간단하고 컴퓨터 지원 마우스에 대한 후각 테스트를

요약

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

초록

후각은 매우 종 가운데 보존하고 재생과 생존을 위해 필요합니다.

인간에서, 후각은 노화의 영향을받는 감각 중 하나이며, 신경 퇴행성 질환의 강력한 예측 인자이다. 따라서, 후각 테스트 초기 신경 학적 결손을 검출하는 비 침습적 진단 방법으로 사용된다. 후각 네트워크 감수성 근본적인 메커니즘을 이해하기 위하여, 설치류에서 후각 연구는 지난 10 년간 추진력을 얻고있다.

여기서는 사전 식품이나 물 제한없이 마우스에서 타고난 악취 지각 감도의 매우 간단한 시간 효율적이고 재현 후각 테스트 방법을 제시한다. 시험은 마우스에 익숙한 환경에서 수행되는, 냄새와 취기 노출의 2 분의 세션 만이 필요합니다. 분석에 ImageJ에 컴퓨터 보조 명령을 사용하여, 사후를 수행하기 때문에, 될 수있는한 연구원에 의해 처음부터 끝까지 수행.

이 프로토콜은 특별한 하드웨어 또는 설치를 필요로하지 않으며, 후각 인식과 감도를 테스트에 관심이있는 실험실에 대해 표시됩니다.

서문

후각은 포유 동물에서 가장 선진국과 중요한 감각 기능 중 하나입니다. 후각 활동의 손상 차손은 최악의 경우 음식 섭취, 사회적 행동하고, 심지어 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 인간으로, 후각 저하가 ¹ 의존 나이이고 신경 장애 ^2의 강력한 예측 인자로 간주됩니다 ^{- 6.} 펜실베니아 대학에 의해 개발 된 후각 식별 검사는 현재 초기 신경 학적 결손 ^7을 평가하고 높은 확률로 치매 ^8,9의 진행을 예측할 수있는 가장, 사용되는 비 침습적 및 정량화, 진단 테스트 중 하나를 나타냅니다.

후각 시스템 및 설치류에서 후각의 굴지의 접근성, 기전 후각 기능 ^(10)를 다루는 연구의 강렬한 선을 촉발했다. 우리는 이전에 신호 RECEPT의 기능의 손실을 보여 주었다또는 Notch1은 후각 회피 ^{(11)에 영향을} 미친다. 이 프로토콜에서 우리는 후각 성능을 연구하는 신경 세포 나 교세포에서 신호 리간드, Jagged1 결핍 된 마우스를 사용합니다.

타고난 후각은 인식과 같은 세 개의 매개 변수, 냄새와 후각 민감도 ⁴ 사이의 차별에 의해 정의된다. 설치류 후각 테스트는 다양한 방식으로 수행 될 수 있으며, 일부 행동 연구는 특정 증기 농도 및 정확한 시간 프레임 ^(12)에 동물에게 냄새를 제공 olfactometers, 사용하게 ^{- 14.} 그럼에도 불구하고,이 장비는 고가이고 만 전문 시설에서 사용할 수 있습니다. 우리의 연구에서, 우리는 휘발성 향기를 이용하여 수행되고, 간단한 빠르고 재현성 후각 시험 프로토콜을 제공한다. 테스트는 유인 또는 기피 냄새를 측정 인식을 설명하고 향기와 물 ^11,15,16 사이의 차별을 평가한다. 와트, 동일한 설정을 사용하여E는 다양한 농도 ^{(16, 17)에서의} 냄새에 대한 민감도를 측정 할 수있다. 페이지 및 동료 ^(18)의 작품에서 영감을 사후 컴퓨터를 이용한 영상 처리, 실험 맹검 전체 실험을 수행 할 수있는 한 사람을 허용 할 필요없이 공정한 결과를 제공합니다.

이 프로토콜은 마우스에서 후각 거동을 연구하기위한 시작점을 제공하기위한 것이다.

프로토콜

모든 동물의 절차는 과학적인 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 유럽 연합 지침 63분의 2,010 / 유럽 연합 (EU)에 따라하고 (프리 부르 주, 스위스) 지역의 동물 관리위원회에 의해 승인됩니다.

1. 동물 준비

1. 실험 동물
   1. 성인 남성 야생 유형과 연령 3-5 개월 형질 전환 생쥐 (C57BL / 6 배경)에 대한 실험을 수행합니다. 마우스의 세 그룹은 야생형 한배의 새끼 컨트롤에 해당합니다 (그룹, Jagged1 flox / flox ^19)와 두 개의 조건부 KO 마우스 라인 (B 군, Jagged1ncKO와 C, Jagged1gcKO).
   2. 12 시간 제어 어두운 / 라이트 사이클 통풍 표준 실험실 조건에서 주택의 마우스, 그리고 음식과 물을 광고 무제한을 제공합니다.

2. 실험 설정

1. 실험 무대
   1. 실험 분야의 경우, 깨끗한 살균 마우스 케이지를 사용 (36cm 길이 × 20.5 cm 가로 x 13.5 cm 높이) (그림 1A).
   2. 3cm 높은 신선한 침구와 번호가 케이지에 각 마우스를 할당합니다. 케이지를 재사용하는 경우, 악취 감수성 시험에서와 같이, 악취와 마우스 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 다음과 같은 조치를 취해야.
      1. 물 측을 표시합니다.
      2. 70 % 에탄올, 각면에 대해 하나의 분무 두 조직의 서류와 함께 케이지의 좁은 벽을 청소합니다.
      3. 마우스의 유전자형에 따라 새장을 더미와 층류 후드 아래에 일시적으로 저장합니다.
2. 카메라
   1. 케이지 (그림 1A)의 바닥에서 58cm의 목적으로 사용자 정의 삼각대에 카메라를 탑재합니다. 삼각대와 케이지의 위치를​​ 고정하고 카메라가 케이지의 상단을 중심으로 할 수 있도록 마크 구분.
   2. X 240 픽셀, MOV 파일로 초당 15.08 프레임 320 픽셀의 비디오를 녹화.
3. 냄새
   1. 인 scen을 재현 탁표시된 경우 TS, 용매에있는 이들은 가용성이다.
   2. 환경 테스트 사용 땅콩 버터하십시오. 땅콩 기름, 땅콩 버터 (/ V w 10 %)을 재현 탁.
   3. 회피 시험 사용 순수 2 Methylbutyric (2 MB) 산 (98 %)를 참조하십시오.
   4. 감도 테스트를 위해, 같은 마우스 식민지와 배경 (C57BL가 / 6)에서 여성의 소변을 사용합니다.
      1. 편의를 위해 후각 시험 1 ~ 2 일 전에 소변을 수집합니다. 제지 및 케이지 그리드 위의 배와 후드 아래에 마우스를 누르고 있습니다. 케이지 그리드에서 소변의 방울을 수집하는 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다.
      2. 1.5 ML 튜브의 각 여성에서 소변을 수집과 동물 사이의 변화에​​ 대한 정상화 모든 소변 샘플을 섞는다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
      3. 실험 날에, 소변을 해동하고 10의 희석 배수에 증류수 4 희석을 수행 (1:10 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10,000).

3. 후각 테스트

참고 : 강한 유인 (땅콩 버터와 여성의 소변) 또는 강한 반발 (2-MB 산) ^(15)으로 인식되어 의도적으로 선택되었습니다이 프로토콜 냄새합니다. 또한 후각 동작과 간섭의 가능성을 제거하기 위해 회피 시험에 앞서 쾌적한 냄새로 선호도 민감도 시험을 실시하는 것이 중요하다. 그럼에도 불구하고, 본 논문에서는 환경 설정 및 회피 시험의 단순화를 위해, 모두 인식 테스트에서 설명한다. 각 행동 세션은 습관화 단계로 시작합니다.

1. 요법 이니 단계
   1. 깨끗한 할당 새장에 동물을 배치하고 5 분 (그림 1B)에 대해 알아 보자. 실험 케이지 환경 홈 케이지에 익숙하기 때문에, 짧은 시간 습관화을 허용하기에 충분하다.
   2. 감수성 시험 하루에 완료되는 경우, 응용 프로그램, 습관화 전에 한번만 수행가장 높은 희석 냄새 명. 감수성 시험은 다른 날에 수행되는 경우, 각각의 날에 새로운 깨끗한 케이지 습관화 단계가 필요하다.
2. 인식 테스트
   1. 습관화 이후, 카메라를 작동하고 바로 아래쪽 (도 1C)에서 약 10cm에서 케이지의 대향 벽 상 쾌적한 향기 (땅콩 버터) 60 μL 및 중성 향기 (수돗물)의 60 μL 피펫.
   2. 마우스가 2 분 (그림 1D)의 냄새를 알아 보자. 그 후, 카메라의 전원을 전환합니다.
   3. 이 시점에서, 다음 마우스 습관화 단계부터 진행. 발수 냄새 60 μL (2-MB 산) 및 물 60 μl를 가하여 정확히 동일한 방식으로 회피 시험한다.
3. 감도 테스트
   1. 1 : 다음과 같은 순서로 여성의 소변 농도 증가에 수컷 마우스의 임계 흡착 평가 10000; 1 : 1000; 1 : 100; 1 :(10)과 순수한 소변.
   2. 습관화되면, 이전에 3.2.1에 설명 된대로 실험에 의해 피펫 가장 높은 희석 각 마우스를 노출.
   3. 비디오 카메라에서 2 분의 시간 프레임 내에서, 물 대 소변의 탐색 동작을 기록한다. 모든 마우스는 코호트 높은 희석 (1 : 10,000)에 대해 시험 한 후 전술 한 바와 같이, 소변의 높은 농도에 노출.

4. 사후 데이터 분석

참고 : 설명하는 모든 행동 테스트는 데이터 분석 지침에 따라 사후 처리됩니다.

1. Windows 시스템 ImageJ에에서 MOV 파일을 엽니 다
   1. http://www.apple.com/quicktime/download에서 사용자 정의 된 설정을 사용하여 자바에 대해 빠른 시간을 설치합니다.
   2. ImageJ에 웹 사이트 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html)에서 빠른 시간 플러그인을 설치합니다.
   3. 라이브러리 extens에 ( 프로그램 파일 퀵타임 QTSystem C) QTJava.zip 가져 오기ImageJ에 이온 (.ImageJ JRE lib 디렉토리 내선).
   4. 플러그인 폴더에 복사하여 QTJava.zip 및 QTJava.jar로 이름을 바꿉니다.
   5. 매크로 폴더에 첨부 된 여섯 스크립트를 설치 (ImageJ에 플러그인 매크로).
   6. 오픈 ImageJ에 그 후 가까운 ImageJ에를 컴파일하고 빠른 시간 플러그인을 실행합니다.
   7. 빠른 시간 사용> ImageJ에를 다시 열고 파일> 가져 오기를 사용하여 MOV 파일을 엽니 다.
2. 영상 조정
   1. 비디오 파일은 ImageJ에 오픈되면, 실험자 케이지 (T0)에 방향제를 피펫 팅 된 시간에서 상수 2 분 탐색을 얻기 위해서 영상을 잘랐다. (스택 ToolsSlice 제거 ImageJ에 이미지) 1 단위를 사용하여 이전 프레임을 T0에 해당하는 프레임을 확인하고 제거합니다. 2 분 탐사를 초과하는 모든 프레임을 삭제 같은 명령을 사용합니다.
   2. 케이지가 중앙에 있는지 확인하고 필요한 사용은 이미지> 변환하는 경우> 회전 명령을 정렬 할 수 있습니다.
3. 보라O 처리
   참고 : 비디오 처리는 완전히 컴퓨터 보조이며,이 종이를 동반 매크로 명령을 사용합니다.
   1. 127 픽셀 X 218 픽​​셀 크기의 케이지에 영역을 제한하기 위해 플러그인> 매크로> 실행 명령의 1 단계 매크로를 실행합니다. 케이지 (그림 2, 1 단계)을 통해 고정 된 사각형을 이동합니다.
   2. 단계 2 매크로 (도 2, 단계 2)를 이용하여 관심 영역 (ROI)의 영역에 케이지 영역 자르기.
   3. , 임계 값 신호를 할당 얼룩 제거 및 신호 변동을 필터링하여 배경으로부터 마우스 이미지를 추출하는 단계 3 매크로를 사용. Z 축은 곡선의 출력값은 2 분 동안 탐사 "수조"의 ROI 내에 움직이는 마우스 섀도우의 강도에 대응하는 평균 그레이 값을 나타낸다. 스프레드 시트 파일의 투자 수익 (ROI) (그림 2, 3 단계)에 따라 이름이 워크 시트에 결과를 복사합니다.
   4. 에 4 단계 매크로를 사용하여투자 수익 (ROI) "냄새 실"에서 마우스의 평균 회색 값을 추출. 4.3.3에서와 같은 스프레드 시트 파일의 투자 수익 (ROI) (그림 2, 4 단계)에 따라 이름이 워크 시트에 결과를 복사합니다.
   5. 상기 ROI "물 경계"에서 마우스의 움직임 분석을 제한하기 위해 단계 5 매크로를 사용한다. 4.3.3에서와 같은 스프레드 시트 파일의 투자 수익 (ROI) (그림 2, 5 단계)에 따라 이름이 워크 시트에 결과를 복사합니다.
   6. ROI "냄새 경계"에서 마우스의 움직임 분석을 제한하는 단계 6 매크로를 사용한다. 4.3.3에서와 투자 수익 (ROI) 스프레드 시트 파일 (그림 2, 6 단계)에 따라 이름이 워크 시트에 결과를 복사합니다.
   7. 모든 동영상을 처리하고 동물 당 프레임 수에 일관성이 있는지 확인합니다. 여기에, 2 분 탐사 세션에 해당하는 1810 프레임에 모든 동물을 기록합니다.
   8. 각 동물과 종류의 프레임 평균 회색 VA 각 투자 수익 (ROI)에 대한매독 나누기 0보다 큰 값으로 프레임 수가 1 초에 대응하는 각각의 ROI에서 소요 초 얻었다.

5. 통계 분석

1. 각 시험 http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/에 사용할 수있는 공식을 사용하여 바틀렛의 시험에 의해 그룹 / 유전자형 내 분산의 동질성을 확인합니다.
2. 시간 바틀의 검사 결과에 따라 동일하거나 동일하지 않은 차이를 가정 무 지향성 스튜던트 t-test를 이용하여 하나의 그룹 내에 악취 대 물 소비간에 인력 및 회피 시험에서는, 비교를 수행한다. 페로 니의 사후 테스트로 일원 분산 분석하여 유전자형 사이에 물에 소요되는 시간 뺀 냄새와 소요 시간을 비교합니다.
3. 감수성 시험에서 식 수용 함께 보낸 시간으로부터 감산 냄새 소요 시간을 비교 분석페로 니의 사후 테스트와 일원 분산 분석에 의한 소변의 특정 희석에 그룹 중 R. 페로 니의 사후 테스트와 반복 2 일원 분산 분석에 의해 성장하는 악취 농도 그룹 사이의 감도를 비교.
4. 매력 및 회피 테스트에서 유전자형과 치료 사이의 상호 작용은 페로 니의 사후 테스트 2 일원 분산 분석에 의해 조사한다.

결과

인식 테스트는 2-MB 산에 땅콩 버터와 회피에 매력을 측정합니다. 세 그룹의 마우스는 시험 물에 비해 "냄새 경계"에서 소요 시간을 정량화한다. 물 ₍₈ t = 2.52, p <0.05)에 비교하여 환경 시험에서, 대조군은 냄새에 상당한 선호도를 표시한다. 반면에, B 군은 땅콩 버터에 상당한 매력을 표시하지 않고 물 (T ₆ = 3.22, P <0.05)과 더 많은 시간을 보낸다. 따라서, 대조군 (F _1,7

토론

냄새에 대한 인식, 냄새에 물과 감도 대 냄새 사이의 차별이 프로토콜에서 제안 된 테스트는 마우스의 타고난 후각 행동의 다양한 측면을 평가 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전에 ^15을 도시 선호도 및 회피 스케일에 따라서 임의의 냄새에 적용될 수있다. 프로토콜 탐색 활동을 기반으로하고 있기 때문에 그것은 마우스가 움직임에 영향을주는 후각 탐사 방해 할 수있는 임의의 모터 또?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis