ביותר (1: 10,000), לחשוף לריכוז גבוה יותר של שתן, כפי שצוין לעיל.

4. הודעה-הוק ניתוח נתונים

הערה: כל הבדיקות התנהגותיות תיארו מעובדות פוסט הוק ביצוע הוראות ניתוח נתונים.

1. פתח MOV קבצים בImageJ למערכות Windows
   1. התקנה מהירה זמן עבור Java תוך שימוש בהגדרות המותאמות אישית מhttp://www.apple.com/quicktime/download.
   2. התקן את תוסף הזמן המהיר מאתר ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. לייבא QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) לextens הספרייהיון של ImageJ (.ImageJ JRE lib שלוחה).
   4. עותק גם QTJava.zip בתיקיית התוספים ושנה את שמו כQTJava.jar.
   5. התקן את ששת התסריטים מצורפים בתיקיית מאקרו (ImageJ plugins מאקרו).
   6. ImageJ הפתוח ולקמפל ולהריץ את תוסף הזמן המהיר, לאחר מכן קרוב ImageJ.
   7. פתח מחדש ImageJ ולפתוח את קובץ MOV באמצעות קובץ> יבוא> באמצעות זמן מהיר.
2. התאמת וידאו
   1. ברגע שקובץ הווידאו נפתח בImageJ, לחתוך את הווידאו על מנת לקבל חקר 2 דקות קבועות מרגע שהנסיין יש pipetted odorants לתוך הכלוב (T0). זהה את המסגרת המתאימה לT0 ולהסיר את המסגרות הקודמות באמצעות מרווחים של 1 (תמונת ImageJ מסיר ערימות ToolsSlice). השתמש באותה פקודה למחוק את כל המסגרות עולות חקר 2 דקות.
   2. ודא כי הכלוב הוא מרוכז ואם יש צורך להשתמש התמונה> Transform> הפקודה סובב כדי ליישר אותו.
3. רְאֵהעיבוד o
   הערה: עיבוד וידאו הוא באופן מלא בסיוע מחשב ומשתמש בפקודות פקודות מאקרו מלוות מאמר זה.
   1. כדי להגביל את האזור על הכלוב של x 218 פיקסלים בגודל 127 פיקסלים להפעיל את המאקרו שלב 1 מ> מאקרו פקודת Plugin> הפעלה. הזז את המלבן הקבוע מעל הכלוב (איור 2, שלב 1).
   2. חתוך את האזור של הכלוב באזור של העניין (ROI) באמצעות מאקרו שלב 2 (איור 2, שלב 2).
   3. השתמש מאקרו שלב 3 כדי לחלץ את תמונת העכבר מן הרקע על ידי הקצאת אות סף, despeckling וסינון שונות האות. ערכי הפלט בעלילת ציר Z מציינים את הערכים האפורים הממוצעים, המתאימים לעוצמת צל העכבר נע בתוך את ההחזר על ההשקעה של "קאמרי מים" במהלך חקירת 2 דקות. העתק את התוצאות לגיליון עבודה בשם פי את ההחזר על ההשקעה בקובץ גיליון אלקטרוני (איור 2, שלב 3).
   4. השתמש מאקרו שלב 4 ללחלץ את הערכים האפורים הממוצעים של העכבר בהחזר על ההשקעה "קאמרי ריח". העתק את התוצאות לגיליון עבודה בשם פי את ההחזר על ההשקעה באותו קובץ גיליון אלקטרוני כמו ב4.3.3 (איור 2, שלב 4).
   5. כדי להגביל את הניתוח של תנועת העכבר ב" היקף המים "החזר על השקעה נוספת להשתמש במאקרו שלב 5. העתק את התוצאה על גיליון העבודה בשם פי את ההחזר על ההשקעה באותו קובץ גיליון אלקטרוני כמו ב4.3.3 (איור 2, שלב 5).
   6. כדי להגביל את הניתוח של תנועת העכבר ב" היקף הריח "החזר על ההשקעה להשתמש במאקרו שלב 6. העתק את התוצאה על גיליון העבודה בשם פי קובץ הגיליון האלקטרוני החזר השקעה כמו ב4.3.3 (איור 2, שלב 6).
   7. לעבד את כל קטעי הווידאו ולבדוק עקביות במספר המסגרות לבעלי חיים. כאן, להקליט את כל בעלי החיים ל1,810 מסגרות המתאימות לפגישת חקר 2 דקות.
   8. לכל חיה ולכל סוג ROI מסגרות עם VA האפור הממוצעlues גדול יותר מאשר 0. לחלק את מספר המסגרות על ידי הערכים מקבילים לשנייה 1 ולקבל את שניות בילו בכל החזר על השקעה.

5. ניתוח סטטיסטי

1. עבור כל בדיקה לוודא הומוגניות של שונות בתוך קבוצות / גנוטיפים על ידי הבדיקה של ברטלט באמצעות הנוסחא נגיש בhttp://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
2. במבחן המשיכה והימנעות, לבצע השוואות בין הפעמים בילו במים לעומת ריח בתוך קבוצה אחת באמצעות מבחן t של סטודנט שאינו-כיווני בהנחת סטיות שווה או לא שווה בהתאם לתוצאות של הבדיקה של ברטלט. השווה את הזמנים בילו עם ריחות מופחתים לפי הזמן בילה במים בין גנוטיפים על ידי כיוון אחד ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni.
3. בבדיקת הרגישות לנתח השוואות של הזמן בילה עם ריח מופחתים הזמן בילו עם water בין קבוצות בדילולים ספציפיים של שתן על ידי כיוון אחד ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni. השווה את הרגישות בין קבוצות לריכוזי ריח גדלו ב 2-Way ANOVA עם חזרות עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni.
4. אינטראקציה בין גנוטיפים וטיפולים במבחן המשיכה והימנעות נחקרות על ידי 2-way ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni.

תוצאות

הבדיקה מודדת את תפיסת המשיכה לחמאת בוטנים והימנעות לחומצת 2-MB. שלוש קבוצות של עכברים שנבדקו ואת משך הזמן ב" היקף הריח "הם לכמת בהשוואה למים. במבחן ההעדפה, קבוצת הביקורת מציגה העדפה משמעותית לריח בהשוואה למים (t ₈ = 2.52, p <0.05). מצד השני, קבוצת B לא מראה שום משיכה מ...

Discussion

הבדיקות המוצעות בפרוטוקול זה מאפשרים להעריך היבטים שונים של התנהגות חוש הריח מולדת בעכברים: תפיסה לריחות, אפליה בין ריחות לעומת מים ורגישות לריחות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל ריח על פי ההעדפה והיקף הימנעות מוצגת ¹⁵ בעבר. מאז הפרוטוקול מבוסס על פעילות גיש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis